방법 논문

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

DOI:

10.3791/50136

⸱

2013년 5월 29일

 ,  ,  , 
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

이 논문에서

요약

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발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

초록

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병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 - 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.

서론

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후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 4 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 - 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다.

이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일....

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프로토콜

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1. 후뇌의 Electroporation에

1.1 에그 처리

  1. 가습 배양기 (37-38.5 ° C)에서 수평으로 계란을 넣습니다. 배아들은 16-17 (HH) 단계 (25-30 somites)에 도달했을 때, 배양 65 ~ 70 시간 후 electroporation하여 있습니다.
  2. 인큐베이터에서 계란을 제거, 그들은 수평 위치에 남아 있습니다.

1.2 준비

  1. 유리 모세관 (0.5 mm 직경)을 당깁니다.
  2. 펄스 발생기에 어댑터 홀더 구부러진 L-모양의 금 Genetrodes 전극 (3 mm 직경)를 연결합니다. 일렉트로 매개 변수는 25 볼트 5 펄스 수, 45 밀리 초 펄스 길이 300 밀리 초 펄스 간격이 (가) 있습니다.
  3. 입 피펫, 10 ML의 주사기 바늘, 파라 필름 (parafilm) 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25 ML 멸균 PBS 용액을 준비합니다. 이 금액은 일반적으로 계란 트레이 (18 알)을 처리하기에 충분합니다.
  4. DNA 플라스미드의 적절한 혼합 (5 ㎍ / ㎕의 각을)를 준비하고DNA 주사를 시각화하는 0.025 % 빠른 그린 염료에 대해 추....

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결과

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이 프로토콜은 최근 병아리 후뇌 10의 interneurons의 DA1 하위 그룹의 축삭 패턴 및 프로젝션 사이트를 발견하는 데 사용되었다. 특히 이러한 축삭에 레이블을 지정하려면, 이전에 척추 DI1 신경 8,12,13 특정으로 특징 된 증강 요소 (Atoh1은), 후뇌 DA1 세포를 10으로 표현할 수 있도록이 확인했습니다. 요소는 크레 재조합 플라스미드 크레 따라 세포질 GFP 기자 (; 그림 1BI pCAGG-LoxP 스톱 LoxP-cGFP)와 함께 E2.75에 공동이 - electroporation하여 상류로 복제되었다. Hindbrains은 평면 마운트 준비로 48 시간 다음의 electroporation을 분석하고 두 콘트라 측면 오름차순 축삭 돌기 패턴 (그림 2A)를 공개했다; 하나의 기관이 독점적 등의 삭조에 길쭉한 것이 6-7 rhombomeres에 위치한 DA1 신경 세포에서 파생 된 반.......

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토론

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비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외부 유전자를 삽입하는 PiggyBac 매개 전위 시스템과 결합됩니다.

병아리 후뇌의 레이블 축삭 / 시냅스 이전에 방법은 라벨 또는 실험에게 21-23를 접목 고전 역행 또는 선행 성 염료를 포함되어 있습니다. 이러한 연구는 후뇌 오름차순와 축삭 책자를 내림차순에 중요한 결과를 기여했다. 그러나 일부 궤적과 예측은 이러한 세포의 방법에 의해 간과되었다. 식용 보의 이온,보고 funiculi에 투사 뉴런의 하위 그룹의 .......

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공개 사항

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없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 일렉트로 일러스트 레이 션에 대 한 박사의 Yuval 고 트립 - 인 Dror 감사합니다. 이 작품은 이스라엘의 정신 생물학에 대한 국립 연구소와 니더 작센 - 이스라엘 연구 협력 프로그램의 DSD에 보조금 및 이스라엘 과학 재단, 보건 이스라​​엘 사역 및 우수성 유산 유산 센터에서 AK로 보조금에 의해 지원되었다 생명 과학 협력.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
L자형 금 Genetrodes 3mm 전극BTX, Harvard Apparatus45-0162
펄스 발생기, ECM 830BTX, Harvard Apparatus45-0002
OCT(최적 절단 온도) 컴파운드티슈-텍 Sakura4583 O.C.T. 컴파운드
매니큐어상업 공급업체
모든 의

참고문헌

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  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y.

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재인쇄 및 허가

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태그

DNAPiggyBac

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