방법 논문

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

DOI:

10.3791/50176

⸱

2013년 3월 1일

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고분자 나노 입자를 사용하여 비 바이러스 성 유전자 전달은 유전 질환 1을 치료하는 유전자 치료에 대한 매력적인 접근 방식으로서 재생 의료 2 기술로 등장했다. 중요한 안전 문제가 바이러스, 달리, 고분자 나노 입자는 더 큰 핵산화물과 생분해 성 및 / 또는 환경 대응을 들고 할 수있는, 화학적으로 다양한, 합성 무독성, 비 immunogenic, 비 mutagenic, 쉽게 할 수 있도록 설계 할 수 있습니다. 양이온 폴리머는 일반적으로 고분자 나노 입자를 칭했다 아르 100 나노 미터의 순서에 복합체를 형성하기 위해 정전기 상호 작용을 통해 부정적인 요금이 부과 DNA와 자기 조립. nanoscale polycationic 유전자 전달 나노 입자를 형성하는 데 사용 biomaterials의 예로는 비 degradable 재고품입니다 polylysine, polyphosphoesters, 폴리 (amidoamines) s와 polyethylenimine (PEI)를 포함 일반적으로 핵산 전달 1,3에 사용되는 양이온 폴리머. 폴리 (베타 - 아미노에스테르) S (PBAEs)는 5,6 hydrolytically degradable이며, 인간의 망막 내피 세포 (HRECs) 7과 같은 어려운 transfect 세포 유형에 대한 유전자 전달에 효율적으로 표시되어 양이온 폴리머 4의 최신 수업 마우스 유방 상피 세포 8, 인간의 뇌 암 세포 9 및 10 macrovascular (인간 배꼽 정맥, HUVECs) 내피 세포.

nanoparticle 추적 분석 (NTA)를 활용 한 고분자 나노 입자를 특성화 할 수있는 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법에서 입자 크기 분포와 입자 당 plasmids의 수 분포 모두 11 얻을 수 있습니다. 또한, 고분자 나노 입자의 transfection 효율의 급속한 진단을위한 높은 처리량 96 - 웰 플레이트 transfection 분석이 제공됩니다. 이 프로토콜에서는 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)이 모델 고분자와 인간 망막 내피 세포 (HRECs)로 사용되는은 MO로 사용됩니다델 인간의 세포. 이 프로토콜은 쉽게 고분자 nanoparticle 및 멀티뿐만 판 형식에 대한 관심의 세포 유형을 평가하도록 구성 할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

nanoparticle 당 complexed plasmids의 수의 결정은 특히 동일한 셀 대상에 대해 여러 plasmids의 공동 제공을위한 효과적인 nanoparticle 기반의 유전자 전달 전략을 설계,하는 것이 중요합니다, 등은 종종 연구 12 재 프로그래밍 줄기 세포에 필요합니다. 하나의 nanoparticle과 관련된 plasmids의 수를 계산하는 몇 가지 방법이 설명, 각 접근 방식은 추정 13-16에 사용되는 기술의 단점을 가지고있다되었습니다. TEM과 결합 양자 점 (QD) 라벨은 키토산 기반의 나노 입자에 입자 당 plasmids를 추정하는 데 사용되었습니다. 캡슐화 라벨이없는 DNA가 직접 감지되지 않는 가능성; 잠재적으로 중복 plasmids과 입자의 2D TEM 이미지에서 QDs,이 QD 기술을 추정 인해 그 자체 조립 속성을 변경할 수있는 DNA를 레이블 할 필요에 복잡하고 다른 단순화 가정 13. 이 대안 접근 방식pplicable 주문 microdomains의 입자에 존재하면 cryo - 전송 전자 현미경 (cryo-TEM), X-선 산란, 및 동적 광 분산 (DL을) 14,15을 통해 Lipopolyamine-DNA 단지를 연구하는 데 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 여기 조사....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 셀 심는

  1. 세포가 overconfluency로 성장하는 것을 허용하지 않습니다. 기본 셀을 transfecting 때 초기 통로 세포를 사용합니다.
  2. transfection하기 전에 24 시간 정도, 세포를 trypsinize hemocytometer를 사용하여 세포 수를 계산하고, 원하는 세포 밀도 (세포 / 볼륨)를 달성하기위한 매체와 세포 현탁액을 희석. 명확한 조직에 종자 세포는 저수지와 다중 채널 피펫을 사용하여 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 문화 취급. 선택한 밀도는 transfection 당일 confluency 70~80%를 제공해야합니다. 표 1에 표시로 예를 들어, 셀은 여기에 표시 transfection 데이터를 25-50 셀 / μl로 희석되었다.

2. 세포 Transfection

  1. 폴리머와 DNA 주식의 희석. 실온 (RT)에서 폴리머와 DNA 주식 솔루션을 해동. 12 채널 피펫을 사용하여 명확 96 - 웰 플레이트에서 별도로 폴리머 주식 솔루션과 DNA 주식 솔루션을 희석, DNA 중량 비율 (중량 / 중량)에 원하는 폴리머 무게를 얻기 위해 필요한 농도에 해당 용매를 갖추고 있습니다. 이 경우, 선택된 용매는 2....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1은 플라스미드 EGFP와 HRECs를 성공적으로 transfection의 예를 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. brightfield 이미지는 세포가 자신의 일반적인 형태를 유지하도록 도움이됩니다. 또한, 이러한 MTS 또는 이와 유사한 assays 같은 세포 생존 능력의 assays은, nanoparticle 독성 7 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 설명 된대로, transfection 효율을 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. HyperCyt 멀티 잘 플레이트 첨부 파일을 사용하는 경우, 데이터가 제대로 우물을 식별하기 위해 적절하게 처리해야합니다. 셀 카운트가 (물론 당 세포의 수천) 좋은, 그리고 fluidics가 제대로 작동하는 경우 그림 2의 오른쪽 패널에서 볼 수 있듯이, 각각의 우물은 모두 수동 및 소프트웨어에 의해 선택하기 쉬워졌습니다. 셀 카운트가 너무 낮은 또는 fluidics에 문제가있을 경우에는,.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 프로토콜 nanoparticle 공법의 transfection 효율뿐만 아니라 입자 크기와 나노 입자의 DNA 로딩을 특성화 할 수있는 방법을 평가하는 방법을 설명합니다. 입자 당 plasmids의 수는 입자의 효과를 예측 할 수 있습니다 중요한 매개 변수이며, 또한 용량 결정에 사용할 수 있습니다. Nanoparticle 추적 분석 등 소금 농도에 차이가있는 등 다양한 수성 솔루션의 범위에서 수행 할 수 있습니다. 종종이 특성은 생리 식염수을 모방하기 위해 PBS에 수행됩니다. PBS에서 크기 조정하는 미디어 또는 생리 식염수에있는 나노 입자의 크기의 좋은 견적을 줄 수 있지만, 혈청 현재의 양이 나노 입자 17의 크기와 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 혈청의 다양한 농도의 입자 특성도 특정 응용 프로그램에 중요 할 수 있습니다. 혈청, additio에서 입자를 특성화하기 위하여NAL 단계는 혈청 단백질의 높은 배경 산란으로 인해 권장합니다. 이 경우 입자 휘황 형광 필터의 사용을 통해,.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 관심의 충돌을보고하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 지원 TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE - 0098-00)와 NIH R21CA152473 감사드립니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
인산염은 1X (PBS)를 식염 버퍼 Invitrogen 10,010
EGM-2MV의 BulletKit Lonza CC-3202
트립신 Invitrogen 25,300
나트륨 아세테이트 버퍼 시그마 - 알드리치 S7899 탈 이온수에 25mM로 희석
디메틸 sulfoxide 시그마 - 알드리치 276855
pEGFP DNA 엘림의 Biopharmaceuticals NA
DsRed DNA Addgene 21,718
PEI, 분기 시그마 - 알드리치 408727
CellTiter 96 수성 하나 Promega G3580
자료
삭제 평면 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 Sarstedt 82.1581.001
삭제 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 Sarstedt 82.1582.001
12 채널 Finnpipette 열 과학 NA 5-50과 50-300 μl
형광 현미경 Zeiss NA 모델 번호 : AX10
C6 Accuri 흐름 cytometer BD Biosciences NA
HyperCyt 첨부 Intellicyt NA
NS500 Nanosight NA

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
  2. Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 ....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Polymeric NanoparticlesGene DeliveryNanoparticle Tracking AnalysisHigh throughput Flow CytometryParticle Size DistributionTransfection EfficiencyHuman Retinal Endothelial CellsPoly beta amino ester sPlasmid Per ParticleBiodegradable Polymers

관련 논문