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방법 논문

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

12.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50181

⸱

2013년 12월 1일

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina

이 논문에서

요약

기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.

초록

방광암은 비뇨 생식 기관 및 재발과 진행이 필요 줄일 수있는 새로운 치료 방법의 두 번째로 가장 흔한 암입니다. 종양 미세 환경은 크게 종양 발달과 치료 반응에 영향을 미칠 수있다. 그것은 그들이 시작된 장기에 종양 세포를 성장하는 것이 종종 바람직하다. 이 프로토콜은 MB49 쥐의 방광 암 세포를 카테터를 통해 방광에 주입되는 방광암의 소성을 모델에 대해 설명합니다. 이 모델이 성공적으로 종양 세포 주입이 물리적 또는 화학적 수단에 의해 달성 될 수있는 글리코 사 미노 글리 칸의 보호 층의 중단을 요구한다. 우리의 프로토콜에서 방광 전에 세포 점안에 트립신 처리됩니다. 방광의 카테터는 또한 종양이 확립되고 나면 치료제를 전달하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 루시 페라 제 리포터 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 구조의 전달을 설명합니다. O 동안UR 프로토콜 단기 연구에 최적화 및 유전자 전달에 초점을 맞추고있다, 마우스 방광 카테터 삽입의 방법은 광범위한 응용 프로그램을하고 있습니다.

서론

방광암 2012 년 1 예상 거의 75,000의 새로운 사례 및 15,000의 죽음과 비뇨 생식기 계통의 두 번째 가장 흔한 암입니다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰이 필요합니다. 근육 층을 침범 방광 암은 림프 시스템을 통해 간, 폐 또는 뼈에 전이 할 수 있습니다. 오년 후 만 20-40% 생존 고급 종양 결과의 복합 치료. 따라서, 표면 방광암의 재발과 진행을 감소뿐만 아니라 고급 질환 환자의 치료 결과를 개선하기위한 효과적인 치료 전략이 절실히 필요합니다.

새로운 치료제의 개발은 초기 체외 평가를 다음과 같은 효능을 평가하는 전임상 모델을 필요로한다. 종양 미세 환경은 크게 preclinic 대한 필요성을 강조하는, 암 발생과 응답에 영향을 미칠 수있다종양이 발생하거나하는 알 모델 출신의 기관에 설립 할 수있다. 한 가지 방법은 종양이 자연적으로 발생하거나 장기 고유하게 유도 될 수있는 트랜스 제닉 모델의 개발이다. 형질 전환 방광암 모델의 우수한 프로토콜은 최근 2를 발표하고있다. 형질 전환 모델의 단점은 종양이 천천히 원하는 것보다 적은 균일 개발하는 경향이있다. 또, 번식지를 유지하는 비용을 고려하여야한다. 트랜스 제닉 모델 대안 시판 마우스에서 종양 확립 짧은 타임 프레임의 이점이 종양 세포의 동 소성 이식이다. 일부 인간 방광암 세포주 orthotopically 성장 될 수 있지만 (우리가 성공적 UM-UC-3 사용한)는 면역 적격 마우스에서 종양을 확립하는 것이 바람직 할 수있다. orthotopically 성장 두 뮤린 방광암 세포주, MBT-2 및 MB49 3이다. MBT-2 세포 복제로 오염되어 있기 때문에C 레트로 바이러스 4를 입력, 우리는 우리의 연구에 MB49 세포를 선택했습니다. 그것은 MB49 세포가 수컷 마우스에서 분리하여 소성을 착상은 암컷 생쥐에서 수행 해부학 이유입니다 된 것을주의하는 것이 중요합니다. 이것은 Y 염색체의 마커에 의해 이식 된 세포를 쉽게 식별의 장점을 가지고 있지만, 성별이 일치 면역 학적 연구를위한 단점이 될 수 있습니다.

방광 상피 세포는 미생물에 의해 감염에 대한 장벽으로 기능하는 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG) 층으로 늘어서있다. 이 장벽은이 어려움 (표 1)을 극복하기 위해 개발 된 종양 세포와 여러 가지 방법의 주입을 방해 할 수있다. 전기 소는 GAG 층 5-13 및 프로토콜을 설명하는 전기 소는 최근 조브 (14)에 게시 된을 방해하는 물리적 수단으로 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 전기 소 장치를 사용할 수 없게한다, 화학 G를 파괴하는 것을 의미한다질산은 또는 폴리-L-라이신 등 AG 층은 15-24 사용될 수있다. 종양은 질산은의 작은 양으로 방광의 짧은 노출에 의해 효과적으로 성립 (5-10 μL, 0.15-1.0 M ~ 10 초) 또는 폴리-L-라이신으로 긴 콘택트 (0.1 ㎎ / ㎖의 100 μL 20 분 동안) (표 1). 여기에서 우리는 MB49 세포의 주입을 용이하게하기 위해 트립신을 사용하는 방법을 설명합니다.

방광암 치료 방법을 개선하기위한 시도에서, 유전자 치료는 상당한 관심을 얻고있다. 보기의 임상 적 관점에서 방광 암으로 인해 쉽게 기관의 접근성 및 로컬 페이로드를 전달하는 기능을 유전자 치료를위한 이상적인 대상입니다. 방광 암 유전자 치료되었습니다 탐험 바이러스 벡터는 콜리 틱 단순 헤르페스 바이러스 25, 레트로 바이러스 26, 카나리 발진 바이러스 27, 우두 바이러스, AAV, 및 adenoviru 마련되어28의. 우리 프로토콜의 두번째 부분에서, 우리는 종양 세포의 점적 거의 동일하다 바이러스 전달하기위한 방법을 설명한다. 우리의 실험실에서 관심을 우리는 루시퍼 라제 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 생물 발광을 통해 평가 유전자 전달에 대한 새로운 접근 방식의 개발이다. 그러나, 방광 카테터 삽입의 방법은 여러 에이전트의 전달에 사용하기 때문에 광범위한 응용이 될 수있다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 검토 된 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 프로토콜은 통증에 대한 USDA 카테고리 D에서 승인되었다.

1. 세포 이식

  1. 이틀 절차를 수행하기 전에, T-25 플라스크에 1 × 10 6 MB49 세포를 접시. (원하는 경우, 항생제) 10 % FBS와 보충 높은 혈당 DMEM을 사용합니다. 한 플라스크 마취 병렬로 주입 될 것이다 최대 5 개의 마우스의 각 그룹에 대해 충분하다.
  2. 프로 시저의 날, 멸균 DMEM의 기본 매체 (1시 2분 희석)와 0.125 %로 멸균 0.25 % 조직 배양 등급 트립신을 희석하여 점안을위한 트립신을 준비합니다. 1.2 ㎖를 10 생쥐에 충분하다. 평형을 37 ° C의 수조에 넣습니다.
  3. 가열 패드를 Prewarm 그리고 난을 전달하는 데 사용되는 마취 시스템의 nosecones 아래에 위치soflurane. 가열 패드에 깨끗한 흡수 패드를 놓습니다.
  4. 마취 시스템의 유도 챔버에 마우스를 놓고 3 % 이소 플루 란으로 마취를 유도한다. 쥐가 발가락 핀치 반사의 손실에 의해 확인 된 의식을 잃은 경우, nosecones로 전송. 각 동물은 앙와위에 적절히 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치 확인.
  5. 마취를 유지하기 위해 2 %에 이소 플루 란의 농도를 줄일 수 있습니다.
  6. 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다.
  7. 선택 단계 : 복부 머리를 제거합니다. 생체 발광 생물 이미징을 수행 할 경우 낮은 복부에 머리를 제거해야합니다.
    1. 외부 성기를 접촉하지 않도록주의하면서 복부에 모피의 광장에서 가장 낮은 1 등 Veet 등의 제모 크림의 관대 한 층을 적용. 3 분을 기다립니다.
    2. 마른 스펀지로 영역을 문질러 머리를 제거하고 피부를 정화 젖은 스폰지를 사용하여. 필요한 경우, 한 번 반복합니다.
  8. 방광에 카테 테르를 꽂다
    1. 이러한 KY 같은 자극적 윤활 젤 새로운 멸균 24 G 소아 정맥 카테터에 기름칠을. 제거하고 바늘을 폐기​​합니다. 카테터 주위 유체의 누수는 일반적인 문제, 즉됩니다. 그것은 큰 내경 카테터 (20 G)를 사용할 수 있으며, 더 자주 열 쥐에서보다 발​​생한다. 이 8 주 이전의 마우스에 중요한 고려 사항이 될 수있다.
    2. 카테터의 중심을 잡고, 마우스의 뒷다리를 확산하고 요도를 노출하기 위해 반대쪽 손의 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용합니다. 조심스럽게 완전히 삽입하는 벤치 하나의 병렬로 각도를 변경, 45 ° 각도로 요도에 카테터를 삽입합니다.
    3. 전체 삽입 후에는 벤치에 평행 유지, 부드럽게 카테터를 들어 올려 시각적으로는 그 아래에있는 요도가 아닌 질에 배치되어 있는지 확인합니다. 올바르게 놓은 경우, 카테터가 될 수있을 것입니다질은 요도보다 짧은 때문에 완전히 삽입 된.
    4. 1 % 이소 플루 란의 농도를 줄일 수 있습니다.
  9. P200의 피펫에 팁을 부착하고 카테터의 외부 끝으로 흡입을 적용하여 방광에서 소변을 제거합니다. 카테터의 중심에 남아있는 소변을 제거합니다. 소변을 취소하고 대신에 카테터를 둡니다.
  10. 조심스럽게 기포를 피하고, 카테터 허브에 80 μL보기 0.125 % 트립신 용액을 피펫. 카테터 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 방광에 트립신을 제공하기 위해 플런저 0.1 ~ 0.2 ㎖의 우울.
  11. 15 분 동안 자리에 주사기와 카테터 어셈블리를 둡니다. 반복 나머지 마취 쥐의 (최대 4)에 대한 1.8-1.11 단계를 반복합니다. 대기 기간 동안 다음 단계로 진행합니다. 힌트 : 처음에는 다른 사람이 셀 (단계 1.12)를 준비해야하는 것이 도움이 될 수있다.
  12. 주입을위한 MB49 세포를 준비합니다. 세포는 T-2 당 1 × 10 6시에 도금했다5 플라스크 48 시간 주입하기 전에 (1.1 단계).
    1. 용지를 제거하고 플라스크에 0.25 % 트립신의 500 μl를 추가합니다. 세포는 세포를 재현 탁하는 완전한 DMEM 5 ㎖를 추가 분리합니다. 카운트 50 μL 나누어지는을 제거하고 5 분 동안 1,000 rpm에서 나머지 부분을 원심 분리기. 원심 분리 단계에서 단계 1.12.2 및 1.12.3를 계속합니다.
    2. 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 세포 / ml을 계산합니다. 그런 다음 4 × 106 세포 / ml (50 μL 당 2 × 105 세포)에 세포 펠렛을 가지고 필요한 부피를 계산한다.
    3. 원심 분리하여 세포로부터 상등액을 따르고 (단계 1.12.2에서 계산 된) 4 × 106 세포 / ml의 세포를 중단하는 데 필요한 양을 사용 DMEM 기초 배지에서 펠렛을 재현 탁. 상온에서 전지를 보관하십시오.
  13. 방광의 트립신 처리를위한 15 분의 시점에 도달하면, 위치에 카테터를두기 카테터로부터 공기가 채워진 주사기를 분리. 소비 트립신은 정상적인 것LY는 카테터를 통해 역류. 위의 단계 1.9에서와 같이 P200의 피펫과 흡입에 의해 방광에 남아있는 트립신을 제거하고 폐기.
  14. 즉시 카테터의 허브로 MB49 세포 현탁액의 50 μl를 피펫. 카테터의 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 플런저 0.1 ~ 0.2 ML을 눌러서 방광 세포를 제공합니다. 다섯 쥐를 이식하는 네 개의 추가 시간에이 단계까지를 반복합니다. 사용하지 않는 세포를 폐기하십시오.
  15. 장소에 카테터 주사기 어셈블리를 떠나, 세포가 50 분 동안 방광에 거주 할 수 있습니다.
  16. 부드럽게 요도에서 카테터 주사기 어셈블리를 철회. 제로 이소 플루 란의 농도를 설정하고 각 마우스에게 인치 떨어져 가열 패드에 복구하는 노즈콘에서 두 이동합니다.
  17. 마우스는 복원력 반사을 회복했을 때, 케이지로 돌아갑니다.

2. (8 일 세포의 주입 후) 아데노 바이러스의 방광 배달

주의 : 프로토콜의이 부분은 감염원이다 아데노 바이러스를 사용하고 엄격한 BSL2의 지침에 따라 처리해야합니다 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

감염원으로 수행되는 모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었다.

  1. 여덟 일 MB49 세포와 생쥐를 주입 한 후, 혈뇨를 확인합니다. 흡수 흰색 종이 조각에 개별 동물을 들고 부드럽게 용지에 소변 방울을 지워 버리 복부에 키를 누릅니다. 빨간색 분홍색 소변 혈뇨를 나타내고 종양​​이 설정 한 기호입니다. 종양 포획 율은 80 % 이상이고 우수한 기술로 100 %만큼 높을 수있다.
  2. 얼음에 아데노 바이러스 주식을 해동 및 살균, 실내 온도 PBS에서 10 9 PFU/50 μL (2 × 10 10 PFU / ㎖)로 희석.
  3. 위의 단계의 1.3-1.6에서 설명한대로 마우스를 마취.
  4. 단계 1.8에서 설명한대로 마우스를 카테 테르를 꽂다 단계 1.9에서와 같이 소변을 제거
  5. 소변이 제거되면, 즉시 카테터 허브에 바이러스 현탁액 50 μL 피펫. 카테터의 허브에 1 ㎖의 공기 채워진 주사기를 연결하고 천천히 플런저 0.1 ~ 0.2 ML을 눌러서 방광에 바이러스를 전달합니다.
  6. 장소에 카테터 주사기 어셈블리를 떠나, 바이러스가 40 분 동안 방광에 거주 할 수 있습니다.
  7. 부드럽게 요도에서 카테터 주사기 어셈블리를 철회하고, 남아있는 바이러스를 불 활성화하기 위해 10 % 표백제 용액에 버린다.
  8. 제로 이소 플루 란의 농도를 설정하고 각 마우스에게 인치 떨어져 가열 패드에 복구하는 노즈콘에서 두 이동합니다.
  9. 마우스는 복원력 반사을 회복했을 때, 케이지로 돌아갑니다.
  10. 생쥐를 나타내는 마크 케이지는 아데노 바이러스에 주입되었다. 바이러스는 몇 일 동안 케이지 침구에 비춰되고 모든 케이지와 침구해야처리하고 적절하게 소독.

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결과

혈뇨는 200,000 MB49 세포의 주입 후 팔일 이내에 거의 모든 마우스에서 관찰된다. 그림 1에서와 같이 34.7 ± 3.3 밀리그램에서 두 배 이상, 방광의 무게 이상 (범위 31-37 ㎎, N = 4) nontumor 87.5 ± 19.2 mg의 마우스 베어링 (범위 77-120 ㎎, N = 10)에서 마우스의 그 MB49 세포로 이식되었다. 유전자 전달의 측면에서, 우리는 쥐에게 24 시간 결상 바이러스 점안 48 시간 (그림 2) 후보다 더 강한 신호를 생성 한 후 나타났습니다. 아데노 바이러스 전달은 통계 목적으로 그룹 크기를 계획 할 때 고려 (그림 2와 3)해야한다 동물, 사이 매우 변수입니다. 작은 동물 이미징 시스템을 사용할 수없는 경우 루시퍼 라제 유전자의 발현을 측정하는 대안적인 방법은 제거하고 시험 관내 분석 방광을 균일화하는 것이다. IVIS200 작은 동물 Syste의를 사용하여 생체...

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토론

이 프로토콜에 설명 된 기본 방법은 세포의 점안 또는 방광 상피 세포에 로컬 배달을위한 모든 에이전트에 대한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 마우스 방광의 도관이다. 위에 설명 된 특정 프로토콜 단기 연구 (일 ~ 10 일)에 최적화되어 있습니다. 높은 휴대폰 번호로 인해 큰 종양 부담이 더 빠른 종양의 성장 가능성이 동물의 손실을 초래할 것이기 때문에 세포의 정확한 수를 주입하는 것은 매우 중요합니다. 점안 200,000 MB49 세포를 사용하여 과도한 종양 부담에 하루 (14)에 의해 동물의 25 %까지 안락사가 필요할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 마우스에 악영향을 십이일 내 종양 부하의 영향을받지 않습니다. 같은 혼수,별로 정리, 및 / 또는이 모​​델 식욕 과도한 종양 부담의 감소 등의 표준 기준뿐만 아니라 소변을 무능력에 의해 입증된다.

이 프로토콜에 대한 중요한 고려 사항은 물류. 먼저, MB49 세포 rapidl 성장이일 주입하기 전에 Y 도금 만 세포는 점안...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 크리스티나 VOELKEL 존슨에 NIH R21 CA143505에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글

시약 이름 < / p>

회사

카탈로그 번호 < / p>

Comments< / p>

6-8 주 된 암컷 마우스 < / p >

Jackson Laboratories

균주 이름 : C57BL / 6J < / p>

재고 번호 : 000664< / p>

< / p>

Trypsin * < / p >

MediaTech< p>MT25-053-CI

Fisher를 통해 획득

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Fisher를 통해 획득

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 플라스크*

Corning Costar를 통해 획득

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Fisher

MB49 cells

N/A>

Dr. Boehle (참조11 참조)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm을 통해 획득

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Fisher를 통해 획득

제모 크림: Veet

현지 약국

윤활제:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Fisher를 통해 획득

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

병원 약국을 통해 획득

1 ml 슬립 팁 TB 주사기

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; in vivo 사용

Infectious agent that require BSL2 containment

Steady-Glo  Luciferase 분석 시스템

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) 또는 E2550 (10 x 100 ml)

*여러 공급업체를 통해 사용 가능

장비

마취 시스템

E-Z 시스템, Euthanex Corporation

마취 시스템: EZ7000

5포트 마우스 재호흡 장치: EZ109

Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

를 통해 획득 		BMG 랩텍

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

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