Method Article

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

DOI:

10.3791/50197

⸱

February 11th, 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

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우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를 조작

Abstract

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신경 줄기 세포 (NSCs)는 라인 출생 후의 측면 심실하고 뉴런, astrocytes, 그리고 ependymal 세포 1 등 여러 세포 유형에 상승을 제공합니다. 분자 NSC 자기 갱신, 노력에 대한 책임 경로와 차별화를 이해하는 것은 활용 뇌를 수리하고 더 나은 중추 신경계 장애를 이해하는 독특한 가능성에 중요합니다. 포유류의 시스템의 조작에 대한 이전 방법은 전체 동물의 2 단계에서 유전 공학의 시간이 소요 비싼 노력이 필요했습니다. 따라서, 연구의 대부분은 체외 또는 무척추 동물의 NSC 분자의 기능을 살펴 보았다.

여기, 우리는 신생아 subventricular 구역 (SVZ) electroporation로 언급됩니다 신생아 NPCs를 조작 할 수있는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 비슷한 기술은 배아 NSCs을 공부하는 10 년 전 개발 및 cortica에 대한 연구를 도와 왔으며리터 개발 3,4. 최근이는 출생 후의 쥐 forebrain은 5-7 공부 적용되었습니다. 이 기술 SVZ NSCs과 자손의 강력한 라벨의 결과입니다. 따라서, 출생 후의 SVZ electroporation은 포유류의 NSC 유전 공학을위한 비용 및 시간 효율적인 대안을 제공합니다.

Protocol

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이 절차는 예일 IACUC 요구 사항에 따라 수 있습니다. 과학자들은 IACUC 가이드 라인은 자신의 기관 요구 사항에 따라 승인 및 준수되어 있는지 확인해야합니다.

1. 제 1 항. DNA, 솔루션 및 유리 피펫의 준비

  1. 고순도 (OD 280분의 260> 1.80) 높은 농도 (μg / μl> 2.5) 독소가없는 DNA를 생성 할 수 있습니다.
  2. 22 μm 필터를 통해 0.9 % 생리 식염수와 멸균 필터를 준비합니다.
  3. 장소 10cm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브 (OD : 1.5 mm, ID : 1.10 mm) 모델 kanthal 와이어와 PP-830 Narishige PC-10 유리 피펫 풀러에. 70.5에서 한 단계 가중 풀다운 ° C.에 풀러를 설정 원형 집게와 팁을 해제하고 계단 가장자리에 해부 현미경으로 검사한다. 15 분을위한 UV 램프 아래에 베벨 팁과 장소. 당겨 피펫은 팁의 가장자리에서 2mm에서 표시해야합니다.
  4. 무게 / 볼륨 빠른 그린 soluti 0.1 % 준비건조 빠른 그린과 혼합 살균 필터 0.9 % 생리 식염수로 있습니다.

2. 제 2 항. 동물 준비, 유리 피펫 로딩 및 플라스미....

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Results

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트위터 전극의 "탁"운동 (그림 1E) 다음 등쪽의, 등쪽의 측면, 그리고 측면 subventricular 구역과 인접 거의 모든 요골 glia의 라벨에 신생아 subventricular 영역 electroporation 결과이다. 그러나, electroporation은 각 실험의 요구에 맞는하지만 전극을 샅샅이 및 비디오 상세과 같은 특정 위치와 방향을 사용하지 할 수 있습니다. dorsally 현지화 반경 glia 이러한 안감에서 심실의 측면 부분을 다른부터 예를 들어, 하나는 단지 하나의 지역 9,10를 electroporate하기 위해 선택할 수 있습니다. 또한 특이성은 작은 전극을 사용하여 제공 할 수 있습니다.

플라스미드 DNA는 빠르게 첫 3 주 동안 11에서 희석된다. 따라서, 플라스미드 DNA를 사용하여 식별 genomically 수정 전지는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 제한을 회피하기.......

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Discussion

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다음은 세부 신생아 SVZ의 electroporation의 기술, 신속하고 견고 라벨 및 SVZ의 줄기 세포와 자손을 조작 할 수있는 기술을. electroporation 다른 기술에 비해 가지고 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포의 초점 라벨에 따라, 하나는 세포 자율적와 비 세포 자율적 인 효과를 판별 할 수 있습니다. inducible 시스템을 사용하여 둘째, 유전자 조작 한 사전이나 신경 통합 후 효과를 비교할 수 있습니다. 또한, 하나는 loxP 사이트를 포함 plasmids과 CRE 표현 쥐를 electroporating하여 여러 plasmids의 사용을 무시할 수 있습니다. 넷째, 유전자 기자 plasmids은 전​​사 transactivati​​on을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우 전사 활동은 조작 아르 셀로 측정 될 수있다; 하위 지역이 microdissected 때 추가 특이성 소개 할 수 있습니다. 다섯째, 과도 지속적인 확산으로 인해 교통 증폭기 세포의 라벨 및 희석 OF 플라스미드는 th.......

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Disclosures

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저자되도록 할 공개가 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 국방부 (아이디어 개발 상, W81XWH-10-1-0041, AB), CT 줄기 세포 기금 (AB) 및 건강 NRSA 10668225 (DMF)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다. 현재 자료는 부분적으로 코네티컷의 줄기 세포 연구 보조금 프로그램의 코네티컷 주에서 지원 작업에 기반을두고 있습니다. 의 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 코네티컷 코네티컷 또는 중부 표준시 혁신의 주 공공 보건부의 국가의 공식 전망을 대표하지 않습니다 주식회사 funders는 데이터 수집을 연구 설계에 역할을 없었다 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
중형 연마 붕규산 배관 셔터 악기 BF150 - 110-10
듀얼 스테이지 유리 Micropipette 풀러 Narishige PC-10H
빠른 그린 피셔 과학 0521192205
ECM 830 스퀘어 웨이브 펄스 발생기 하버드 장치 45-0052
Tweezertrodes 하버드 장치 45-0488
광섬유 광원 피셔 과학 12-562-36
텅스텐 할로겐램프 우시오 미국, Inc의 1002247
Picospritzer II 파커 악기 052-0312-900

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

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Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

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