배양 세포에서 염색체 준비

요약

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

초록

염색체 (염색체) 분석에 널리 염색체 불안정성의 검출에 사용된다. G-밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 등의 분자 기술에 의해 다음 경우,이 분석은 하나 이상의 염색체를 포함하는 게놈 재 배열 부분의 이익 또는 손실을 포함 수차에 대한 개별 세포를 분석 할 수있는 강력한 기능을 가지고 있습니다. 인간의 염색체 이상이 약 1 160 명당 ^{1, 2,} 모든 유산 60 ~ 80 %가 발생하는 ^3,4, 사산의 10 % ^2,5, 선천성 심장 질환 ⁶ 3-6 %를 개인의 13 % 불임의 경우 ^2, 발달 지연과 출생 결함 ^(7)을 가진 많은 환자에서. 클론 염색체 이상을 관찰 모두 진단 및 예후 중요성 ^8,9이 표시되었습니다로 악성 종양의 세포 유전 학적 분석은 정기적으로, 연구자와 임상의에 의해 사용된다.60, 염색체 분리는 유전자 치료에 대한 소중하고 인간이 아닌 영장류와 설치류 ^10-13를 포함하여 생물의 줄기 세포 연구.

염색체는 혈액 림프구, 피부 섬유 아세포, amniocytes, 태반, 골수, 종양 표본을 포함한 살아있는 조직의 세포로부터 단리 할 수​​있다. 그들이 가장 응축 때문에 더 명확하게 볼 수 있습니다 때 염색체는 유사 분열의 중기 단계에서 분석된다. 염색체 분리 기술의 첫번째 단계는 후속 anaphase 단계로 진행하는 세포를 방지하기 Colcemid 함께 인큐베이션 스핀들 섬유의 파괴를 수반한다. 세포는 그 다음 저장성 용액으로 처리하고 Carnoy의 고착성과의 팽윤 상태로 보존된다. 세포는 그 다음 슬라이드에 떨어 된 후 다양한 절차에 이용 될 수있다. G-밴딩이 특징 빛과 어둠 밴드를 만들 지엠 사 (Giemsa)로 염색 한 다음 트립신 처리를 포함한다. 같은 홍보염색체를 분리 ocedure는 원위치 혼성화 (FISH) 형광, 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 (SKY) ^14,15 같은 절차에 대한 세포의 제조에 사용될 수있다.

서론

염색체 분석은 염색체 불안정성과 유전 질환 및 악성 종양의 ^1,2,8,9로 이어지는 재 배열을 진단하기 위해 전 세계적으로 이용되는 기존의 기술입니다. 또한, 헌법과 암 획득 유전자 이상을 진단 및 연구에 대한 높은 해상도는 형광 제자리 교잡 (FISH)와 같은 고전적인 세포 유전 학적 절차 및 분자 유전 학적 방법의 조합, 비교 게놈 교잡 (CGH)을 달성 할 수 있습니다 그리고 스펙트럼의 핵형 분석 (SKY) ^{14, 15.} 더 최근에, 이러한 기술은 줄기 세포 연구와 관련된 염색체 불안정성의 평가에 이용되어왔다. 이러한 장기 배양 된 배아 세포 (ES)와 다양한 생물의 성체 줄기 세포의 이수성으로 핵형 이상은 여러 실험실에서보고되었다. 최근의 증거는 어떤 세포주가 본질적으로 염색체 instabi하는 경향 것을 지원에 관계없이 배양 조건의 품 질. 확립 및 / 또는 인간, 마우스 또는 히말라야 줄기 세포주를 유지하면 이러한 이유로, 염색체 분석 품질 관리 프로세스의 일부로서 추천. 많은 보고서 배양 ^10-13 줄기 세포 및 악성 세포 또는 다양한 유기체의 염색체 안정성을 모니터링 루틴 세포 유전학 및 분자의 사용에 대한 관심의 증가를 설명한다. 이러한 프로토콜은 점점 그 배양 세포 ^(13)의 급....

프로토콜

1. 자기편 세포의 염색체 수확

1. 표준 프로토콜
   1. 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. 세포가 로그 단계 (80 % 컨 플루)에 도달 한 경우, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. 2 × 10 ⁶ 세포의 최소 권장합니다.
   2. 45 분 동안 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 멸균 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 세포에서 미디어를 전송할 수 있습니다. 옆으로 설정합니다.
   3. 조심스럽게 플라스크에 HBSS 버퍼 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 소용돌이 버퍼링 한 후 피펫을 사용하여 제거합니다. 폐기하십시오.
   4. 이 플라스크의 전체 표면을 커버 것을 보장, 트립신 1 ML을 추가합니다. 약 2 분 동안 트립신의 세포를 둡니다. 세포의 대다수가 분리 한 후에 다시 셀에 원추형 튜브 미디어 피펫.
   5. 15 ML 원뿔 튜브에 10 ㎖ 분량 씩에 세포 현탁액을 전송합니다.10 분 200 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 펠렛을 재현 탁.
   6. 원뿔 튜브에 남아있는 펠릿에 37 ° C에 데워진 된 0.075 M의 KCl 10 ㎖를 추가합니다. 의 KCl....

결과

고품질 중기 스프레드 염색체 분석을 위해 필수적입니다. 성공적인 분석이 잘 확산 적합한 염색체 형태의있다 염색체를 얻을 수 있습니다. 제대로 G-밴드 염색체는 특성 밝은 부분과 어두운 줄무늬 패턴이 포함되어 있습니다.

그림 1. 염색체는 평균 길이가되는 성공적인 염색체 확산, 잘 확산 쉽게 서로 식별 가능하고, 빛과 어둠 밴드 사이에 충분한 대비. 좋은 염색체 형태가 나타내는 모든 재배에 대한 개별 염색체 및 평가의 식별 가능 염색체 불안정.

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토론

우리는 다양한 인간에서 얻은 세포 유형, 붉은 털 원숭이, 쥐, 생쥐 ^11,20-22 등 다양한 생물의 세포에서 염색체 분리를위한 본 절차를 이용했다. 표준 프로토콜은 제공되지만, 특정 주요 단계와 변수는 세포의 이러한 다양한 유형의 조정해야 할 수도 있습니다. 몇몇 특정 단계 염색체 제제 및 결과의 최상의 품질을 보장​​하기 위해 G-밴딩 모두에 중요하다. 분석에 영향을 미칠 수있는 변수 중 하나는 Colcemid 배양 시간입니다. Colcemid의 부족 시간이 적은 중기 확산과 이상, 중복 염색체를 얻을 수 있습니다. Colcemid의 긴 배양 시간을 분석하기 어려운 짧고 두꺼운 염색체가 발생합니다. 또 다른 중요한 변수는 저장성 용액의 몰 농도이다. 0.075 M 염화칼륨 용액은 충분한 세포를 용균없이 확산 적절한 염색체을 수득 세포를 팽창한다. 추가 할 때혼합하면서 Carnoy의 고착성 용액을, 제 5 ml의 펠릿에 첨가되어야한다. 이 여분의 단백질 모두가 샘플을 저장하거나 슬라이드를 준비하기 전에 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS 버퍼	Gibco	24020-117
0.5% 트립신 EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
버퍼 정제 "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
원심분리기 5810	Eppendorf
메탄올	Caledon 실험실 화학 물질	6700130
빙하 아세트산	Krackeler Scientific Inc.	Tel.: 11-9508-05