방법 논문

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

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⸱

DOI:

10.3791/50271

⸱

2013년 4월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다 예 자궁 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.

초록

대뇌 피질의 개발은 뉴런과 전구체 세포, 혈관, meninges 및 관련 세포 외 기질 등의 비 neuronal 요소들 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 그들은 적절한 organotypic 환경을 제공하기 때문에, 대뇌 피질의 슬라이스 explants는 종종 neuronal 차별화 및 개발을 제어 이러한 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다. 이익이지만, 슬라이스 explant 모델은 비정상 세포 적층 및 마이그레이션 등의 단점으로 고생 할 수 있습니다. 여기 대뇌 피질의 조각과 쇼 일관 organotypic 마이그레이션 및 적층보다 준비하는 것이 더 쉽습니다 초기 대뇌 피질의 개발 연구 전체 대뇌 반구의 explant 시스템을보고합니다. 이 모델 시스템에서 초기 적층 및 마이그레이션 패턴, preplate 분할의 기간을 포함하여, 체외에서 2 일 동안 일반적으로 미래의 대뇌 피질 층 중 여섯 양식을 진행합니다. 우리는 전 자궁의 electroporation (EUEP)를 개발등쪽 내측 피질에서 개발 뉴런에 GFP 표현을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성 접근.

전체 반구의 explant 모델은 electroporation, 약리 개입 및 라이브 영상 방식의 접근이 초기 대뇌 피질의 개발을합니다. 이 방법은 transfection 및 면적 타겟 일관성을 모두 개선하면서 자궁 electroporation (IUEP) 접근 방식에서 요구 생존 수술을 방지합니다. 이 방법은 neuronal 확산, 이전과 차별화의 실험 연구를 촉진합니다.

서론

연속 생성 뉴런의 공동 확산, 이전과 차별화를 통해 포유류의 대뇌 피질 양식. 각 신경 세포는 심실 구역 (VZ)에서 태어나 대뇌 피질 판 (CP) 1을 형성 중간 영역 (IZ)로 VZ에서 마이그레이션합니다.합니다 그들은 다른 대뇌 피질의 도메인을 통과으로, 마이그레이션 뉴런은 개발 조직 내의 세포 환경 및 기타 휴대 요소 (예 : 반경 glia)에 따라 마이그레이션 2,3의 여러 모드를 표시합니다. 대뇌 피질의 뉴런는 neuronal 마이그레이션 체포와 dendritogenesis (4)의 일치 과정에있는 성형 대뇌 피질 판의 상단에있는 마이그레이션을 체포.

대뇌 피질의 개발은 배아 일 원시 plexiform 계층 6 preplate (PP), 그 overlies VZ 선구자 뉴런의 층의 설립을 통해 11-13 (E11-13) 5 사이에 시작됩니다. 예기되는그런 다음 레이어 6 대뇌 피질의 뉴런 (VZ에서 태어난 즉, 첫 번째 대뇌 피질의 뉴런) 방향이 틀에 박힌 패턴의 somata와 PP 7 ~ 뚜렷한 층으로 뭉쳤다. 이러한 이벤트는 얕은 한계 (미래 대뇌 피질의 레이어 1)과 깊은 구역, subplate 세포 (과도 대뇌 피질의 레이어 7)로 구성 후자에 preplate를 나누었습니다. 이 과정은, preplate 분할이라고한다, 대뇌 피질 (8)의 미래 성장의 기초 행사입니다.

많은 유전자 변이는 대뇌 피질의 발달 9의 다양한 측면을 방해하는 확인되었습니다. 대뇌 피질의 개발은 또한 부정적인 등 코카인 10 술 11 등의 섭취 독소에 노출에 의해 영향을 수 있습니다. 개발하는 동안 발생하는 대뇌 피질의 기형은 신경 장애 (예 : 자폐증, 정신 분열증)에 가능성이 참여자 때문에, 대뇌 피질의 발달에 섭동의 경험적 조사는 고유 아르중요한 그겁니다. 그것은 유전이나 독소 효과의 빠른 assays을 허용뿐만 아니라 두뇌 개발 12이 초기 기간 동안 차별화 뉴런, 다른 세포 유형과 세포 외 기질 (ECM) 사이의 가능한 상호 작용을 보존 그 대뇌 피질의 개발을 공부하는 방법을 설정하는 데 상당한 중요성을 따라서입니다 .

슬라이스 explants 13 이러한 시스템을 제공하고 광범위하게 분석 대뇌 피질의 신경 세포 개발에 14-16로 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 assays는 neuronal 마이그레이션 및 적층이 가능 개발 뇌와 앵커 반경 glial 비계를 둘러싼 수막 세포에 손상으로 인해 17 이상이 될 수있는 단점으로 고생 할 수 있습니다. 레이디 얼 glial 섬유가 썰기하여 기저 얇은 판의 대뇌 피질의 신경 세포 이주 18 혼란의 중요한 기판 있으므로 로컬 반경 glial 아키텍처를 중단시키고 변경된 대뇌 피질의 마이그레이션 될 수 있습니다. 또한 SLI에게의explants의 ced 표면이 분야에서 ECM의 일반적인 구성을 변경할 수 있습니다 죽은 세포의 영역을 제공합니다.

최근 접근법은 적절한 건강 셀 유형 및 ECM으로 둘러싸여있는 통에 깊숙히 자리 세포에 자신의 분석을 집중하고 있습니다. 그러나 경우에 이러한 새로운 접근법은 슬라이스의 비교적 정상적인 내부는 분석 19-21에 사용할 수 있습니다 있도록 원래의 두꺼운 교양 슬라이스 고정 후 cryo-sectioned 또는 파라핀-sectioned 할 것을 요구 할 수 있습니다. 문화뿐만 아니라 분석을위한 고정 슬라이스의 후속 cryosectioning의 라이브 조각을 준비하는 sectioning 원래 vibratome 모두는 이러한 assays에 대한 관심과 노력이 작동해야합니다.

초기 대뇌 피질의 개발 연구 간단한 보완 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 촉진하기 위해 기존 슬라이스 방식이 13으로 바뀌 었습니다. 우리는 대체를 개발65분 당 회전하고 16-18 시간 22,23에 대한 허용 organotypic 성장에 떨고 문화를 포함하여 기존 E14 전체 반구의 모델과 비슷한 OLE 반구의 explant 모델입니다. 우리의 접근 방식에 전체 반구의 explants은 48 시간에 organotypic 대뇌 피질의 성장을 확장하는 높은 산소 문화 분위기 21,24에서와 반 투과성 막 13에 표시됩니다. 이 방법은 또한 대뇌 피질의 뉴런을 개발 일관된 electroporation 할 수 있습니다. 태아는 자궁에서 제거 플라스미드 DNA를 소개 electroporated과 telencephalon 그 다음 해부되어 있습니다. 각 반구의 고립과 콜라겐 코팅 필터 안쪽면을 아래로 배치됩니다. explant 그런 다음 48 시간, preplate 분할 8 포함 기간 동안 배양하고 있습니다. 문화 기간 동안 L6 뉴런은 대뇌 피질 판에서 올바른 위치에 차별화 된 뉴런 25 일에 구체에서 개발할 수 있습니다. 이 기간 개발 전반에 걸쳐신경 세포는 생체의 해당 셀을 직면 것이다 적절한 ECM과 세포 유형으로 둘러싸여 있습니다. 이 시스템은 이미 에탄올 독성 26 층 6 형성과 preplate 분할 7,25를 기초 세포 사건을 해독에서 중요한 입증했다.

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프로토콜

플라스미드 녹색 형광 단백질 표현 1. 예를 자궁에 Electroporations

  1. 플라스미드 DNA 주입 솔루션은 ddH 2 O.에서 0.33 MG / ML의 최종 작업 농도로 희석 편대의 편대장-eGFP DNA 27와 함께 준비가되어 있습니다 Qiagen 엔도 - 무료 맥시 - 최상의 상태로 준비가 변형 박테리아의 플라스미드를 정화하는 데 사용됩니다. ~ 0.02 % (w / V 최종)에서 고속 녹색 염료는 주입 추적과 DNA 솔루션에 추가됩니다.
  2. 외과 영역을 준비하려면 70 % 에탄올 솔루션으로 벤치 상단과 해부 현미경 단계를 스프레이 건조 닦으십시오. 이전 해부 70 %의 에탄올과 수술 가위와 집게를 뿌려서 건조 닦으십시오.
  3. 모든 운동은 적어도 1 분 동안 중단 될 때까지 시간이 초과되었습니다 임산부 스위스 / 웹스터 댐은 가압 실린더에서 CO 2로 가득하고 댐이 모니터링되는 챔버 내로 송금 E13에 희생되어 있습니다. CO 2 흡입에 의해 희생 한 후에 태아는 자궁에서 제거하고에 배치10cm 페트리 접시가 포함 된 얼음 차가운 행크스 균형 잡힌 생리 식염수 (HBSS).
  4. 조심스럽게 주변 extraembryonic 멤브레인의 각 배아를 해부하고 얼음처럼 차가운 HBSS에 유의하시기 바랍니다.
  5. 차가운 HBSS를 포함하는 두 번째 10cm 페트리 접시에 각각 배아를 전송합니다. 향후 분석을 위해 대뇌 피질의 지역에서 spatially 별도의 대뇌 피질의 영역에 주입 관리하고, 왼쪽 대뇌 반구의 심실에 DNA 빠른 녹색 혼합물로부터 2-3 μl를 삽입하기 위해 해밀턴 주사기를 사용하십시오.
  6. electroporate하려면, 포셉으로 부드럽게 배를 잡고 가볍게 머리의 등 중간 선에 트위터 전극의 긍정적 인 패들 넣고 가볍게 배아 턱 아래에있는 부정적인 패들 놓습니다. Electroporations는 950 밀리 초 간격으로 구분 된 50 밀리 초 기간 다섯 30 V 펄스를 제공하는 프로그램 BTX830 electroporator으로 달성된다. 이러한 설정은 BTX830 모델입니다. 다른 시스템은 제조업체의 instructio에 따라 사용할 수 있습니다NS.

2. 전체 반구의 Explant 준비

  1. electroporation 후 배아는 얼음처럼 차가운 HBSS에 다시 배치됩니다. 뇌는 배아의 머리에서 피부와 연골 성의 두개골을 제거하는 두 # 5 보석의 집게를 사용하여 제거됩니다. forcep는 다음 두개골에서 그대로 뇌를 제거하는 뇌 아래에 하락하고 있습니다. electroporated 반구는 (왼쪽)가 뇌에서 떨어져 해부되고 첨부 된 중간 뇌 조직은 제거됩니다. 분해 절차 관리를 통해 왼쪽 대뇌 피질 반구를 놓인 meninges을 손상하지 않도록 이루어집니다.
  2. 일단 각 배아는 절단 한 ML 피펫 팁과 pipettor를 사용하여 HBSS에 전송됩니다 해부 했어요. 반구는 부드럽게 콜라겐 코팅 문화 삽입에 퇴학하고 있습니다. 최대 6 개의 반구의 explants에 각 24mm 삽입에 안쪽면을 아래로 배열된다. 일단 배치, 초과 HBSS는 삽입에서 제거되고 삽입 나서 잘 6 잘 요리 중 하나가 35mm에 배치됩니다. 잘은 EXA가 포함되어 있습니다미디어 ctly 2.7 ML : DMEM-F12 미디어 Glutamax을 포함하고있는 2 % B-27, 1 % G5와 1% 페니실린 - 패 혈성 보충. 잘에서 미디어의 몇 방울은 각 explant의 상단에 pipetted 수 있지만 잘 따라 원래의 2.7 ML를 초과 미디어를 추가하지 않습니다.
  3. explants가 콜라겐 필터에 배치 한 후 explants를 포함하는 6도 요리는 Billups 로텐 버그 (BR) 챔버 (또한 물을 증발 접시를 포함)에 배치됩니다. 95 % / 5 %의 산소 / CO 2 가스 혼합물은 챔버 시스템 종료를 밀폐하고 95 % / 5 % 산소 / CO 2 가스 공급 튜브를 분리하기 전에 적어도 1 분 동안 챔버 내로 주입된다. BR 챔버는 다음 문화 시대, 1-2 DIV의 나머지 부분에 대해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다.

3. 조직학에 대한 Explant 조직의 고정

  1. 연기 후드에 preheated (~ 80 & 드의 100 ML에 paraformaldehyde의 첫 solubilizing 8g하여 Pagano 고정 솔루션을 준비g, C) ddH 2 O. NaOH는 solubilization을 홍보하고 부드럽게 저어하는 집중 1-3 방울을 추가합니다. 일단 500 밀리미터 자당, 100 밀리미터 Hepes, 산도 7.4, 50 MM MgCl 2, 250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes의 4 % paraformaldehyde의 최종 농도 5 밀리미터 KCl이 그 솔루션을 8 % paraformaldehyde 솔루션 1:1 혼합 solubilized , 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4.
  2. explants이 37 ° C.에 Pagano 수정 솔루션을 따뜻하게 해결하려면 신속하게 잘 각 문화에서 DMEM/F12 미디어의 대부분을 제거하고 explants의 각 잘에 Pagano의 수정의 5 ML을 추가합니다. 수정에 완전히 각 explant를 커버해야합니다. RT에서 1 시간 수정. 이전 고정 1 시간에 필터에서 explants를 제거하지 마십시오.
  3. 고정은 Pagano 수정 솔루션을 제거하고 수정없이 Pagano 솔루션 (250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes, 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4)로 교체 한 후. 삽입 될 때까지 4에 10 %의 나트륨 azide 및 매장 ° C의 몇 방울을 추가합니다.

4. 삽입 및 S조직학에 대한 ectioning

  1. 따뜻한 물 (55-60 ° C)의 100 ML에 종아리 피부 젤라틴 10g을 solubilizing하여 10 % 송아지 가죽 젤라틴 솔루션을 준비합니다. solubilized까지 ° C와 소용돌이 정기적으로 60로 설정 핫 플레이트에 젤라틴 용액을 넣습니다.
  2. 10cm 페트리 접시의 바닥에 10 % 젤라틴 용액의 약 10 ML을 넣어 30 분 더욱 강화 할 수 있습니다. 이 explants를 삽입하기위한 "패드"를 형성합니다. 이 패드는 사전에 준비 일이, 4 ° C.에 저장 할 수 있습니다 페트리 접시의 바닥에 격자를 이끌어 그리드의 각 상자에 개별 explants를 전송하는 통치자를 사용합니다. 잔여 Pagano 솔루션을 제거하고 pipettor를 사용하여, 따뜻한 10% 젤라틴 솔루션으로 각 explant를 커버하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 각 explant이 완전히 너무 한 번에 젤라틴 따뜻하게을 추가로 패드를 용해하지 돌보는, 젤라틴으로 둘러싸여 될 때까지 젤라틴 솔루션의 느린 또한을 다시 시작합니다. ~ 1 시간에 굳어 젤라틴을 위해 수 있습니다. 일단 individ 찼어, 무슨 일을 explants는 젤라틴의 작은 단위로 잘라 수 있습니다. 블록이 다음 사전 vibratome으로 sectioning에 24-48 시간에 대한 해결 Pagano에 게시 - 해결됩니다.
  3. 젤라틴 블록에서 Explants는 후각 망울을 위치 100 μm 두께의 코로나 비행기에서 sectioned 있습니다. 섹션 수집 및 저장됩니다 PBS 4시 + 0.1 % 나트륨 azide ° C immunohistochemical 처리까지.
  4. Immunohistochemical 감지가 24 잘 플레이트 (물론 당 2 ~ 3 개의 섹션)로 섹션을 전송하여 수행됩니다. 첫 번째 블록이 아닌 특정 항체 0.5 ML PBST를 추가하여 바인딩 + B 완만 한 진동 각 잘 길러 1 시간에 (PBS + 0.5 % 트리톤 X 100 2퍼센트 BSA). 적절한 기본 항체 그런 다음 PBST + B에 희석되어 잘 당 0.4 ML은 RT에서 하룻밤 배양에 추가됩니다. 기본은 3 배 PBS은 적어도 10 분마다 씻어 함께 씻어 수 있습니다. 차 항체와 2 μg / ML Hoechst 33342 얼룩 핵 그 다음 PBST + B에 희석되고 샘플은 RT에서 2 시간에 incubated 아르부드러운 진동과. 세 PBS 세차 (10 분마다)가 수행 된 다음 섹션은 90% 글리세롤 50 ㎜ 트리스, pH7.4, 장착 미디어를 사용 슬라이드에 장착되어 있습니다.

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결과

배아 쥐 대뇌 피질의 발달 기간에 걸쳐 가로 neurogenetic 기울기를 전시 등 그 옆 네크로는 등쪽 내측 네크로 28 약 1 하루가 발전되어 있습니다. 레이어 6 뉴런의 일괄 따라서 측면 피질에 E12에 (또한 필드 40 5이라고도 함)과 E13의 등쪽 내측 피질 (또한 필드 1 5이라고도 함)에 (S-단계의 마지막을 전시 IE) 생성됩니다. Preplate 분류 레이어 6 신경 세포 생성 후 약 1 일 시작하므로 E13의 측면 피질과 E14의 등쪽 피질에서 시작됩니다. preplate 분할 및 대뇌 피질 판 개발의 개시를 연구하기 위해, 우리는 슬라이스 explant 분석 21,24으로 바뀌 었 전체 대뇌는 E13에서 E15 (그림 1)에 일반적으로 배양 된 있도록.

우리는 전체 반구의 explants D의 성장을 조사하여 대뇌 피질의 expl...

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토론

우리는 개선하고 실험 모델을 평가 한 - 전체 반구의 explants - 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 (E13-E15). 모델은 대뇌 피질 25,37의 레이어 6 구성 흥분성의 신경 세포의 계보 (Lineage)의 이전과 차별화의 분석에 유용 입증되었습니다. 시스템의 주요 장점은 준비 간단하고, 뇌 발달의 초기, 중요한 기간 동안의 electroporation, 약리 조작 및 이미징을위한 뉴런 3) 실험 접속) 2) DIV에 대한 organotypic 성장, 2 1입니다. 우리는 형태, 방향 및 preplate 분할 기간 동안 층 6 대뇌 피질의 뉴런 7,38의 수지상 성장의 미묘한 차이를 문서화하는 시스템을 사용했습니다.

레이어 6을 입력 흥분성의 뉴런은 크게 등쪽 시상 39,40에 상호 입력을 제공 corticothalamic 프로젝션 뉴런으로 구성되어있다 와 피질 41 신경 ...

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공개 사항

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 NINDS (NS066071)과 NIAAA의 보조금을 지원했다. (P50AA017823) ECO합니다. 저자는 박사 로버트 퀸과 동물 보호를위한 실험실 동물 자원학과에서 직원을 감사드립니다. 우리는 여름 학부 연구원 (서핑) 등 지원, 기술 지원 니콜 Belletier을 저드슨 벨몬트 감사드립니다. 우리는 또한 의견 박사 데이비드 카메론 감사하고 원고의 이전 버전에 수정할 수 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAXGIBCO10565
G5 Supplement 100XInvitrogen17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50XInvitrogen1504-044
Pen / Strep Liquid 100XInvitrogen15140-122
HBSS 500 mlGIBCO14025
문화 삽입 콜라겐 코팅 Costar3492
소 가죽 젤라틴 시그마G9382
H– chst 33342InvitrogenH1399
소 혈청 알부민시그마7906
EndoFree 플라스미드 맥시 키트Qiagen12362
Equipment
BTX 830 ElectroporatorHarvard Apparatus450052
핀셋 전극 10mmHarvard Apparatus450166
인큐베이터Billups RothenbergMIC-101
해밀턴 주사기 (5uL)Hamilton87930
해밀턴 주사기 바늘Hamilton7803-041" 및 스타일 4
지정 Dumont #5 집게FST11251-10
파인 가위 터프 컷 9cmFST14058-09

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