대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

요약

대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)는 형광 이미징에 의해 세포 내 칼슘 저장소 역학의 분석을 지원합니다. 방법은 합성 낮은 친화력 CA의 로컬 폭로을 향상 소포체 (ER)로 재조합 Carboxylesterase의 대상에 기지 ^{2 +에 표시 염료.}

초록

칼슘 역학의 시각화 세포 생리학에서 칼슘의 역할을 이해하는 것이 중요합니다. 칼슘 역학을 조사하기 위해, 합성 형광 칼슘 ^{2 +의} indictors가 인기를 끌고있다. 여기에 우리가 TED (= 대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드), ^칼슘의 방출을 개선하는 방법을 보여 ⁺ 다른 세포 유형의 ER 루멘의 표시기 염료. 지금까지 TED는 세포 라인, glial 세포 및 생체 뉴런에 사용되었다. 벡터 구조를 사용하여 ER 루멘에 높은 carboxylesterase 활동의 대상으로 효율적인 재조합에 TED 기지가 표현 Carboxylesterases (CES). 최근 TED 벡터 따라서 동시에 두 색 이미징을 가능하게 빨간색 형광 단백질에 융합 CES2의 핵심 요소가 포함되어 있습니다. 해당 ER 구조가 빨간색으로 표시되는 동안 ER 무료 칼슘의 역학은 하나의 색상에서 몇 군데 있습니다. 프로 시저의 시작 부분에서, 세포 렌티 바이러스로 형질 있습니다. 그 후, 감염된 세포다시 마지막 라이브 셀 이미징을 사용하는 coverslips를에 놓는. 그런 다음, 살아있는 세포가 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM-에스테르) 낮은 친화력 ^칼슘의 형태로 배양하는 ⁺ 지표, 예를 들어 Fluo5N-AM, 매기 - Fluo4-AM, 또는 매기 - Fura2-AM. 칼슘 ^{2 +} 지표 및 친수성 형광 염료 / CA ^{2 +} 복합 AM 양식에서 소수성 측쇄 오프 응급실 클리브의 에스테르 가수 분해 효소 활동이 형성된 ER 루멘에 갇혀있다. 염료로드 후, 세포는 거꾸로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 분석됩니다. 세포는 지속적으로 벨소리와 같은 솔루션을 관류와 ER의 칼슘 역학 시간 경과 영상으로 직접 시각화 수 있습니다. ER의 칼슘 저장소의 보충이 형광 강도의 증가를 생산하는 반면, ER에서 칼슘 방출은 관심 영역에서 형광 강도의 감소에 의해 식별됩니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화는 ΔF / F _0의 계산에 의해 결정됩니다.

서론

ER의 생리적 칼슘 반응을 해결하기 위해, 우리는 ER로 합성 칼슘에 민감한 염료의 트래핑을 개선하기 위해 새로운 전략을 개발했다. 이 방법은 세포 외 칼슘의 면전에서 무료 ER 칼슘의 직접, 무중단 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.

ER 칼슘의 기능 및 신호

칼슘 신호는 다른 세포 유형, 예를 들면 근육 세포, 뉴런과 학습과 기억 ^1,2에서 시냅스 전달에 관여로 근육 수축을 중재에서 glial 세포와 그 기능 범위에 있습니다. 칼슘은 유전자 전사, 세포 증식, 신경 흥분, 세포 죽음 및 이벤트 ^1-7 신호를 다른 세포의 조절에 관여되어 있기 때문에 무료로 칼슘 농도의 변화는 높은 과학적 관심이다. 이러한 모든 세포 칼슘 신호는 기능적으로 연결되어 있고 칼슘을 세포 내에 기여하는매장 역학 ^8-10.

모든 칼슘 신호 사이의 일반적인 기능은 세포 공간과 칼슘의 흐름, 세포질 및 세포 소기관, 주로 ER 및 미토콘드리아이다. 이 서로 다른 신호 구성 요소에 의해 감지되는 이러한 세포 소기관 내 칼슘 농도의 동적 변경을 발생합니다. 일반적으로 100-800 μM 사이 ER 범위에서 칼슘 농도가 세포질에 칼슘 농도에 가까운 100 nm의, 그리고 세포 공간에 농도가 1 ~ 2 밀리미터 정도입니다. 따라서, 세포질 ^2,9,10으로 칼슘의 흐름에 대한 높은 화학 원동력이있다.

가장 일반적으로 조사 ER-파생 된 칼슘 신호는 포스 C (PLC)를 활성화 G-단백질 결합 수용체 (GPCR)의 자극에 따라 달라집니다. 차례 PLC는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate (IP ₃₎ ^1을 생산하고 있습니다. 그 REC에 IP _3의 바인딩에 따라eptor이 (IP ₃ 녹화, 그림 1) ER 막에 칼슘 이온은 ER 루멘에서 해제됩니다. 역사적으로, ER에서 IP ₃ 매개 칼슘 방출은 처음 - 비록 간접적 - Streb 등으로 포상 췌장 세포에서 측정 된 1983 ^{십일인치.} 이 책은 처음으로 제안 아세틸 콜린, 포스 C 및 IP _3를 포함하는 신호 폭포. 칼슘 방출이 방법은 일반적으로 IP _3에 의한 칼슘 방출 (IiCR) (그림 1)이라고합니다. 수용체 tyrosin 키나제 링크 IP ₃ 높이 ¹² 후 신호 ER의 칼슘 성장 인자와 신경 성장 인자의 작용에 의해 포스의 Cγ의 키나제에 의존 활성화. IiCR뿐만 아니라, 칼슘 상승은 ryanodine 재에 의해 전압 게이트 칼슘 채널 (칼슘 _V), 및 후속 칼슘에 의한 칼슘 방출 (CiCR)를 통해 예를 들어, ionotropic 칼슘 항목에 의해 중재 될 수있다ceptors (RYR). IiCR 및 CiCR은 생리 학적으로 매장 운영 칼슘 항목 (SOCE)에 연결되어 있습니다. SOCE는 ER의 칼슘 릴리스에 대한 센서 STIM (기질의 상호 작용 분자)의 활동을 포함한다. STIM은 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 (Trp의) ¹³ Orai 칼슘 채널 ^14도 전압 게이트 칼슘 채널 ¹⁵ (그림 1)를 통해 세포 칼슘 항목을 자극하기 위해 표시되었습니다. ER 칼슘의 손실은 동적 적극적으로 펌프 칼슘 다시 ER로 사코 - 소포체 칼슘 ATPase의 (SERCA)의 작용에 의해 구출된다. 같은 쌥시 가르 긴 등의 약물 SERCA를 차단하면 세포질 구획 ER 칼슘의 지속적인 손실을 발표했다. 이 ER 칼슘 "누수"은 Sec61 단백질 복합체 ^16,17 (그림 1) 응급실 intramembrane 기공 복합체에 의해 발생합니다.

1998 년 Berridge는 모델, "신경 세포 모델에서 신경", 어느 것이를 발표H는 신경 세포의 칼슘는 ⁵ 통합에서 ER의 원리 생리적 역할을 제안합니다. 이 모델은 신경 세포막 ^5의 세포 내 "이미지"를 형성하는 연속 ER 막 시스템의 존재를 고려합니다. 이 바이너리 진핵 세포 멤브레인 시스템은 뉴런 빠르고 느린 칼슘 신호의 시간적 및 공간적 통합을위한 기본 전제 조건으로 주장했다. 같은 신경 세포의 다른 쪽이 나 돌기의 병용 또는 이후에 하나 발생할 칼슘 신호는 세포의 세포체 또는 그들이 ^5-18을 표현하는 ER을 통해 핵을 수여한다. 그런 다음, 그 합은 신호 폭포의 유전자 전사 또는 통합의 신경 규제의 흥분에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, ER 칼슘 신호의 통합을 지원합니다. 이 개념에 대한 하나의 전제 조건은 여러 연구에 의해 주장되었으며 적어도 somato-D에 대한 입증 된 어느 하나의 세포에서 ER의 연속성이다endritic 지역과 가까운 거리에 축삭 돌기 ^19-21. 긴 축삭 돌기에서 ER 연속성이 있는지 여부는 논쟁의 문제입니다.

ER 막에 무료로 칼슘의 흐름을 측정하는 전략

칼슘 신호는 가장 자주 세포질 ^22,23으로 모니터링됩니다. 따라서, 그것은 쉽게 칼슘 ^{2 +} 세포에서 또는 ^6,24 세포 내 상점에서 세포질로 유입 여부를 구별 할 수 없습니다. 이 제한을 극복하기 위해, 직접 ER의 칼슘 이미징을위한 방법 론적 전략이 개발되었다. 요약하면, 다음과 같은 전략이 사용됩니다. (1) 유전자 조작 단백질 지표 ^25-27 단백질 기반의 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표 칼슘 감지 단백질과 결합 된 발광 단백질 aequorin 또는 GFP를 사용하여 ER-대상. 이러한 유전자 조작 칼슘 ^{2 +} 지표 (GECIs)는 수신호 펩타이드의 도움으로 응급실을 대상으로 적극적으로 보존 및 검색 모티브를 사용하여 ER에 보관됩니다. 카멜레온 분할 YC7.3ER ^29, 그리고 카멜레온의 D1 ^30, 그리고 카멜레온 원리에 대한 일반적인 ER 칼슘 ^{2 +} 지표베이스는 카멜레온 YC4.3 ^{26,28입니다.} AM-에스테르 낮은 친화력 칼슘 ² (2) 직접 에스테르 가수 분해 효소 기반의 염료 로딩 ⁺ 지표 ^31,32가. 표시기 염료 (크기 - Fura2-AM, 매기 - Fluo4-AM 또는 Fluo5N-AM) 파생 오전을 통과 친 유성, 칼슘 구분 상태에서 생체막. 그런 다음, 세포질뿐 아니라 ER에서, 내생 에스 테라 AM-에스테르 그룹의 다니엘과 세포질에 적극적으로 염료의 일정 금액 뒤에와 ER에두고, 칼슘 ^{2 +} 표시를 놓습니다. 세포질 칼슘 농도가 잘 드 아래에 남아 그러므로,이 방법은 오래 ER에서 높은 칼슘 농도 조건에서 유용하다특히 특징적인 칼슘 신호 (낮은 μM로 예를 들면 NM) 동안 낮은 선호도 지표의 방호 한계. 플라즈마 멤브레인 permeabilization ^32와 함께 (3) AM-에스테르 로딩. 모든 나머지 세포질 칼슘 ^{2 +} 표시는 인공 세포 버퍼에 "중성"세제 (예 : 사포닌)의 소량의 플라즈마 멤브레인 permeabilization에 의해 제거됩니다. 따라서, 세포 세포막에 직접 세포막의 "구멍"을 통해 세포 버퍼에 IP _3에 예를 들어, 자극 할 수있다. (4) ^칼슘의 전체 셀 구성 및 동시 측정에 따라 세포질의 투석 ⁺ ER 루멘 및 세포질 ^32,33 인치 세포가 먼저 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표 (예를 들어 크기 - Fura2 - 함께로드됩니다 AM), 비례 UV 빛. 그 후, 패치 피펫, 남아있는 CYT의 도움으로osolic 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표는 높은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표 (예를 들면 플루오-3, 가시 광선)를 포함하는 버퍼 세포질에서 dialysed 있습니다. 이 전략은 세포질과 ER 유도 신호의 동시 녹음을 할 수 있습니다. (5) 대상 - 에스테르 가수 분해 효소에 의한 염료 로딩 ^8,34. Carboxylesterase은 (CES) ER의 내강을 대상으로 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표 AM-에스테르 형태로 효율적으로 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동을 제공합니다.

대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)

ER 루멘 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표를 대상으로 개선하기 위해 TED가 개발되었다. TED는 식 구조를 통해 달성된다 ER 대상 마우스 carboxylesterase (CES2) (그림 2)의 발현을 필요로한다. 재조합 CES-구조를 표현 세포에서 칼슘의 AM-에스테르 양식을 배양하는식일 염료 (Fluo5N-AM, 그림 2). 그런 다음, ER에서, 염료 칼슘 ^2로 변환 ⁺ 민감한 막 투과성 ^칼슘 따라서 ER 루멘 ⁸ 높은 농도에서 염료를 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동에 의해 ⁺ 표시 복잡 (Fluo5N/Ca ^{2 +), 34.} 방법은 SERCA ^17의 봉쇄 한 후 예를 들어 직접 "누설 채널"을 통해 대사성, 퓨린 또는 글루타민산 염 수용체 ^8,34를 통해 인스턴스에 대한 IiCR - 경로를 통해 ER 칼슘 방출을 조사하고, ER의 칼슘 고갈을 시각화하는 것이 특히 유용합니다 ^34. 우리의 경험에 낮은 친화력 칼슘 ^{2 +} 지표 Fluo5N-AM 현재 TED 염료로드 전략을 사용하는 가장 좋은 가능한 지표입니다. Fluo5N-AM은 칼슘 ^{2 +에} 대한 낮은 친화력이 (해리 상수 K _D ~ 90 μM, 그림 2), 거의 비 형광의 AM-형태이지만, calciu에 높은 형광 방출을 제공합니다M 바인딩 ^8,34. Fluo5N/Ca ^{2 +} 단지는 같은 FITC, 알렉사 488, 또는 EGFP와 같은 표준 염료에 해당 ~ 490 ㎚의 표준 광원으로 흥분 할 수 있습니다. 세포질 칼슘 신호는 거의 낮은 μM 범위에서 농도에 도달하지 않으므로 거의 세포질 ³⁵ Fluo5N에 의해 감지됩니다.

TED의 성능을 향상시키기 위해 몇 가지 재조합 벡터의 구조는 (그림 3)을 개발 하였다. 원래 CES2의 코딩 서열 (Refseq의 기탁 번호 NM_145603, CES2c)과 최고의 TED의 성능에 따라 TED 벡터는 CES의 구조를 안정적으로 발현으로 관찰된다. 새로운 TED 벡터는 빨간색 형광 단백질 TagRFP-T2 ³⁶ 융합 CES2의 핵심 요소를 표현한다. 이러한 벡터들은 세포를 형질 확인하고 Fluo5N/Ca ^2의 변화의 정상화를위한 내부 통제로 적색 형광을 사용하는 데 사용할 수 있다는 장점을 가지고 ⁺ 형광. 빨간색 형광은 자극 조건 하에서 ER과 ER 역학의 변화의 구조적 분포를 시각화 할 수있는 가능성을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 TED 세포 라인, 해마 뉴런과 대뇌 피질의 glial 세포에 적용 소개합니다. TED 성능이 가장 TED 벡터를 안정적으로 렌티 바이러스 벡터에 의해 예를 들어, 표현됩니다. TED 방법의 개략도는 그림 4에 표시됩니다.

1. 솔루션의 준비

다음과 같은 솔루션을 시작하기 전에 준비해야하며, 표시된대로 저장할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 멸균 유리와 플라스틱 소재 및 압력 가마로 소독 한 물을 사용합니다.

1. 125 염화나트륨, 3 KCl을, 25 HEPES, 2 _황산 마그네슘 0.7 H ₂ O 2, _{염화칼슘,} 1.25 ₂ PO ₄ NaH를 H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O :. HEPES-벨소리를 (mm 단위)를 준비 127 염화나트륨, 3 KCl을, 25 HEPES, 2 _황산 마그네슘 0.7 H ₂ O, 1.25의 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O 0.1 EGTA : 칼슘 무료 HEPES-벨소리는 (mm 단위)로 구성되어 있습니다.. 포도당없이이 영상 솔루션은 B 수4에 저장된 전자 ° C. D-포도당의 필요한 금액 갓 사용하기 전에 추가됩니다.
2. 해마 신경 세포에서 TED 분석을 위해, 인공 뇌척수 (ACSF)을 추천합니다. ACSF는 (mm 단위)로 구성되어있다 : 127의 NaCl, 23 NaHCO3를 _3, KCl을 2.5 NaHPO ₄ H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O 2, _{염화칼슘,} 2 MgCl ₂ 0.7 H ₂ DDH에서 0. ₂ 0.
3. 준비 5 mm의 농도 Fluo5N을하십시오. 가용화는 동결 건조 Fluo5N-AM의 50 μg을 20 % 플루로 닉 F-127 (DMSO에, 습기와 빛으로부터 보호, 실내 온도에서 보관)의 8.9 μl를 추가하는 데 도움이. 그런 다음 적어도 2 분 동안 물 목욕 sonicator에 의해 Fluo5N-AM 용해. 스토어 분주 -20 ° C에서 0.5 μL은 빛과 습기로부터 보호됩니다.
4. 필요에 따라 길항제 및 작용제 주식을 준비합니다. 예를 들면 : H ₂ O (작용제의) 10 mM의 ATP 나 ADP (H ₂ O, 퓨린 수용체의 대사성 활성화에), B) 10 MM carbachol무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체), C) DMSO에 30 mM의 cyclopiazonic 산 (CPA) (SERCA의 차단), D) PBS이 50 mm DHPG (시냅스 _I와 시냅스 ₅ 대사성 글루타민산 염 수용체), E) H 10 MM의 글루 탐 산염의 DMSO ₂ O, F) DMSO (이온 운반체), G 1 밀리미터 ionomycin) 5 밀리미터 쌥시 가르 긴 (SERCA 높은 친화력 차단). -20 ° C.에 저장 분주
5. 렌티 바이러스 벡터 :이 프로토콜은 렌티 바이러스 TED 발현 벡터 입자의 사용을 포함한다. 그들의 생산 및 저장이 프로토콜의 일부가 아닙니다. 우리는 세포 라인, glial 세포와 신경 세포에 재조합 Carboxylesterases의 전송을위한 제 2 세대의 렌티 바이러스 벡터를 사용합니다. 발현 벡터 FUGW ^37, 및 포장 플라스미드 pCMVΔR8.91 또는 psPAX2 및 pMD2.G ^38,39 플라스미드 pseudotyping에 우리 렌티 바이러스 시스템 기초주의 :. 재조합자가 불 활성화 렌티 바이러스 벡터에 대한 작업은주의를 필요로하는 고려바이오 안전성 지침을 고려. 많은 나라에서,이 벡터는 생물 학적 위험 그룹 2로 분류됩니다. 자세한 내용은 다음을 참조하십시오에 대한 http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. 준비 및 마우스 해마 신경 세포의 바이러스 감염

1. 약 30 분 동안 70 % 에탄올 20 cm 직경 (접시 당 100 coverslips를) 1X의 유리 페트리 접시에 유리 coverslips를 씻으십시오. 마지막 2 분 동안 100 % 에탄올 (PA)를 추가합니다. 잔류 에탄올을 제거하고 멸균 후드 아래에 coverslips를 건조.
2. B27 1시 50분와 neurobasal 매체 Glutamax 1:100, 및 N2 보충 1:100 :, (B) 가득 차있는 매체 B27 1시 50분와 () neurobasal 매체 : 해마 신경 세포의 배양을위한 미디어의 두 가지 종류를 준비. 멸균 여과 매체는 사용할 때까지 세포 배양기에서 그들을 저장합니다.
3. 이전 해부 어느 날, coverslips를 먼저 각각 하나의 멸균 10mm의 coverslip에 배치하여 준비가되어 있습니다물론 4도 세포 배양 접시. 그 후, 조심스럽게 코트 각각 80 ~ 100 ㎕의 0.1 % 폴리-L-라이신과 coverslip을하고 밤에 인큐베이터에서 접시를 저장합니다.
4. 해부 및 세포 문화의 날에 100 μL HBSS로 coverslips를 세 번 세척하여 시작하고 각 coverslip에에 100 μL neurobasal 매체를 전송할 수 있습니다. 평형에 대한 인큐베이터 (쥐의 해부하는 동안 예를 들어)에 접시를 놓습니다.

해부

우리는 우리의 기관 동물 관리 및 활용위원회에 의해 승인 유럽 연합 지침에 따라 마우스와 우리의 실험을 수행 할 수 있습니다.

5. 전체 머리를 제거하고 해마를 양측 해부.
6. 조심스럽게 수막와 해마와 장소가 아닌 다른 조직에 하나의 해마 (hippocampus) 450 μL HBSS를 포함하는 1.5 ML 튜브의 각을 제거합니다. 해마의 충분한 숫자가 고립 될 때까지 얼음에 조직을 저장합니다.

세포 배양

7. 각각의 튜브에 50 ㎕의 1 % 트립신 (워딩 턴)을 추가하고 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 그들을 품어. 때때로 튜브를 흔들어. 소화 반응을 중지하려면, 각각의 튜브에 50 ㎕의 1 % 트립신 억제제를 추가하고 튜브를 여러 번 반전.
8. 해마는 액체의 전송을 방지 한 15 ML 팔콘 튜브에 5까지의 모든 조직을 전송합니다. 5 ML의 최종 볼륨 B27-배지 (을)를 추가합니다.
9. 조심스럽게 위아래로 pipetting에 의해 화재 광택 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 조직을 씹다주의 :. 공기 방울을 피하십시오!
10. 3 분 400 XG에 스핀, 뜨는을 대기음 5 ML B27-미디엄 ()에있는 세포 펠렛을 resuspend.
11. 1,000 μL 플라스틱 필터 팁의 도움으로 두 번 누른 다음 유리 피펫으로 다시 조직을 씹다합니다. 로 단계 2.9 및 2.10에 설명이 수행합니다.
12. 마지막으로 원심 분리 한 후, 2 ㎖ 전체 mediu의 세포 펠렛을 resuspend을200 μL 플라스틱 필터 팁 세포를 M (B) 및 씹다. 단일 세포 현탁액에서 남아있는 세포 덩어리를 분리, 세포 대단히 짧은 시간이 1-2 분 동안 정착하자.
13. 세포를 계산하고 바이러스 감염에 필요한 세포의 총 수를 계산합니다. TED 영상을위한 10mm의 coverslip에 25,000 세포를 사용합니다.
14. 컨트롤로 도금 추가 25,000 비 형질 세포는이 시점에서 좋습니다.

바이러스 감염

15. 신선한 15 ML 팔콘 튜브와 400 X g에서 3 분간 원심 분리로 바이러스 감염 세포 현탁액을 전송합니다.
16. 뜨는을 대기음 300 μL 배지에서 세포를 resuspend을 (B)
17. 전염성 렌티 바이러스 TED 발현 벡터 입자의 적절한 금액을 추가하고 팔콘 튜브 10 분 동안 상온에 서 보자.
18. 도금 (각 10mm coverslip에 100 μL)에 필요한 최종 볼륨에 대한 전체 매체 (B)로 튜브를 기입 COV에서 매체를 대기음erslip, 즉시 각 coverslip에에 100 μl의 세포 현탁액을 배치합니다.
19. 모든 세포가 정착 (약 2 시간)하고 2 ML 매체 (B)를 포함 할 때까지 조심스럽게 요리를 채울 때까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
20. 뉴런은 적어도 일주일 동안 성장하자. 매주 매체의 50 %를 교체합니다.

3. 마우스 대뇌 피질 신경 교세포의 문화와 바이러스 감염

준비하기

1. 4 ML 0.5 NG / ML 폴리와 T75 세포 배양 플라스크의 기초 아교 매체 (10 % FCS와 DMEM/F12 1:1 혼합물, 5 % HS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.45 % 포도당) 및 코팅을 준비하여 시작 -DL-오르니 틴 브롬화 수소 (포르노) (150 mM의 붕산 용액, pH가 8.35에 희석). 2 시간 37 ° C에서 배양 후 또는 밤에, HBSS와 세포 배양 플라스크에 세 번 씻어 B27 1:50 10 NG / ML EGF를 포함하는 18 ML 기초 아교 매체를 추가합니다. 인큐베이터에있는 세포 배양 플라스크 (최대 3 시간) 평형.

해부

1. 우리는 우리의 기관 동물 관리 및 활용위원회에 의해 승인 유럽 연합 지침에 따라 마우스와 우리의 실험을 수행 할 수 있습니다.
2. 한 P5-P7 마우스의 뇌를 해부하고 2.5에 설명 된대로 두 반구에서 해마 및 수막을 제거합니다.
3. 전두엽 피질을 절개, 여러 개의 작은 조각으로 잘라 HBSS를 포함하는 1.5 ML 튜브에 그들을 수집합니다. 얼음에 튜브를 저장하고 세포 배양 부분 진행합니다.

세포 배양

4. 관에서 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 15 ML 팔콘 튜브에 모든 조직을 전송합니다.
5. 5 ML의 최종 볼륨에 기초 매체를 추가하고 화재 광택 유리 피펫 아래로 여러 번을 피펫에 의해 조직을 씹다. 3 분 300 XG에서 원심 분리 한 후, 매체를 대기음, 5 ML 기초 중간에있는 세포 펠렛을 resuspend.
6. 두 3.5 단계를 반복합니다.
7. 생 후회 원심 분리는 B27 (1시 50분) 10 NG / ML EGF를 포함하는 2 ㎖ 기초 glia의 중간에있는 세포 펠렛을 resuspend.
8. 다시 한번 Titruate 및 준비 T75 세포 배양 플라스크에 세포 현탁액을 전송하고 세포 3-4 일 성장하자.

glial 세포 (문화 3-4 일 후에)의 세척 :

9. 10 ML PBS로 한 번 세포를 씻으, 다른 손에 꽉 잡고 적극적으로 누르거나 부드럽게 손으로 플라스크를 몇 번 누르십시오. 이 단계의 세포 파편과 세포 클러스터와 문화에서 제거됩니다.
10. PBS를 대기음 B27 (1시 50분) 10 NG / ML EGF를 포함하는 신선한 기초 아교 매체를 추가합니다. 세포가 80 %가 confluency에 도달 할 때까지 더 5-7일에 대한 문화를 육성.

분할, 전달 및 glial 세포의 최종 시딩 :

11. 100 μL 폴리 - D - 라이신과 코트 10mm의 coverslips를 :와 부화 (원액 0.1 %가, 1 / 50 광고에게 20 ㎍ / PBS 또는 HBSS ml로 희석)그 밤에 인큐베이터합니다. HBSS로 coverslips를 세 번 세척하고 100 μL 기초 아교 매체를 추가합니다. 인큐베이터에 coverslips를 (3 시간)을 평형.
12. 10 ML PBS로 두 번 glial 세포를 씻어 PBS를 대기음, 3 ML 트립신 (TrypLE, 원액)을 추가합니다. 최대 1 분에 대한 세포를 Trypsinize주의 :. 오버 트립신을 피하십시오. 모든 셀의 보통 이상 80 % 이상이 1 분 후에 분리하고이 건강한 세포의 수백만을 가지고 충분합니다.
13. 10 ㎖ 기초 아교 매체를 추가하여 반응을 정지, 3 분 300 XG에 15 ML 팔콘 튜브, 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. 뜨는을 대기음 5 ML 기초 glia의 중간에있는 세포 펠렛을 resuspend.
14. 또, 회전과 같은 단계 3.15에 설명 대기음 후, 5 ML 기초 아교 세포 배지에서 세포를 resuspend을.
15. 1.5 ML 튜브에 세포의 수를 전송합니다. 10 ⁴ 2 × ⁴ glial 세포 하나 10mm의 coverslip에 충분합니다. 보통, 서스펜션 권4 잘 접시 미만 200 μL 하나를위한 세포를 형질 도입하는 매화. 세포 렌티 바이러스 TED 발현 벡터 입자의 적절한 금액을 추가하고 10 분 동안 RT에서 그들을 품어. 다음 파종 볼륨 (coverslip에 100 μL)에 기초 아교 매체와 서스펜션을 입력합니다.
16. 약 2 시간 동안 coverslip을 품어 당 감염된 세포의 씨앗 100 μL은 다음 2 ML의 최종 볼륨 B27 1:50 10 NG / ML EGF를 포함하는 기초 아교 매체를 추가합니다.
17. 도금 후 하루 3-7 실험 세포를 사용하여 최적의 배양 조건에 대한.

4. 기자 셀 라인의 생성 및 문화

TED 기자 셀 라인은 헬라, BHK21, HEK293 및 SH-SY5Y에 근거하여 설립되었다. 여기에서 우리는 헬라 세포에 대한 프로토콜을 제공하지만, 프로토콜뿐만 아니라 다른 세포주로 전송 될 수 있습니다.

안정 헬라 세포 라인의 생성

1. 야생 유형 헬라 세포 라인 및 전송 100,000 C를 분할1.5 ML 튜브에 200 μL의 볼륨 ELL 학생.
2. 튜브에 렌티 바이러스 TED 발현 벡터 입자의 적절한 금액을 추가하고 RT에서 10 분 동안 세포 바이러스 현탁액을 품어. 3 그런 다음 일 30mm 접시와 부화의 2 ML 매체의 총 부피 (DMEM, 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)의 씨앗 세포를.
3. PBS로 한번 세척 한 후, 매체를 대기음 500 μL 트립신 (TrypLE, PBS의 2시 3분)을 추가합니다. 약 알을 품다. 다음 3 분, 3 ML 매체를 추가하여 반응을 중지합니다. 3 분 400 XG에 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 현탁액을 전송합니다.
4. 200 μL 배지에서 세포 펠렛을 resuspend을 4.2에 설명 된대로 다시 렌티 바이러스 입자로 세포를 감염. 그런 다음, 10 ㎖ 배지에서 T25 세포 배양 플라스크에 씨앗 세포.
5. 60-80%의 confluency에 도달 할 때까지 세포를 성장. 그런 문화를 분할합니다.

TED 기자 셀 라인

6. TED 기자 셀 라인은 유지 될 수있다표준 매체, 예를 들어, DMEM 5 % 이상 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함에 ED가 사용됩니다.
7. 멸균 10mm의 coverslips는 (위 참조), 예를 들면 coverslip에 10,000 ~ 20,000 세포를 포함하는 4 잘 접시에있는 세포의 접시 적절한 수.
8. TED 영상을 위해 그들을 사용하기 전에 적어도 이틀 동안 세포를 성장.

5. 거꾸로 현미경의 라이브 이미징 절차에 대한 준비

1. 1. Prewarm 실내 온도 HEPES - 벨소리 및 D-포도당을 추가합니다.
   2. Prewarm ACSF ^{(칼슘없이 +} 및 마그네슘 ^{2 +)} 실내 온도와 D-포도당을 추가합니다. 5 분 동안 carbogen와 ACSF을 공기에 쐬다. 다음 2 개 mm 각의 최종 농도에 염화칼슘 ₂ MgCl ₂ 1 M 주식 솔루션을 추가합니다.
2. 라이브 영상 현미경 및 모든 컴퓨터 프로그램을 시작합니다.
3. "더미"이미징 챔버에 관류를 시작하고 튜브 시스템을 평형.
4. 현미경 단계에서 인라인 솔루션 히터와 이미징 챔버를 Prewarm. 열 삽입의 이미징 챔버를 수정합니다.
5. 당신은 염료로드 절차를 시작 ° C 전에 32-37로 시스템을 평형주의 :. 우리는 현미경 스테이지를 보호하기 위해 목표와 탄성 실리콘 시트 (1mm)의 주위에 머리 동점을 사용하는 현미경 시스템에 관류 솔루션의 실수로 흐름을 방지하려면.

6. 세포 유형 하나의 염료 로딩 중

1. 100 μL prewarmed 이미징 솔루션 (HEPES-벨소리 또는 ACSF)의 Fluo5N-AM 1 나누어지는 (1.3 참조)를 Resuspend.
2. 가용화 90 초 동안 물 목욕 sonicator에서 이미징 솔루션 (HEPES-벨소리 또는 ACSF)에 Fluo5N을하십시오.
3. 또는 잘 하나 24 - 웰 플레이트 및 전송 400 μL prewarmed 이미징 솔루션 - 신선한 4를 사용합니다. 5 μM 용액 500 μL에 와서도 동일하게 설정 염료 솔루션을 추가합니다.
4. 세포 (예로 coverslip을주의 깊게 배치잘 직경의 10~18mm)을 위로 향하게 전지.
5. 37 세포 배양 배양기에서 적절한 시간 동안 품어 ° C (사이 현미경 스테이지에서 이미지 설정을 준비합니다.) 일반적인 염료 로딩 시간은 10-20 분 뉴런과 glial 세포 7-15 분 동안 세포 라인입니다.

결정적인 : 염료 로딩 시간과 농도 염료 세포 유형, 세포 밀도, 실험 특정 요구 사항에 따라 달라집니다! 염료의 면전에서 긴 배양 시간은, 세포를 손상, 특히 주요 신경 및 기본 glial 세포 이것은 생리적 자극에 대한 반응에 중요합니다. 긴 배양 시간 (예 : 30 분)은 작은 세포 내 구조물, 예를 들어 미세 돌기 나 쪽의 ER 칼슘의 분포를 조사하기 위해 ER 칼슘 현지화 실험에 유용합니다. 어떤 실험에서, 이미징 솔루션 1 / 3 성장 매체의 혼합물 Fluo5N-AM 동안 세포를 보호하는 데 도움이 될 수 있습니다로드.

6. 즉시 잘 이미징 솔루션을 포함하는 다른 세포 배양 (HEPES-벨소리 또는 ACSF)에 coverslip을 전송 및 이미징 챔버에 세포를 부착 시작합니다.

7. 공 촛점 현미경 스캐닝 거꾸로 레이저와 ER-칼슘 라이브 셀 이미징

1. 이미징 챔버에 높은 진공 그리스를 적용하는 페인트 브러시를 사용합니다. 그리스는 재관류 챔버의 바닥에 커버 슬립을 흥분시키는 데 필요합니다. 따라서 우리는 분당 15 배 버퍼 교환에 최대의 높은 혈류 속도를 수 있도록, 작은 볼륨 10~12mm coverslips를 위해 자체 제작 이미징 챔버를 사용합니다. 18mm의 coverslips를 위해 상업적으로 이용 가능한 재관류 챔버, 워너기구 (RC-49FS)에서 구입할 수 있습니다. 이 챔버는 뉴런의 필드 자극 할 수 있습니다.
2. Fluo5N로드 셀 coverslip을 픽업 및 이미징 솔루션으로 덮여 세포를 유지하는 세포 위에 이미징 솔루션 (50 ~ 100 μL)의 작은 방울을 추가합니다.거꾸로 coverslip에 전원을 켜고 이미징 챔버에 세포를 마운트합니다. 실리콘 접착제로 커버 슬립을 누릅니다 (예 : Q-팁) 면봉을 사용합니다.
3. 면봉과 유리 coverslip에의 아래쪽에서 떨어져 남아있는 버퍼를 닦아주의 :. 고해상도 이미징을위한 높은 수치 조리개 기름 목표를 사용할 때 조심스럽게 잔여 물기를 닦아냅니다. 잔류 염은 가장 물에 의해 제거됩니다. 그리스의 사고 얼룩은 아세톤 또는 순수 에탄올을 제거 할 수 있습니다.
4. 실험 이미징 챔버 교환 "더미"이미징 챔버. 지속적인 관류하여 5-10 분 동안 세포를 씻으십시오.
5. 5 세포를 씻으 - 10 분 연속 관류 있습니다.
6. 셀 선택을 위해 레이저 조명, 높은 스캔 속도 (2-4 Hz에서), 작은 이미지 크기, 높은 이득의 최소 금액을 사용합니다.
7. 주의 : Fluo5N - 라벨 세포의 선택을 위해 epifluorescen 빛 또는 직접 조명을 초과 사용하지 마십시오T 빛. Fluo5N/Ca ^2의 밝은 조명 ⁺ 단지 2-4 초 (그림 5)에서 ER-특정 형광의 전체 손실이 발생합니다.
8. 계획된 실험에 따라 현미경을 설정합니다. 방향에 대해 서로 다른 TED 벡터와 이미징을위한 대표적인 설정은 표 1에 제시되어있다. 그리고 스펙트럼 검출기 시스템, 공 촛점 현미경 스캐닝 역 레이저를 들어, 우리는 다이오드 레이저 (559 nm의 20 mW의 473 nm의 15 MW)가 장착되어 Fluoview 1000 촛점 시스템과 결합 올림푸스 IX81 현미경을 사용합니다.
9. 실험 문서의 시작 부분에 고해상도 X, YZ 이미지 스택에 의해 관심의 세포.
10. 특정 실험 조건 하에서 ER 칼슘 역학을 모니터링하는 X, YT 이미징을 수행합니다. 우리의 시스템에 대한 일반적인 설정은 표 2에 나열되어 있습니다.
11. 이미징 솔루션을 지속적으로 관류 하에서 ER 칼슘의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 일반적인 버퍼 환율 전자 수 있습니다xemplarily : () SERCA 블록 세포 세척 및 매장 고갈 : 1.5 ML / 분, (B) ATP / DHPG 자극 : 3 ML / 분.
12. 12 비트 (4096 회색 값)를 우선적으로 디지털 이미지를 획득. Fluo5N/Ca ² 병렬 이미징 ⁺ 및 RFP, 8 비트 이미지 (256 회색 값) 데이터 플로우에서 시스템을 구출 할 수 있습니다.
13. ImageJ에 호환 형식 (예 : TIFF)에서 세포 시계열 이미지 (X, YT) 또는 3D 이미지 스택 (X, YZ)을 (Fluo5N/Ca ^{2 +} 착물의 세포 분포) 살고 저장합니다.

8. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석

1. ImageJ에 프로그램에서 이미지 스택을 엽니 다. ImageJ에 의해 물었을 때 여러 가지 빛깔의 영상의 경우 RGB 채널을 분할합니다.
2. (예를 들어, 강도 대 시간 플롯의 도움으로) 이미지 스택을주의 깊게 검토하여 관심 (ROI)의 해당 지역 (들)을 식별
3. ROI의 평균 픽셀 강도 (F _원시) 판독하는 시간 시리즈 분석 플러그인을 사용합니다. Dependin목적에 G, 완전한 ER 또는 주변 셀 영역의 수상 돌기의 ER 예를 들어, ER 작은 지역 중 하나 주위에 ROI를 그립니다. 또한 배경 공제 세포가없는 지역에 1-3 ROI 있습니다.
4. 배경 ROI의 평균 형광 값을 계산하여 평균 배경 형광을 (F _B)를 계산하고 F의 _{ROI 값을} 가져 F _원시 값과 배경 값 F _B를 뺍니다.
5. 휴식 상태에서 각 투자 수익 (ROI)에 대한 열 30 형광 값의 평균값을 계산하여 세포의 기저 형광입니다 F _0을 계산한다.
6. 식으로 ΔF / F _0으로 형광 배경 - 수정 상대적 변화를 계산

7. 에 존재하는 관계 변화는 형광Y 축과 X 축 시간 ΔF / F _0와 추적으로 NCE.

결과

이 프로토콜은 무료 ER 칼슘의 직접 이미징을위한 무중단 방식을 제공합니다. 낮은 친화력 합성 칼슘 ^{2 +} 지표 발표하고 대상 ER의 도움으로 재조합 에스테르 가수 분해 효소 효소의 활동과 ER 루멘에 갇혀있다. ER 루멘 칼슘 ^{2 +} 지표 염료의 향상된로드는 ER의 칼슘 저장소 역학의 직접적이고 빠른 영상을 가능하게합니다.

TED에 대한 세포 유형

방법의 타당성은 셀 라인 BHK21, HEK293 ^34, 헬라 ^17, SH-SY5Y 배양 성상 ^8,40 및 기본 해마와 대뇌 피질의 뉴런 ^8,34,41에 표시되어 있습니다. 우리의 실험에서, TED는 상대적으로 약한 발기인 (예를 들어 유비퀴틴 프로모터) ^35를 사용하여 자체 운영을 중지 렌티 바이러스 벡터 ^37,39에

토론

TED 방법의 장점과 단점은 최근의 출판물 ^34,35에서 광범위하게 논의되었다. 위에서 설명한 다른 방법에 비해, TED는 세포를 방해하고 관류의 문제를 우회. 또한, 두 가지 측면이 강조 될 필요가있다. ER 칼슘 이미징을위한 TED의 원리는 TED 벡터 구조의 도움과 낮은 친화력 합성 AM-에스테르 (2). 효율적이고 특혜 릴리스 ER 루멘의 활성 carboxylesterase (1). 대상으로 표현해야합니다 ER 루멘 칼슘 염료.

1. TED 벡터 생성

그림 3은 TED 벡터 구조의 발전을 요약 한 것입니다. TED는 CES 가족 단백질 (EC 3.1.1.1)에 기초하여 개발되었다. 이 단백질은 ER 루멘의 구성원 거주. 체외에서 들어 CES 단백질의 재조합 관리가 안정적으로 발현 한 후 가장 적합한 연구단백질이나 중간 발현 수준의 바이러스 감염 후. 현재, ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(S)-3,5-DHPG (디하이드록시페닐글리신)	토크리스	0805
5';-ATP-Na2, ATP 디소듐 염 수화물	시그마	A26209-1G
B-27 보충제,50x	인비트로젠	17504-044
카르바모일콜린 클로라이드 (차르바콜)	시그마	C4382-1g
시클로피아존산 (CPA)	어센트 사이언티픽	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
태아 송아지 혈청	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
글루타메이트	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 영양소 혼합물	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca, without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-Ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Glycine	LS-003707
트립신 억제제	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		사용자별 구성
컨포칼 시스템: 스펙트럼 검출기가 있는 스캔 헤드 FV10-SPD	Olympus		사용자별 구성
히터 컨트롤러 TC-344B	Warner Instruments	64-0101	을 제어하여 인라인 솔루션 히터
NIH ImageJ 소프트웨어	WS Rasband, ImageJ, 미국 국립보건원(National Institutes of Health), http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
목표: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	올림푸스	N2709100
목표: UPLFLN40XO	올림푸스	N1478700
대물렌즈: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	올림푸스	N1480700
관류 챔버, 역	맞춤형
관류 챔버, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
관류 튜브 : PT-49	Warner Instruments	64-1730	관류
용 연동 펌프 MiniPlus 3 (4 채널)	Gilson	n.a.	관류 펌프
단일 인라인 용액 히터 SH-27B	히터	컨트롤러로 제어	64-0102
흡입관: ST3R	류용	Warner Instruments	64-1407
가열 인서트: Tempocontrol 37-2 디지털 2채널	Pecon	n.a.