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방법 논문

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

14.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50366

⸱

2013년 6월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

이 논문에서

정오 공지

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요약

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.

초록

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 덕트 주요 세포를 수집하고이를 미세 조정 몸 물 항상성에 의해 물을 재 흡수를 용이하게합니다. AVP는 세포의 표면에 바소프레신​​ V2 수용체 (V2R)에 결합함으로써 캠프의 합성을 유도합니다. 이 물 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2)의 인산화의 변화를 선도하는 세포 신호 전달 과정을 자극한다. 단백질 키나아제 A는 AQP2를 phoshorylates함으로써 기본 소변에서 물을 재 흡수를 촉진 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서 AQP2의 전위를 트리거합니다. 주요 세포에서 뇌하수체 또는 AVP 활성화 신호에서 AVP 방출의 수차는 각각 중앙 또는 신원 성 요붕증을 일으킬 수 있으며, 높은 혈액 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 증후군 심혈관 질환과 관련이 있습니다.

여기, 우리는 cultivati​​위한 프로토콜을 제시한다표현 V2R 및 AQP2는 내생 덕트 (IMCD) 세포를 수집, 차 쥐 내부 수질의합니다. 세포는 AQP2의 컨트롤을 기본 분자 메커니즘을 해명에 적합하며, 따라서 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를위한 새로운 약물 표적을 발견 할 수 있습니다. IMCD 세포는 쥐의 신장 내 medullae에서 얻을 수 있습니다 및 6~8일 파종 후 실험에 사용됩니다. IMCD 세포는 일반 세포 배양 접시, 플라스크 및 다른 형식의 마이크로 타이 터 플레이트에서 배양 할 수있는 절차는 몇 시간이 필요하며, 표준 세포 배양 실험실에 적합합니다.

서론

신장 집합관 주 세포, 아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 물 삽입을 자극하여 물을 재 흡수를 제어하는​​ 플라즈마 막에 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2). AVP는 아데 cyclase의함으로써 캠프의 형성을 자극 G 단백질 결합 바소프레신​​ 2 형 수용체 (V2R)에 바인딩합니다. 이 신호 폭포의 개시 단백질 키나제 A (PKA)의 활성화로 연결됩니다. PKA는 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서의 재분배를위한 주요 트리거입니다, 256 (S256) 세린에서 AQP2를 인산화. 막 삽입 삼투 기울기 및 미세 조정 몸 물 항상성을 따라 물을 재 흡수를 용이하게합니다.

때문에 AVP 분비 또는 AVP 활성화 신호 원인 또는 수차에 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애는 심각한 질병과 연관됩니다. V2R 또는 AQP2의 돌연변이에 의해 발생 감소 물을 재 흡수는 표고 반면, 신원 성 요붕증로 연결ated 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 (SIADH)의 증후군 심혈관 질환의 과도한 수분 재 흡수와 연결되어 있습니다.

AVP-매개 물을 재 흡수의 중요성뿐만 아니라 질병의 의미에서 유래한다. AQP2 베어링에 소포와 세포막과 융합의 AVP 유발 전위는 현재 잘 이해되지 않는 엄격 캠프에 의존 exocytic 프로세스를 나타냅니다. 캠프 의존 exocytosis에 대한 다른 예는 신장과 H의 레닌 분비 + 위장 분비한다. 따라서 신장 주요 세포에서 AQP2-전위를 지배하는 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 다른 세포 유형에 비슷한 분자 프로세스를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라 AVP-매개 물을 재 흡수의 장애와 관련된 질환의 치료에 대한 새로운 치료에 방법을 포장 수 있습니다 .

E기계 제어 AQP2를 lucidating은 덕트 주요 세포 모델을 수집해야합니다. 이를 위해 다른 포유 동물의 신장 세포 라인의 숫자를 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델은 몇 가지 단점을 가지고있다. 많은 세포 시스템에서 AQP2의 단백질 수준 (표 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 낮은 1-10 ectopically 다른 과발현 사람 (MCD4, WT10) 11,12 또는 쥐 (CD8) 13 AQP2. MCD4 및 COS​​-7 세포에서 V2 수용체가 표시되지 않습니다. 우리의 지식이 신장 내 수질 집합관, AQP2 발현이 가장 풍부한 신장의 그 부분에서 파생 가능한 모델로 영구 세포 라인은 없지만, 대뇌 피질 집합관 1,11,13-16에서 . 이러한 세포 모델은 예를 들어 널리 사용되는 불후의 mpkCCD (예를 들어, 17) 또는 최근에 설립 된 mTERT-CCD 14 세포주이다. 두 세포주 내생 적 표현 AQP2 및 V2R 그러나 그들은에서 파생되기 때문에대뇌 피질의 수집 덕트는 대부분 덕트 (IMCD) 세포를 수집하는 내부 수질에 비해 다른 프로테옴을 포함합니다. 그들은 예를 들어 다른 나 표현해야 + 교통 시스템입니다.

여기, 우리는 V2R 및 AQP2 내생 적 표현 문화의 기본 IMCD 세포 프로토콜을 제시한다. 이 모델은, 그러므로, 신장 수집 덕트에서 가장 밀접하게 생리적 상황을 나타냅니다. 문화를 확립하는 것이 필요하기는 표준 실험실 장비 기타 실험실은 쉽게이 방법을 채택 할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 준비하기

  1. 배양 접시를 준비
    1. 해동 콜라겐 유형 4에서 IV O / N ° C와 0.1 % 멸균 아세트산에 용해. 사용하는 볼륨은 세포가 파종을 작성할 수있는 요리의 종류와 수에 따라 달라집니다. 2 ㎍ / cm 2를 사용하십시오.
    2. 적어도 RT에서 1 시간 동안 요리를 품어 증류수 (A. tridest)로 두 번 씻는다.
    3. 요리가 제대로 건조하도록 허용합니다.
  2. 매체의 보완
    1. 500 ML 매체에 1.75 g의 포도당을 추가하여 최대 4.5 g / L의 포도당 수준을 높일 수 있습니다. 매체 600 mosmol으로 조정하려면, 각각 200 mosmol 100 mosmol하여 삼투압을 증가, 100 mM의 NaCl을 100 MM의 요소를 추가합니다.
    2. 600 mosmol DMEM 배지에 1 % 비 필수 아미노산, 1 % ultroser, 500 μM의 DBcAMP, 20 U / ㎖ 스타틴 0.25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖의 농도 원액 1:200 희석)을 추가 갓 준비의 날에.
  3. 효소 솔루션
    1. 에 1 밀리그램 / ML 히알루 2.2 MG / ML 콜라를 추가 DPBS 함유 0.25 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 스타틴을. 2 신장 내부 medullae의 소화에 대한이 효소 용액 1 ㎖를 준비합니다. 이 솔루션은 여과 멸균되어야하며, 50 ML 팔콘 튜브에 저장됩니다.

2. 차 쥐 내부 수질의 재배 덕트 (IMCD) 세포를 수집

모든 동물의 처리 절차는 로컬 및 연방 법률을 준수 실시하여야한다.

  1. CO 2의 쥐 (CO 2로 포화 상자) 또는 isoflurane을 (; ~ 2.5 % isoflurane을 가진 공기 흐름 350-400 ML / 분 U-400 마취 장치, Univentor 회사, 몰타)을 마취시키다. 흰 안쪽과 어두운 바깥 수질 경계의 정확한 검출을 허용 출혈 동물의 목을 베십시오. 또한, 출혈 격리 적혈구의 수를 최소화합니다. 신장을 제거하고얼음 겐타 마이신과 스타틴 (위 참조) 보충 멸균 DPBS에서 그들을 씻어. 모든 추가 단계는 무균 클린 벤치 조건 하에서 실시하여야한다.
  2. 과도한 액체를 제거하는 살균 압축에 DPBS 용액으로부터 신장을 전송합니다. 멸균 집게와 가위로 지방 신장 캡슐을 제거합니다.
  3. 신장은 여전히​​ 압축에 고정 바깥 쪽 (피질) 측의 종축 옆에 약간 잘라 데. 완전히 극복 할 수 있지만, 신장 골반에 연결 한 조각에 남기지 않도록해야합니다.
  4. 곡선 가위로 조심스럽게 장미 반짝이는 외부 수질에 둘러싸여 흰 내부 medullae를 해부. 얼음에 60mm 배양 접시에 겐타 마이신과 스타틴을 포함 DPBS에서 그들을 수집합니다.
  5. 모든 medullae이 고립 얼음에 수집되면, 그들은 그냥 버퍼로 덮여 수준으로 DPBS의 양을 줄일 수 있습니다. 5 큐브로 medullae를 잘라 살균 면도칼을 사용하여mm 3.
  6. 화염으로 짧게 잡고 녹여 멸균 파스퇴르 피펫의 예리한 끝을 라운드. 피펫 계속하기 전에 냉각되어 있는지 확인합니다.
  7. 둥근 파스퇴르 피펫을 사용하여 히알루 및 콜라게나 제 (1.3.1 참조) 갓 준비한 살균 효소 솔루션을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 조직 현탁액을 전송합니다. 단단히 뚜껑을 닫고 37 ° C 1.5 일반 탁상 물 목욕 연속 교반 (220 rpm)가 아​​래에서 알을 품다 - 2 시간.
  8. 서스펜션의 분쇄를 들어, 정지 균일 혼탁 될 때까지 라운드 파스퇴르 피펫 (위 참조)를 여러 번 내려 혼합물을 피펫.
  9. 300 XG에서 5 분, 16 ° C.를위한 현탁액을 원심 분리기 상층 액을 버리고 침전물을 다시 겐타 마이신과 스타틴과 원심 분리기를 포함 DPBS에 철저 resuspend을. 한번이 세척 단계를 반복합니다.
  10. 완벽하게 보완 매체와 C에 씨앗을에서 세포를 resuspend을ulture 요리 및 / 또는 미세 역가 웰 플레이트. 2 medullae (1 동물)의 준비를 한 60mm 배양 접시에 충분한 세포를 얻을 것입니다.
  11. 24 시간 후, 600 mosmol DMEM로 두 번 세포를 씻으 신선한 매체를 추가합니다. 다음 주에 세포를 2 ~ 3 회 (그림 1) 세척해야한다. 6-8일 파종 후 IMCD 세포 실험에 사용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 24 시간 동안 DBcAMP 및 스타틴없이 매체를 배양해야합니다. 그렇지 않으면 AQP2는 플라즈마 막에서 독점적 위치합니다.

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결과

차 쥐 IMCD 세포의 성공적인 재배 6-8일 파종 후 합류 단층 (그림 2)가 발생합니다. 60mm 배양 접시 당 약 6 × 10 6 세포가 있습니다. 이들은 콜라겐 유형 IV, 기저막 구성 요소를 18로 코팅 된 것과 세포는 단단히 배양 접시에 부착. 따라서 IMCD 세포는 여러 철저한 세척 과정에서도 분리되지 않습니다. 까지 배양 세포의 80 %는 내생 V2R 및 AQP2를 표현한다. AQP2가 부족한 세포가 협재 세포 헨레, 바사 곧은 창자 또는 내부 수질 간질 세포의 루프의 얇은 사지에서 파생 된 비 IMCD 세포로 간주됩니다 반면, 이들은 주요 세포이다. 우리는 앞에서 설명한 바와 같이, 600 mosmol의 중간 삼투압는 AQP2 19 다운 규제를 방지 할 수 있습니다. 또한, AQP2 발현은 막 투과 캠프 아날로그 DBcAMP와 매체를 보완하여 유지됩니다. AQP2 플라즈마 MEMB을 줄이기 위해RANE 표현함으로써 그 세포...

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토론

우리는 차 쥐 IMCD 세포의 준비 및 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 방법은 하나의 쥐 20의 세포의 21cm 2까지 얻을 수 있습니다. 실험은 표준 세포 배양 장비가 필요하고 약 6 시간 안에 한 사람에 의해 수행 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 표준 실험 방법으로 적합합니다.

차 쥐 IMCD 세포를 96 웰 플레이트에서 60mm 요리에 이르기까지 다양한 크기의 배양 접시에 분주 할 수 있습니다. 그러나 384도 형식의 성장을위한 절차는 최적화가 필요합니다. 우리는 성장 둔화로 60mm보다 큰 그릇을 사용하지 마십시오. 세포는 웨스턴 블롯, 면역 침전, DNA / RNA 분리, 면역 형광 현미경, 칼슘 2 + 이미징 및 전기 생리학 10,22,23 등 다양한 실험에 적합합니다.

파종 후 약 6-8일는 기본 IMCD 세포 confl로 ...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (, KL 1415/3-2와 KL 1415/4-2 DFG)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 유형 IV 마우스BD Biosciences356233
히알루로니다아제SIGMAH6254
콜라겐 분해 효소 유형 CLS-IIBiochrom AGC2-22
DMEM + GlutMAXInvitrogen GIBCO21885108
NystatinSIGMAN4014
Ultroser GCytogen15950-017
비필수 아미노산(NEA)Biochrom AGK0293
GentamicinInvitrogen GIBCO15710
DBcAMPBIOLOGD009

참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

태그

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