아르기닌 바소프레신 (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.
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정오 공지
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요약
초록
아르기닌 바소프레신 (AVP)는 신장 덕트 주요 세포를 수집하고이를 미세 조정 몸 물 항상성에 의해 물을 재 흡수를 용이하게합니다. AVP는 세포의 표면에 바소프레신 V2 수용체 (V2R)에 결합함으로써 캠프의 합성을 유도합니다. 이 물 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2)의 인산화의 변화를 선도하는 세포 신호 전달 과정을 자극한다. 단백질 키나아제 A는 AQP2를 phoshorylates함으로써 기본 소변에서 물을 재 흡수를 촉진 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서 AQP2의 전위를 트리거합니다. 주요 세포에서 뇌하수체 또는 AVP 활성화 신호에서 AVP 방출의 수차는 각각 중앙 또는 신원 성 요붕증을 일으킬 수 있으며, 높은 혈액 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 증후군 심혈관 질환과 관련이 있습니다.
여기, 우리는 cultivati위한 프로토콜을 제시한다표현 V2R 및 AQP2는 내생 덕트 (IMCD) 세포를 수집, 차 쥐 내부 수질의합니다. 세포는 AQP2의 컨트롤을 기본 분자 메커니즘을 해명에 적합하며, 따라서 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를위한 새로운 약물 표적을 발견 할 수 있습니다. IMCD 세포는 쥐의 신장 내 medullae에서 얻을 수 있습니다 및 6~8일 파종 후 실험에 사용됩니다. IMCD 세포는 일반 세포 배양 접시, 플라스크 및 다른 형식의 마이크로 타이 터 플레이트에서 배양 할 수있는 절차는 몇 시간이 필요하며, 표준 세포 배양 실험실에 적합합니다.
서론
신장 집합관 주 세포, 아르기닌 바소프레신 (AVP)는 물 삽입을 자극하여 물을 재 흡수를 제어하는 플라즈마 막에 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2). AVP는 아데 cyclase의함으로써 캠프의 형성을 자극 G 단백질 결합 바소프레신 2 형 수용체 (V2R)에 바인딩합니다. 이 신호 폭포의 개시 단백질 키나제 A (PKA)의 활성화로 연결됩니다. PKA는 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서의 재분배를위한 주요 트리거입니다, 256 (S256) 세린에서 AQP2를 인산화. 막 삽입 삼투 기울기 및 미세 조정 몸 물 항상성을 따라 물을 재 흡수를 용이하게합니다.
때문에 AVP 분비 또는 AVP 활성화 신호 원인 또는 수차에 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애는 심각한 질병과 연관됩니다. V2R 또는 AQP2의 돌연변이에 의해 발생 감소 물을 재 흡수는 표고 반면, 신원 성 요붕증로 연결ated 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 (SIADH)의 증후군 심혈관 질환의 과도한 수분 재 흡수와 연결되어 있습니다.
AVP-매개 물을 재 흡수의 중요성뿐만 아니라 질병의 의미에서 유래한다. AQP2 베어링에 소포와 세포막과 융합의 AVP 유발 전위는 현재 잘....
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프로토콜
1. 준비하기
- 배양 접시를 준비
- 해동 콜라겐 유형 4에서 IV O / N ° C와 0.1 % 멸균 아세트산에 용해. 사용하는 볼륨은 세포가 파종을 작성할 수있는 요리의 종류와 수에 따라 달라집니다. 2 ㎍ / cm 2를 사용하십시오.
- 적어도 RT에서 1 시간 동안 요리를 품어 증류수 (A. tridest)로 두 번 씻는다.
- 요리가 제대로 건조하도록 허용합니다.
- 매체의 보완
- 500 ML 매체에 1.75 g의 포도당을 추가하여 최대 4.5 g / L의 포도당 수준을 높일 수 있습니다. 매체 600 mosmol으로 조정하려면, 각각 200 mosmol 100 mosmol하여 삼투압을 증가, 100 mM의 NaCl을 100 MM의 요소를 추가합니다.
- 600 mosmol DMEM 배지에 1 % 비 필수 아미노산, 1 % ultroser, 500 μM의 DBcAMP, 20 U / ㎖ 스타틴 0.25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖의 농도 원액 1:200 희석)을 추가 갓 준비의 날에.
- 효소 솔루션
- 에 1 밀리그램 / ML 히알루 2.2 MG / ML 콜라를 추가 DPBS 함유 0.2....
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결과
차 쥐 IMCD 세포의 성공적인 재배 6-8일 파종 후 합류 단층 (그림 2)가 발생합니다. 60mm 배양 접시 당 약 6 × 10 6 세포가 있습니다. 이들은 콜라겐 유형 IV, 기저막 구성 요소를 18로 코팅 된 것과 세포는 단단히 배양 접시에 부착. 따라서 IMCD 세포는 여러 철저한 세척 과정에서도 분리되지 않습니다. 까지 배양 세포의 80 %는 내생 V2R 및 AQP2를 표현한다. AQP2가 부족한 세포가 협재 세포 헨레, 바사 곧은 창자 또는 내부 수질 간질 세포의 루프의 얇은 사지에서 파생 된 비 IMCD 세포로 간주됩니다 반면, 이들은 주요 세포이다. 우리는 앞에서 설명한 바와 같이, 600 mosmol의 중간 삼투압는 AQP2 19 다운 규제를 방지 할 수 있습니다. 또한, AQP2 발현은 막 투과 캠프 아날로그 DBcAMP와 매체를 보완하여 유지됩니다. AQP2 플라즈마 MEMB을 줄이기 위해RANE 표현함으로써 그 세포.......
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토론
우리는 차 쥐 IMCD 세포의 준비 및 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 방법은 하나의 쥐 20의 세포의 21cm 2까지 얻을 수 있습니다. 실험은 표준 세포 배양 장비가 필요하고 약 6 시간 안에 한 사람에 의해 수행 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 표준 실험 방법으로 적합합니다.
차 쥐 IMCD 세포를 96 웰 플레이트에서 60mm 요리에 이르기까지 다양한 크기의 배양 접시에 분주 할 수 있습니다. 그러나 384도 형식의 성장을위한 절차는 최적화가 필요합니다. 우리는 성장 둔화로 60mm보다 큰 그릇을 사용하지 마십시오. 세포는 웨스턴 블롯, 면역 침전, DNA / RNA 분리, 면역 형광 현미경, 칼슘 2 + 이미징 및 전기 생리학 10,22,23 등 다양한 실험에 적합합니다.
파종 후 약 6-8일는 기본 IMCD 세포 confl로 .......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (, KL 1415/3-2와 KL 1415/4-2 DFG)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콜라겐 유형 IV 마우스 | BD Biosciences | 356233 | |
| 히알루로니다아제 | SIGMA | H6254 | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nystatin | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| 비필수 아미노산(NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
참고문헌
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Chara....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
