방법 논문

높은 소금 다이어트와 루이스 쥐에서 만성 신장 질환을 유발하는 산화 질소 합성 효소 억제와 함께 5/6th의 절제

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⸱

DOI:

10.3791/50398

⸱

2013년 7월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

이 논문에서

요약

수술 신장 질량의 5/6th를 제거하여 루이스 쥐에서 만성 신장 질환 (CKD)을 설정하는 두 단계 방법을 설명합니다. 수술의 조합, NOS-억제와 높은 소금 다이어트 인과 관계 메커니즘과 새로운 치료 개입의 개발 연구를 허용, 인간의 CKD를 닮은 모델에 연결됩니다.

초록

만성 신장 질환 (CKD)는 세계적인 문제입니다. CKD의 진행을 느리게하는 주요 건강 우선 순위입니다. CKD는 항상성의 복잡한 derangements 특징 때문에, 통합 동물 모델은 CKD의 개발 및 진행을 연구 할 필요가있다. CKD의 CKD 및 새로운 치료 개입의 개발을 연구하기 위해, 우리는 인간의 CKD의 여러 측면을 닮은 5/6th 절제 절제 모델, 진보적 인 신장 질환의 잘 알려진 실험 모델을 사용합니다. 신장 질량 총 감소는 진보적 인 사구체와 tubulo-간질 부상, 남은 네프론의 손실과 조직 및 사구체 고혈압의 개발을 발생합니다. 또한 진보적 인 intrarenal 모세 혈관 감소, 염증과 사구체 경화증과 연관되어 있습니다. 위험 요인은 결국 내피 세포 기능에 미치는 영향을 CKD. 이 모방하기 위해, 우리는 산화 질소 (NO) 고갈과 높은 소금 다이어트와 신장 질량의 5/6th의 제거를 결합합니다. 도착 적응 한 동물은 다시오른쪽면 uninephrectomy 다음에 사주의 기간 동안 물 (20 ㎎ / L)을 첨가 NO 합성 효소 억제제 (NG-니트로-L-아르기닌) (L-NNA)를 가압하지 않습니다. 일주일 후, 소계 절제 (SNX)이 왼쪽에서 수행됩니다. SNX 후, 동물을 4 주 더 동안 물 (20 ㎎ / L)에 LNNA 다음 이틀 동안 복구 할 수 있습니다. 지상 차우 (시간 선 그림 1 참조) 보충 높은 소금 다이어트 (6 %)을, 실험을하는 동안 계속됩니다. 신부전의 진행은 혈중 요소, 수축기 혈압과 단백뇨를 측정하여 시간이 지남에 따라한다. SNX 후 6 주까지, 신부전을 개발하고있다. 신장 기능이 '황금 표준'이눌린 및 파라 - 아미노 히 푸르 산 (PAH) 정리 기술을 사용하여 측정됩니다. CKD의이 모델은 사구체 여과율 (GFR)의 감소와 효과적인 신장 플라즈마 흐름 (ERPF), 고혈압 (수축기 혈압> 150 mmHg로), 단백뇨 (> 50 mg/24 시간이 특징입니다)와 가벼운 요독증 (> 10 MM). 조직 학적 특징은 염증, 관 위축 및 섬유화와 나머지 인구 (<10 %)에서 건강 사구체의 대규모 감소로 이어지는 초점 사구체에 반영 tubulo-간질 손상이 있습니다. 후속 SNX는 CKD의 추가 진행을 보여줍니다 12주 후까지.

서론

그 진보적 성격, 계속되는 말기 신장 질환과 관련된 심혈 관계 이환율과 사망률로 인해 CKD는 성장 공중 보건 문제 1. CKD의 진행을 둔화 따라서 중요한 건강 우선 순위입니다. CKD는 항상성의 복잡한 derangements 특징 때문에, 통합 동물 모델은 CKD의 개발 및 진행을 연구 할 필요가있다. 신장은 서로 상호 작용하는 다른 세포 유형의 다양한으로 구성되어 있습니다. 이러한 복잡성은 체외에서 모방 할 수 없습니다.

CKD에 새로운 치료 개입을 연구하기 위해, 우리는 인간의 CKD 2,3의 여러 측면을 닮은 5/6th 절제 절제 모델, 진보적 인 신장 질환의 잘 알려진 실험 모델을 사용합니다. 신장 질량 총 감소는 진보적 인 사구체와 tubulo-간질 부상, 남은 네프론의 손실과 조직 및 사구체 고혈압의 개발을 발생합니다. 이 progr을과 연관되어essive intrarenal 모세관 손실 4, 염증과 사구체. 위험 요인은 결국 내피 세포 기능 5에 미치는 영향을 CKD. 우리는 CKD의 개발에 상대적으로 저항하는 쥐의 변형 (루이스)를 사용하기 때문에 우리는 산화 질소 (NO) 고갈 6, 7, 8, 높은 소금 다이어트 9에서 신장 질량의 5/6th의 제거를 결합했다. 도착 적응 한 후, 동물 이틀 후 L-NNA의 지속과 오른쪽면 uninephrectomy (UNX) 다음에 사주의 기간 동안 물 (20 ㎎ / L)을 첨가 NO 합성 효소 억제제 (L-NNA), 수신하지 . 일주일 후, 신장 질량의 2/3rds의 소계 절제 (SNX) 즉, 제거는 왼쪽에 수행됩니다. SNX 후, 동물을 4 주 동안 마시는 물에 20 ㎎ / L LNNA에 이어 다시 이틀 복구 할 수 있습니다. 지상 차우 (시간 선 그림 1 참조) 보충 높은 소금 다이어트 (6 %)을, 실험을하는 동안 계속됩니다. 티그는 오른쪽에 UNX을 수행 할 수있는 이성과 왼쪽에 SNX은 신장 혈관이 쉽게 신장이 신체 외부에 노출되었을 때 너무 많은 혈관을 스트레칭하지 않고 신장에 액세스 할 수 있습니다 왼쪽에 더 이상 것입니다 . 문학, 모델은 일주일 후 10,11,12 오른쪽 신장 UNX 다음, 왼쪽 신장의 극을 먼저 제거되는 설명되어 있습니다. 우리의 손이 모델은 신장 장애의 더 빠른 발전을 보였다, 또한 신장 기능의 손실에 훨씬 더 큰 변화. 신부전의 진행은 혈중 요소, 수축기 혈압과 단백뇨를 측정하여 시간이 지남에 따라한다. SNX 후 6 주까지, 신부전, 개발 사구체 여과 속도의 현저한 감소 (69 %)하고 효과적인 신장 플라즈마 흐름 (62 %) 13 고혈압 (수축기 혈압> 150 mmHg로), 단백뇨 (특징> 50 mg/24 HR) 및 가벼운 요독증 (> 10 MM). 조직 학적 특징은 tubul 포함오 - 간질 손상, 염증, 관 위축 및 섬유화와 나머지 인구 (<10 %)에서 건강 사구체의 대규모 감소로 이어지는 초점 사구체 경화증으로 반영됩니다. 후속 최대 12 주 후까지 SNX는 치료 개입의 평가를위한 기회의 창을 제공 CKD의 추가 진행을 보여줍니다.

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프로토콜

모든 실험은 위트레흐트 실험 동물위원회의 동물 실험 윤리 가이드 라인에 따라 실행됩니다. 프로토콜은 저자의 기관의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다.

CKD ~ 8 주 세의 나이에 남성 근친 루이스 쥐 (찰스 리버, Sulzfeld, 독일)에서 유도된다. 쥐 빛, 온도 및 습도 제어 환경의 표준 조건 하에서 보관되어 있습니다.

1. 수술 준비

  1. 수술기구를 소독 :
    • 1 학생 조직은 1-2 치아 12cm를 포셉
    • 1 학생의 표준 패턴 집게
    • 2 Semken 포셉
    • 1 마요 가위
    • 1 명 홍채 가위
    • 가위로 1 올슨-Hegar 바늘 홀더
    • 담요
  2. 재고 목록을 확인 :
    • 온난화 패드와 램프 테이블 운영
    • O 2, isoflurane을
    • 조직
    • 면도기
    • 저울
    • 무균 조작 세트
    • 멸균 거즈 5X5 및 10 × 10
    • 70 % 알코올
    • 0.9 % 염화나트륨 용액
    • 1 ML의 주사기
    • 바늘 (25G)
    • 젤 폼 패드 : spongostan
    • Vicryl 4.0 및 5.0
    • 부 프레 노르 핀 0.03 ㎎ / ㎏ (1:10 생리 소금에 희석)
    • 수술 후 쥐 깨끗한 케이지

2. 오른쪽 Uninephrectomy

  1. 70 % 알코올로 테이블을 소독.
  2. 장소는 유도 상자에 쥐 4 % isoflurane을하고 O 2 1 리터의 흐름으로 마취를 유도. 주 : 사용 된 쥐의 변형에 따라 사전 및 수술 진통제를 처방, 지역 수의사와상의이 필요.
  3. 원뿔 테이블과 장소 코 쥐를 전송합니다. 쥐와 코 콘은 쥐의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치됩니다. 쥐 I들 O 2 isoflurane을하고 1리터 2 %의 혼합물로 환기.
  4. 쥐의 측면을 면도하고 알코올로 소독. 세척 및 소독 손을 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 머리 모자와 마스크를 착용하십시오. 만들기 1 - 1.5 cm의 절개 병렬 해부 집게와 무딘 가위를 사용하여 갈비뼈합니다. 등 근육의 무딘 절개하여 신장을 노출합니다.
  5. 신장의 하부 극 볼 수 있습니다,주의 신 주위 지방 조직을 그립에있는 작은 무딘 집게를 사용합니다. 부드럽게 집게로 신 주위 지방을 당겨 신장을 구체화. 이 절차를 수행하는 동안 부신을 방해하지 않도록주의하십시오. 부신 쉽게 지방 조직에서 중간 사이트에 집게를 배치하여 제거하고 부드럽게 부신과 그림 2로 신장 사이의 위쪽으로 이동할 수 있습니다.
  6. 가제 지방과 결합 조직을 둘러싼 명확한 부드럽게 신장을 놓습니다. 신장 동맥과 정맥을 확인하고 합자 (5.0 배치vicryl) 혈관 주위에 하나의 매듭하지만, 매듭을 묶을하지 않습니다.
  7. 신장과 매듭 사이의 공간을 만들기 위해, 약 0.5 cm가 대동맥쪽으로 혈관을 따라 조심스럽게 느슨한 매듭을 이동합니다. 이 절단 후에 떨어져 미끄러지는 합자을 방지하기 위해 수행됩니다.
  8. 두 배 매듭으로 매듭을 묶어. 혈류가 중단되는 경우, 신장의 색은 바로 갈색으로 변경됩니다. 합자의 끝을 절단하지 마십시오.
  9. 신장에 가까운 신장 혈관을 차단하고 신장을 제거합니다. 부드럽게 신장 혈관의 출혈을 확인하는 합자의 긴 끝냅니다. 끈은 선박에 그 자리에 체재한다. 합자의 긴 끝을 잘라. 참고 남은 신장 혈관 즉시 복강에 철회 할 것이다.
  10. 얼룩 절제 신장 건조하고 무게.
  11. Vicryl 5.0에 봉합을 실행하는 골격 근육 절개를 닫습니다. 뒷다리에 0.10 ML (0.03 ㎎ / ㎏) 부 프레 노르 핀 메신저를 주입. 를 닫습니다피내 봉합 Vicryl 4.0 피부. 이 상처를 열지 쥐를 방지 할 수 있습니다. 참고 : 루이스 쥐에서 호흡 저하로 인해, 우리는 단지 isoflurane을을 전환하기 전에 수술 후 진통을 제공합니다.
  12. 음식과 물에 쉽게 접근 할 수있는 깨끗한 독방 케이지의 쥐를 집입니다. 온난화 패드 O / N에 케이지 절반을 놓고 조심스럽게 쥐 다음날 확인합니다. 상처가 닫혀 있고 쥐가 수술 후 6 ~ 12 시간 사이에 일반적입니다, 활성화 될 때, 쥐가 그룹 하우징에 다시 배치 할 수 있습니다.

3. 왼쪽 소계 절제

  1. 7 일 후에 같은 준비가로 2.1에서 2.5에 설명 된 오른쪽 측면으로 왼쪽에 만들어집니다. 수술 전, 오른쪽 신장의 무게의 약 2/3rds에 해당 제거해야 신장 조직의 양이 계산됩니다. 수술 전 젤 거품의 작은 조각 (Spongostan, 존슨 앤 존슨, 뉴저지) 준비합니다.
  2. 왼쪽 신장의 상단 기둥 주위에 날카로운 가위를 배치 한 뇌졸중 (가위 위치를 그림 3 참조) 상부 기둥을 잘라 내다. 젤 거품의 조각으로 즉시 뚜껑을 덮고 멸균 거즈와 가벼운 압력을 발휘.
  3. 3.3에서와 같이 신장의 하부 극 반복합니다.
  4. 피부에 혈액 응고 방지하기 위해 신장을 올립니다. 출혈이 멈출 때까지 멸균 거즈로 젤 거품 패드 모두에서 가벼운 압력을 유지합니다. 출혈이 지속되면 다른 폼 패드를 추가합니다.
  5. 복부 안쪽에 부착 젤 거품 패드로 남은 신장을 놓습니다. 근육과 피부를 닫고 2.9-2.12를 따릅니다.

4. 가짜 수술

  1. 가짜 작동 컨트롤은 신장을 노출하기 위해 동일한 절차를 겪는다. 대신 신장 extirpating 또는 일주일 후 채를 절단, 신장 모두 부신 분비를 방해하지 돌보는, 일주일 간격으로 캡슐화가 있습니다. 상처 봉합 수술 후 관리는 ID이다2.11와 2.12에 entical.

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결과

부분합을 절제 한 후, 총 신장 질량의 약 1/6th이 남아 있습니다. 그림 4는 이전의 두 실험에서 평균과 ​​표준 편차의 오른쪽 신장 제거 된 부품의 무게를 보여줍니다. 하나는 UNX 후 주에, 왼쪽 신장의 비대가 발생하는 것을 염두에 두어야한다 나타내는 것을 5/6th 제거 미만 오른쪽 신장 항상 결과의 무게에 근거하여 산출 제거해야합니다 무게. 이 수술 중 좌측 신장의 무게를 결정하는 것이 가능하지 않기 때문에 그러나, 이것은 원래 신장 질량의 약 5/6th을 제거하는 가장 정확한 방법입니다.

시간이 지남에 따라 CKD를 가진 쥐 고혈압, 요독증, 빈혈, 단백뇨 및 GFR과 ERPF에 상당한 감소를 개발할 수 있습니다. 6 주 이후 설립 CKD는 구조 개입을 테스트 할 시간이 시점 적합한을 개발했습니다. 시간이 지남에 고혈압과 단백뇨의 강한 진행을 관찰하면서 헤마토크리트신장 기능 (GFR과 ERPF) 가벼운 저하 (그림 5)...

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토론

높은 소금 다이어트 및 임시 NOS 억제와 결합 루이스 쥐에서 신장 질량의 5/6th의 외과 제거는 인간의 CKD 유사한 CKD의 모델에 이르게 및 CKD의 치료 개입의 인과 관계 메커니즘과 효능을 연구 할 수 있습니다.

5/6th의 절제 모델은 CKD에 대한 잘 알려진 광범위하게 설명하는 모델입니다. 그러나 단순히 신장 질량의 5/6th을 제거하면 모든 쥐의 변종 즉시 신부전으로 이어질하지 않습니다. 우리는 GFP + 루이스 쥐 21의 가용성으로 CKD에있는 세포 기반 치료의 효과를 연구하기 위해 루이스 쥐를 사용하여받는 사람의 관리 기증자 세포의 세포 추적 (nonGFP +) 쥐 수 있습니다. 루이스 쥐 속도가 느린 다른 변종 22, 15에 비해 신장 손상 및 CKD의 개발의 개발에 상대적으로 저항한다. 이 인간 CKD의 여러 측면과 유사 이래 그러므로 우리는 NO 고갈과 높은 소금 다이어트 신장 질량의 5/6th...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

우리는 그녀의 우수한 기술 지원을 크리스타 서재 Ouden 감사합니다. 이 기술은 재정적 네덜란드의 신장 재단 보조금 C06.2174에 의해 지원되었다. MCV는 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO) 비디 - 부여 016.096.359에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
   <강한>시약
L-NNA시그마-알드리치N5501 
Spongostan dental : 젤 폼 패드 1x1x1 cmJohnson & 존슨Ms0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
부프레노르핀 (0.3 mg/ml)현지 약사를 통해 Reckitt Benckiser 제약사에서 주문한수 없음 
   <강한>장비
학생 조직 집게 - 1x2 치아 12cm미세 과학 도구(FST)91121-12 
학생 표준 패턴 펜치FST91100-12 
메이요 가위FST14010-15 
2X 셈켄 펜치FST11008-13 
학생 홍채 가위FST91460-11 
Olsen-Hegar 바늘 홀더FST12002-14 

알

참고문헌

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