마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Summary

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

Abstract

신경절 세포는 망막의 출력 뉴런하고 그들의 활동은 특정 신경 회로에서 발생하는 여러 시냅스 입력의 통합을 반영합니다. 전압 클램프 전류 클램프 구성에서 패치 클램프 기술은, 일반적으로 신경 세포의 생리적 특성을 연구하고, 자신의 시냅스 입력을 특성화하는 데 사용됩니다. 이러한 기술의 응용 프로그램이 매우 유익하지만, 그들은 여러 가지 한계를 포즈. 예를 들어, 흥분성과 억제 입력의 정확한 상호 작용이 응답 출력을 결정하는 방법 정량화하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 전도 클램프 ^{1, 2, 3이라는} 수정 된 전류 클램프 기법, 동적 클램프를 사용하고 신경 세포의 흥분에 흥분성과 억제 시냅스 입력의 영향을 조사 하였다. 이 기술은 셀에 현재의 주입을 필요로 그 당시의 막 잠재력의 실시간 피드백에 따라 달라집니다. injecteD 전류가 소정의 흥분성과 억제 시냅스 컨덕턴스, 자신의 반전 잠재력과 세포의 순간 막 잠재력에서 계산됩니다. 실험 절차에 대한 자세한 내용은, 동적 클램프 기법의 전체 셀 구성과 고용을 달성하기 위해 세포를 클램핑 패치는이 비디오 문서에서 설명된다. 여기, 우리는 통제 조건이나 약물의 존재 생리 실험에서 얻은 다양한 전도 파형 마우스 망막 신경절 세포의 반응을 보여줍니다. 또한, 우리는 세포의 반응을 조사하기 위해 알파 함수를 사용하여 생성 된 인공 흥분성과 억제 컨덕턴스의 사용을 보여줍니다.

Introduction

망막은 안구의 뒤쪽을 안감에 가까운 투명한 신경 조직이다. 많은 연구는 첫 번째 영상 처리 단계와 시냅스 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 모델로 망막을 사용합니다. 전체 마운트 준비 망막 네트워크 절개 후 그대로 남아 있기 때문에, 그것의 생리적 반응은 생체 내 조건에서 매우 유사로 시냅스 상호 작용을 연구하는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 따라서, 그 뉴런의 속성이 패치 클램프 기술 (테크닉에 대한 리뷰를 들면, ^{6,9,13 참조)를} 사용하여 연구 할 수있는 격리 된 망막을 사용하여. 약물 에이전트가 여러 사이트에 행동으로 특정 회로와 신경절 세포 반응에 신경 전달 물질의 정확한 공헌의 확인은, 그러나, 일반적으로 방해합니다.

빛에 망막 신경 세포의 생리적 반응, 자연 자극, 세포 내 액체로 가득 유리 피펫과 함께 기록 할 수 있습니다. 패치 CL을 사용하여앰프 기술, 빛의 자극에 신경 반응은 막 전위 변동 (현재 클램프) 또는 전류 (전압 클램프)로 기록 할 수 있습니다. 다른 전압에서 막 잠재력을 보유하고 사후 전도성 분석을 구현하여, 그것을 억제 및 흥분성 시냅스 입력하기 ^5,12를 분리 할 수 있습니다. 실험의이 유형은 일반 목욕 ​​중간에 다른 신경 전달 물질과 신경 반응에 대한 수용체의 기여를 분리하는 다른 약물 에이전트의 존재에서 수행 할 수 있습니다. 많은 실험실에서 연구의 풍부한 급상승 출력과 자극의 크기와 같은 속성, 명암, 공간과 시간적 주파수, 방향, 방향 및 기타 자극 변수에 대한 흥분성과 억제의 입력 의존도를 특징. 이 실험 방법은 스파이크 출력과 자극 특성의 함수로서 시냅스 입력 사이의 관계에 대한 정보를 제공하지만은,세포의 흥분에 특정 세포 유형과 시냅스 입력의 기여의 해석은 간단하지 않습니다. 이는 일반적으로 흥분성과 억제를 모두 입력이 자극 특성에 따라 다양하기 때문에, 그것은 이러한 입력 중 하나의 변화가 신경 세포의 스파이크에 미치는 정확한 영향을 평가하는 것은 불가능하기 때문이다.

이러한 제한을 우회 할 수있는 다른 방법은 출력을 급상승 개별 시냅스 입력의 공헌의 중요한 평가를 허용 동적 클램프 레코딩을 수행하는 것입니다. 동적 클램프 기법은 셀에 전류를 직접 주입 할 수 있으며 주어진 시간에 전류 주입의 양이 그 시간 ^1,2,3 (검토를 위해, ^{7,14 참조)에} 기록 된 막 잠재력에 따라 달라집니다. 그것은 수정 된 전류 클램프 셋업입니다 녹음 아래 셀 특수 하드웨어를 구성하는 장비, 소프트웨어 사이의 실시간, 빠른 피드백의 상호 작용그리고 컴퓨터가 달성된다. 셀에 전류 주입의 양이 따라 계산됩니다. 따라서,이 방법의 장점은 셀이 전도 파형의 다른 조합으로 자극 할 수 있고, 그 반응은 시냅스 입력을 중재하는 수용체의 활성화를 모방하는 것입니다. 예를 들어, 작은 장소에 대한 흥분 전도의 주입에 대한 응답과 작은 스폿 흥분성과 억제 컨덕턴스의 주입 반응의 비교는 세포 반응에 대한 억제의 영향에 대한 정보를 제공합니다. 마찬가지로, 생리 학적 기록 컨덕턴스의 다른 조합은 스파이크 출력에 영향을주는 방법에 자극 따라 흥분성 및 / 또는 억제 컨덕턴스의 변화에​​ 공개하는 공동 주입 할 수 있습니다.

본 연구에서는 동적 클램프 기술은 상대적으로 진폭과 망막 신경절 세포의 발화 특성에 시냅스 입력 타이밍의 영향을 설명하는 데 사용됩니다. 다양한 컨덕턴스제어 상태 또는 약물 에이전트의 존재 생리 실험에서 얻은 입력으로 고용되었다. 또한, 알파 기능에 따라 인공 컨덕턴스는 시냅스 입력이 뉴런으로 통합하는 방법을 조사하기 위해 사용되었다. 따라서이 전도의 다양한 종류가 약리학이나 계산 같은 신경절 세포에 주입하는, 어느 생리적 생성이 입력에 대한 응답이 너무 비교가 될 수 있도록하는 다양한 기술입니다.

Protocol

1. 일반 설정 및 조직 준비

1. 30 분 (의 스트레스 수준을 줄이기 위해 목표)를 위해 어둠 속에서 마우스를 유지합니다. 기다리는 동안, 세포 용액 1 L를 준비합니다. 첫 번째 밀리 Q 물 반 리터에 탄산 수​​소 나트륨 1.9 g을 용해. 의 pH는 95 % O ₂ 5 % CO _2와 버블 링에 의해 7.4로 유지됩니다. 5 분 후, 밀리 Q 물과 1 L까지 정상, 중탄산 나트륨 용액에 추가 밀리 Q 물 100 ㎖에 에임스 보통 8.8 g을 녹이고 잘 섞는다. 실험의 나머지 carboxygenated이 솔루션을 유지한다.
2. carboxygenated 에임스 보통 250 mL를 취하여 전기 생리학의 유체 재관류 시스템을 셋업 설정합니다. 솔루션 carboxygenated 유지한다.
3. 균일하게 얼룩 재관류 챔버의 바닥 위에 진공 그리스의 얇은 층을. 커버 슬립으로 밀봉하고 공기 꽉 있는지 확인합니다. 그리스 (직경 1 ~ 2 ㎜)의 소량을 가지고 정상에 위치하고하단 챔버의 끝. 이 공 장소에서 그리드 (백금 프레임 치실로 묶인)를 보유하고 망막에 너무 열심히 눌러 방지 할 수 있습니다. 플랫폼에 챔버를 고정하고 두 구멍을 맞 춥니 다.
4. 동물 자궁 전위에 의해 희생 후 2 분, 그리고에 대한 isoflurane을 우선으로하는 마취입니다. 빨리 작은 가위 (곡선 블레이드)의 한 쌍의 눈을 제거 carboxygenated 세포 외액으로 가득 페트리 접시에 배치 한 다음 작은 비커에 carboxygenated 세포 외액 깨끗이 씻어.
5. 해부 현미경, 19 게이지 바늘을 사용하여 각막에 삽입 구멍 (가장자리에서 1 ~ 2 ㎜)합니다. 다른 아이에 대해 반복합니다. 이 중요한 단계는 모두 망막의 산소를 허용하는 신속해야한다. 의 가장자리에 평행하게 절단하여 홍채 가위의 작은 쌍을 하나의 각막을 제거합니다. 다음으로, 미세 집게 한 쌍의 조리개와 렌즈를 제거합니다. 다른 아이에 대해 반복합니다. 포함하는 비이커에 한 아이 컵을 전송세포 솔루션을 carboxygenated.
6. 메스 블레이드, 전체 마운트를 평평하게하고 망막 당 두 개의 전체 - 마운트를 얻을 수 있도록, 반에 한 아이 컵을 잘라. 무뚝뚝한 해부 프로브를 사용하여 색소 상피 나 가볍게 닦아내 당겨 망막을 조심스럽게 분리합니다. 일단 분리, 망막은 매우 투명합니다. 볼록한 표면은 광 수용체 측에 참고. 오목한 표면은 신경절 세포 측면이며 끈적 유리체 유머의 존재로 인해 자체에 붙어 있습니다.
7. 미세 집게 한 쌍, 오라 세라로 분리 된 망막 조직 주변의 가장자리를 잡고 미세 집게의 또 다른 쌍 오라 세라를 잡아, 망막의 중심을 향해 당겨. 이 과정은 정교한 절차이며 몇 가지 시도 걸릴 수 있습니다. 성공하면 ORA 참나무, 모양체 및 유리체 유머는이 프로세스에 의해 제거되고 망막의 곡률 (즉, 아첨) 감소된다.
8. 가장자리를 트리밍하고 당에 전송위로 향 신경절 세포와 융합 챔버. 그리스 공에 그리드를 배치하여 장소에 조직을 누릅니다. 나중에 사용하기 위해 다른 아이 컵과 나머지 조직을 놓습니다. 망막 박리에 대한 유사한 절차 미들과 Protti ¹⁶ Pottek 등으로 설명되어 있습니다. ^17.
9. 직립 현미경으로 녹음 챔버를 장착합니다. 5 ML / 분 - 즉시 3의 비율 carboxygenated 세포 용액 (35.5 ° C)와 망막의 지속적인 관류를 설정합니다. 접지 전극이 제자리에 있는지 확인하십시오.
10. 현미경에 부착하면 조직의 시각화를 허용하는 디지털 카메라입니다. 전체 세트는 최대 공기 테이블 (충격 흡수) 이상과 패러데이 케이지 (블록 외부 정적 및 비 정적 전기 분야) 내부에 앉아있다.
11. 광원 (적외선,> 850 nm의)와 40X 목적으로 켜고, 신경절 세포의 세포 기관에 초점을 가져온다. 녹화기에 대한 전체 마운트의 중심 지역 찾기땡.
12. 제상 K의 고정 된 유리 병 ⁺ 기반의 세포 내 용액 (300 μL, pH가 = 7.4) 포함 (단위 : mm) K-글루코 : 140, HEPES 산 : 10, MgCl ₂ 4.6 ATP-나 ⁺ 4, GTP-나 ⁺ : 0.4 EGTA : 10. 모든 시약은 시그마 - 알드리치에서 구입했습니다.

2. 망막 신경절 세포의 패치 세포 기관

1. 먼저 불이 붕규산 유리 모세관 튜브의 끝을 연마 한 후 두 개의 가열 단계 (- MΩ 8 5 저항)와 유리 미세 전극 풀러와 함께 그들을 잡아 당깁니다.
2. 세포 내 용액에 루시퍼 노란색의 3 μL (최종 농도 0.2 %)를 추가, 잘 혼합하고 원심 분리기. 다음으로, 30 G 재사용 피하 주사 바늘을 ​​한 후, 1 ML의 주사기로 솔루션의 최고 85 %를 전송할 0.22 μm의 F 조 ilter 장치에 연결합니다. 냉장.
3. 홀더에서 레코딩에 사용되는 것과 유사한 팁 크기, 유리 피펫을 수정하고 micromanipula를 사용하여 현미경 아래로 이동토르. 그것은 내 경계 막 표면에 작은 보조개를 할 때까지 40X 목표 아래, 천천히 피펫을 낮 춥니 다. 그것은 조직의 작은 금액을 잡는다까지 천천히 피펫을 진행하고 신경절 세포의 세포 기관을 노출하는 작은 구멍을 찢어 위로 및 / 또는 옆으로 이동합니다. 작은 구멍, 이상이 망막 네트워크의 무결성 수준이 유지됩니다. 원하는 경우, sulforhodamine 101 (SR101, 0.5-1 μM) 형광 현미경에 ^15을 사용하여 손상된 신경 레이블을 세포 매체에 추가 할 수 있습니다.
4. 세포 내 용액 10 μL - 8로 깨끗한 피펫을 입력합니다. 앰프의 머리 스테이지에 부착 된 홀더에 삽입하고 염소화 실버 염화물 전극이 침수되어 있는지 확인합니다. 만약 먼지 및 / 또는 공기 거품은 / 존재 버린다.
5. 모든 장비를 켭니다. 우리는 전압 클램프 사기꾼에서 전체 셀 녹음을 달성하기 위해 PatchMaster에 의해 통제 EPC 8 패치 클램프 증폭기를 사용하여형상. 고속 모드에서 전류 클램프 녹음 할 수 있도록 다른 앰프도 사용할 수 있습니다. 피펫 용액에 긍정적 인 압력을 적용하고 유지합니다. 오히려 난민 무 축삭 세포 또는 아교 세포보다 신경절 세포 그래서 가장 가능성이 큰 세포체와 셀을 선택합니다. 천천히가 막 표면에 작은 보조개를 만드는, 그래서 피펫 팁을 낮출 중지하고 압력을 놓습니다. 60 MV - 즉시에 개최 가능성을 낮 춥니 다. gigaseal (GΩ)가 그들 사이에 달성되면, 조심스럽게 전체 세포 패치 클램프 구성을 달성하기 위해 멤브레인을 깰 빨아. 이 절차는 너무 많은 부정적인 압력이 적용되는 경우, 연결이 새는되고 섬세한 작업이며 너무 작은 경우, 멤브레인이 그대로 유지됩니다.
6. 시간이 지남에, 루시퍼 노란색은 세포의 형태를 시각화 수 있도록 셀을 채울 것입니다. 안정되어있는 경우,이 설정 최대 30 분 이상 지속해야한다.

3. Dynami를 사용하여 신경절 세포의 기록C 클램프

1. 첫째, 전류 - 전압 테스트 (에서 - 75 + 35 MV 매 10 mV 범위)이 PatchMaster를 사용하여 실행됩니다. 큰 나는 ⁺ 전류 (> 1 NA)있는 경우에만 나중에 시험을 진행합니다. 난민 무 축삭 세포가 패치 드문 경우에, 그 경우, 이후 현재 주사 행동 잠재력의 기차에 응답하지 않습니다 유의하십시오.
2. 오픈 LabVIEW와 사용자 정의 서면 Neuroakuma 프로그램을 실행 다음, 다양한 전도 파형을로드합니다. 8 (- 8 통계적 목적을 위해 6)을 반복 번호를 설정합니다. 각각 75 MV - 0에서 흥분성과 억제 컨덕턴스의 반전 잠재력을 설정합니다. 테스트 흥분성과 억제 컨덕턴스 중 하나와 일치하는 쌍을 선택합니다. 흥분성 전도성 트레이스 (녹색) 및 억제 전도성 트레이스 (빨간색) 하단 패널에 표시됩니다.
3. 다시 PatchMaster로 이동 현재 클램프 모드를 선택, 바로 'CC + 통신 FAST'현재 클램프 모드로 앰프를 전환합니다. 이 모드는 ACC 할 수 있습니다urately 막 전위의 급격한 변화를 따릅니다. 막과 피펫 사이 좋은 물개가 유지되는 경우, 거의 / 전혀 보정이 필요하지 않습니다, 그렇지 않으면 녹음이 오래 지속되지 않습니다. Neuroakuma에서 "레코드"버튼을 누릅니다. 세포 반응은 (일반적으로 행동 잠재력의 phasic 버스트 그림 1A)와 상단 패널에 나타납니다. 작은 / 응답이 관찰되지 않는 경우가 강한 응답을 생성 할 때까지 작은 단위로 증가, 처음 컨덕턴스 낮은 스케일링 셀에 전류를 주입. 과도한 전류가 주입 세포를 죽일 수 있습니다. 일단 테스트가 완료되어, 전도성 파형의 새로운 쌍을 선택 생리적, 인공 컨덕턴스의 모든 쌍 이상 반복합니다. 실시간으로 주입 생리 전류 (I)를 기반으로합니다 :
   I (t) = G _당일 (T) × (V _m (T) - V _당일) + G _INH (T) × (V _m (T) - V _INH)

컨덕턴스 (NS에서 G) 싸이가 될 수naptic 또는 인공. 흥분성과 억제 성 시냅스 전도 파형 (TTX, 1 μM) 제어 상태에서 다른 시각적 자극에 반응하고 테트로도톡신의 존재 Protti, 디 마르코, 황, Vonhoff, 구엔과 솔로몬 (미발표 결과)에 의해 수행 이전의 실험에서 수집 된 . 인공 전도 파형은 알파 기능을 사용하여 모델링 하였다. V _m은 (MV)에 기록 막 잠재력이다. V _EXC와 V _INH는 각각 흥분성과 억제 컨덕턴스의 반전 가능성을 나타내는 반면 G _EXC와 G _INH는 각각 흥분성과 억제 컨덕턴스를 나타냅니다. 시간은 밀리 t이다. 샘플링 속도가 40 kHz입니다.
I _S = I ₀ (t / α) ^E-αT

위의 방정식은 알파 기능 (, 전류의 피크 1 / α = 시간 (초 ^-1) I ₀ = 최대 전류)입니다. 상승 시간과 시냅스의 감쇠 시간현재는 α ^4에 의해 결정됩니다. 억제 전도의 지연이 여기의 시작 (그림 2D)를 기준으로 지연을 감소 바뀌 었습니다 동안 흥분 전도는 불변이었다.

4. 세포의 몸이 그대로 유지되도록 녹음 한 후, 조심스럽게 피펫을 철회. 즉시 인산염 완충액 0.1 M 세 10 분 세척 한 다음 30 분에 대한 4 % 파라 포름 알데히드의 조직을 고정합니다. 냉동 다음과 같은 일 또는 주 이내에 염색 항체를 수행합니다.

4. 루시퍼 노란색 채워진 망막 신경절 세포에 대하여 항체 염색

1. 차 염소 안티 - 토끼 IgG를 (희석 = 1:500로 여섯 번째 날에, 하룻밤 염색, 상온에서 루시퍼 노란색 가득 신경절 세포 (5 일 기본 안티 - 루시퍼 노란색 토끼 IgG를 (희석 = 1:10,000)에 대한 항체 염색 )). 형광 보존 매체에 망막을 탑재 젖은. 손톱 P와 함께 미끄러 인감 커버olish.
2. 라이카 사양-II 공 촛점 현미경 (그림 1B)를 사용하여 세포 형태의 공 초점 사진을 촬영합니다. 축삭의 존재는 신경절 세포의 확인을 할 수 있습니다.

Results

신경절 세포 반응을 억제 입력의 다른 소스의 기여도는 다양한 전도 파형의 응용 프로그램을 통해 설명된다. 이 파형은 정상 조건에서 차단 동작 만 억제 망막의 interneurons의 일부 잠재적 인 세대. 그림 2A는 주입에 대한 대표적인 반응을 보여주는 TTX, 전압 게이트 나 ⁺ 채널 차단제의 면전에서 서로 다른 밝기의 자극으로 하였다 흥분성과 억제 전도 파형은 정상 상태에서 회색 배경에 작은 검은 반점과 자극에 대한 응답으로 기록했다. TTX의 면전에서 다른 크기의 검은 반점 얻은 전도성 파형이 동일한 셀에 주입되었을 때, 단지 약한 반응 (그림 2B) 관찰되었다.

그림 2C 여러 쌍의 주입에 다른 신경절 세포의 반응을 보여줍니다전도 파형 된 컨트롤 흥분성과 억제 전도의 비율은 (: G _{INH 비율} : 1시부터 1시 2분까지 G _EX...

Discussion

여기에서 우리는 비와 여기와 망막 신경절 세포의 출력 억제의 상대적 타이밍의 영향을 평가하는 동적 클램프의 사용을 보여줍니다. 동적 클램프는 살아있는 신경 세포에 생리 학적 기록 또는 인공 시냅스 컨덕턴스를 소개하는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용합니다. 이 방법은 컨덕턴스가 수정 및 신경 반응에 미치는 영향을 계산하는 신경 세포에 주입 할 수있는 대화 형 도구를 제공합니다. 전도 파형을 시각적 자극은 통제 조건에서 특정 셀 또는 회로의 기여를 분리하는 약리 대리인의 면전에서 광 수용체를 활성화하는 데 사용되는 실험에서 얻을 수 있습니다. 이러한 전도 파형의 다른 조합의 주입은 출력을 급상승에 기여를 보여준다. 동적 클램프 녹음의 사용은 또한 다른 빛 적응 conditio를 아래의 장소를 걸릴 수 있습니다 배경 소음의 수준의 조작을 가능 NS. 또한, 전도성 파형 또한 알파 기능과 같은 시냅스 입력의 모델에서 생성, 또한 전압 의존성 (즉, NMDA 수용체)뿐만 아니라 전압 문이 이온 채널이나 전기적 결합 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< 강> 시약
이소 플루란 흡입 마	Pharmachem
Ames 매체 L- 글루타메이트 (분말)	시그마 - 알드리치
글루콘산 칼륨, 무수	시그마 - 알드리치
HEPES 나트륨 염	시그마 알드리치
염화 마그네슘 용액 ( 4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin– 틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산	시그마-알드리치
파라포름알데히드 분말, 95%	시그마-알드리치
안티 루시퍼 옐로우, 토끼 IgG 분획(3mg/ml)	인비트로겐
알렉사 플루오르 594 염소 안티-래빗 IgG(H+L) 2mg/ml	인비트로겐
형광 보존 매체	BioFX 연구소 Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	워너 인스트루먼트	64-0794
싱글 스테이지 글라스 Micr– lectrode 풀러	Narishinge 일본	모델 PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μ m Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock 재사용 가능한 피하 주사 바늘: 30 G	Smith Nephew (Australia)
단일 인라인 솔루션 히터	Warner Instruments	모델 SH-27B
이중 자동 온도 컨트롤러	Warner Instruments	TC-344B
Olympus 실체 현미경 SZ61	Olympus 주식회사
올림푸스 현미경 BX50WI: 40X 대물	렌즈 올림푸스 코퍼레이션
0-30 V 2.5 A DC 전원 공급 장치	Dick Smith Electronics	Q1770
디지털 현미경 카메라 ProgResMF 쿨	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	셔터 계기 회사
패치 클램프 증폭기 EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 데이터 수집 시스템	HEKA Elektronik
컴퓨터: DELL	Dell Corporation