이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경절 세포는 망막의 출력 뉴런하고 그들의 활동은 특정 신경 회로에서 발생하는 여러 시냅스 입력의 통합을 반영합니다. 전압 클램프 전류 클램프 구성에서 패치 클램프 기술은, 일반적으로 신경 세포의 생리적 특성을 연구하고, 자신의 시냅스 입력을 특성화하는 데 사용됩니다. 이러한 기술의 응용 프로그램이 매우 유익하지만, 그들은 여러 가지 한계를 포즈. 예를 들어, 흥분성과 억제 입력의 정확한 상호 작용이 응답 출력을 결정하는 방법 정량화하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 전도 클램프 1, 2, 3이라는 수정 된 전류 클램프 기법, 동적 클램프를 사용하고 신경 세포의 흥분에 흥분성과 억제 시냅스 입력의 영향을 조사 하였다. 이 기술은 셀에 현재의 주입을 필요로 그 당시의 막 잠재력의 실시간 피드백에 따라 달라집니다. injecteD 전류가 소정의 흥분성과 억제 시냅스 컨덕턴스, 자신의 반전 잠재력과 세포의 순간 막 잠재력에서 계산됩니다. 실험 절차에 대한 자세한 내용은, 동적 클램프 기법의 전체 셀 구성과 고용을 달성하기 위해 세포를 클램핑 패치는이 비디오 문서에서 설명된다. 여기, 우리는 통제 조건이나 약물의 존재 생리 실험에서 얻은 다양한 전도 파형 마우스 망막 신경절 세포의 반응을 보여줍니다. 또한, 우리는 세포의 반응을 조사하기 위해 알파 함수를 사용하여 생성 된 인공 흥분성과 억제 컨덕턴스의 사용을 보여줍니다.
서론
망막은 안구의 뒤쪽을 안감에 가까운 투명한 신경 조직이다. 많은 연구는 첫 번째 영상 처리 단계와 시냅스 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 모델로 망막을 사용합니다. 전체 마운트 준비 망막 네트워크 절개 후 그대로 남아 있기 때문에, 그것의 생리적 반응은 생체 내 조건에서 매우 유사로 시냅스 상호 작용을 연구하는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 따라서, 그 뉴런의 속성이 패치 클램프 기술 (테크닉에 대한 리뷰를 들면, 6,9,13 참조)를 사용하여 연구 할 수있는 격리 된 망막을 사용하여. 약물 에이전트가 여러 사이트에 행동으로 특정 회로와 신경절 세포 반응에 신경 전달 물질의 정확한 공헌의 확인은, 그러나, 일반적으로 방해합니다.
빛에 망막 신경 세포의 생리적 반응, 자연 자극, 세포 내 액체로 가득 유리 피펫과 함께 기록 할 수 있습니다. 패치 CL을 사용하여앰프 기술, 빛의 자극에 신경 반응은 막 전위 변동 (현재 클램프) 또는 전류 (전압 클램프)로 기록 할 수 있습니다. 다른 전압에서 막 잠재력을 보유하고 사후 전도성 분석을 구현하여, 그것을 억제 및 흥분성 시냅스 입력하기 5,12를 분리 할 수 있습니다. 실험의이 유형은 일반 목욕 중간에 다른 신경 전달....
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프로토콜
1. 일반 설정 및 조직 준비
- 30 분 (의 스트레스 수준을 줄이기 위해 목표)를 위해 어둠 속에서 마우스를 유지합니다. 기다리는 동안, 세포 용액 1 L를 준비합니다. 첫 번째 밀리 Q 물 반 리터에 탄산 수소 나트륨 1.9 g을 용해. 의 pH는 95 % O 2 5 % CO 2와 버블 링에 의해 7.4로 유지됩니다. 5 분 후, 밀리 Q 물과 1 L까지 정상, 중탄산 나트륨 용액에 추가 밀리 Q 물 100 ㎖에 에임스 보통 8.8 g을 녹이고 잘 섞는다. 실험의 나머지 carboxygenated이 솔루션을 유지한다.
- carboxygenated 에임스 보통 250 mL를 취하여 전기 생리학의 유체 재관류 시스템을 셋업 설정합니다. 솔루션 carboxygenated 유지한다.
- 균일하게 얼룩 재관류 챔버의 바닥 위에 진공 그리스의 얇은 층을. 커버 슬립으로 밀봉하고 공기 꽉 있는지 확인합니다. 그리스 (직경 1 ~ 2 ㎜)의 소량을 가지고 정상에 위치하고하단 챔버의 끝. 이 공 장소에서 그리드 (백금 프레임 치실로 묶인)를 보유하고 망막에 너무 열심히 눌러 방지 할 수 있습니다. 플랫폼에 챔버를 고정하고 두 구멍을 맞 춥니 다.
- 동물 자궁 전위에 의해 희생 후 2 분, 그리고에....
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결과
신경절 세포 반응을 억제 입력의 다른 소스의 기여도는 다양한 전도 파형의 응용 프로그램을 통해 설명된다. 이 파형은 정상 조건에서 차단 동작 만 억제 망막의 interneurons의 일부 잠재적 인 세대. 그림 2A는 주입에 대한 대표적인 반응을 보여주는 TTX, 전압 게이트 나 + 채널 차단제의 면전에서 서로 다른 밝기의 자극으로 하였다 흥분성과 억제 전도 파형은 정상 상태에서 회색 배경에 작은 검은 반점과 자극에 대한 응답으로 기록했다. TTX의 면전에서 다른 크기의 검은 반점 얻은 전도성 파형이 동일한 셀에 주입되었을 때, 단지 약한 반응 (그림 2B) 관찰되었다.
그림 2C 여러 쌍의 주입에 다른 신경절 세포의 반응을 보여줍니다전도 파형 된 컨트롤 흥분성과 억제 전도의 비율은 (: G INH 비율 : 1시부터 1시 2분까지 G EX.......
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토론
여기에서 우리는 비와 여기와 망막 신경절 세포의 출력 억제의 상대적 타이밍의 영향을 평가하는 동적 클램프의 사용을 보여줍니다. 동적 클램프는 살아있는 신경 세포에 생리 학적 기록 또는 인공 시냅스 컨덕턴스를 소개하는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용합니다. 이 방법은 컨덕턴스가 수정 및 신경 반응에 미치는 영향을 계산하는 신경 세포에 주입 할 수있는 대화 형 도구를 제공합니다. 전도 파형을 시각적 자극은 통제 조건에서 특정 셀 또는 회로의 기여를 분리하는 약리 대리인의 면전에서 광 수용체를 활성화하는 데 사용되는 실험에서 얻을 수 있습니다. 이러한 전도 파형의 다른 조합의 주입은 출력을 급상승에 기여를 보여준다. 동적 클램프 녹음의 사용은 또한 다른 빛 적응 conditio를 아래의 장소를 걸릴 수 있습니다 배경 소음의 수준의 조작을 가능 NS. 또한, 전도성 파형 또한 알파 기능과 같은 시냅스 입력의 모델에서 생성, 또한 전압 의존성 (즉, NMDA 수용체)뿐만 아니라 전압 문이 이온 채널이나 전기적 결합 .......
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공개 사항
모든 절차는 먼저 시드니 대학의 동물 관리 윤리위원회의 승인을, 그리고 과학적인 목적을위한 동물의 관리 및 사용을위한 실천 호주 코드의 지침 (국민 건강과 호주의 의학 연구위원회에 따라 수행 하였다 ).
감사의 글
이 작품은 생명 과학의 징계에서 호주 연구 협의회 (ARC DP0988227)과 생명 과학 연구 이니셔티브 그랜트, 시드니의 대학에 의해 지원됩니다. 장비 패치 클램프 증폭기는 EPC 8 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금에 의해 투자되었다. 장비 InstruTECH LIH 8 +8 데이터 수집 시스템은 레베카 L. 쿠퍼 재단과 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금으로부터 자금 구입했습니다. 우리는 그들의 통찰력있는 제안과 의견을 익명의 검토를 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| < 강> 시약 | |||
| 이소 플루란 흡입 마 | Pharmachem | ||
| Ames 매체 L- 글루타메이트 (분말) | 시그마 - 알드리치 | ||
| 글루콘산 칼륨, 무수 | 시그마 - 알드리치 | ||
| HEPES 나트륨 염 | 시그마 알드리치 | ||
| 염화 마그네슘 용액 ( 4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin– 틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 | 시그마-알드리치 | ||
| 파라포름알데히드 분말, 95% | 시그마-알드리치 | ||
| 안티 루시퍼 옐로우, 토끼 IgG 분획(3mg/ml) | 인비트로겐 | ||
| 알렉사 플루오르 594 염소 안티-래빗 IgG(H+L) 2mg/ml | 인비트로겐 | ||
| 형광 보존 매체 | BioFX 연구소 Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | 워너 인스트루먼트 | 64-0794 | |
| 싱글 스테이지 글라스 Micr– lectrode 풀러 | Narishinge 일본 | 모델 PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μ m Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock 재사용 가능한 피하 주사 바늘: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| 단일 인라인 솔루션 히터 | Warner Instruments | 모델 SH-27B | |
| 이중 자동 온도 컨트롤러 | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus 실체 현미경 SZ61 | Olympus 주식회사 | ||
| 올림푸스 현미경 BX50WI: 40X 대물 | 렌즈 올림푸스 코퍼레이션 | ||
| 0-30 V 2.5 A DC 전원 공급 장치 | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| 디지털 현미경 카메라 ProgResMF 쿨 | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | 셔터 계기 회사 | ||
| 패치 클램프 증폭기 EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 데이터 수집 시스템 | HEKA Elektronik | ||
| 컴퓨터: DELL | Dell Corporation |
참고문헌
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E.
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재인쇄 및 허가
