세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

요약

간 카 ^{2 +} - 파도 갭 접합 채널 hemichannels에 의해 구동됩니다. 여기, 우리는 세포 간 칼슘을 측정하는 방법을 설명 ^{2 +} - 파 지역의 단일 셀 기계적 자극과 속성과 간격 접합 채널 hemichannels의 규정을 조사하기 위해 해당 응용 프로그램의 질문에 답변 세포 단층합니다.

초록

간 통신은 뇌, 간, 망막, 달팽이관 및 혈관 등의 장기와 조직의 다양한 세포 사이의 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적이다. 실험 설정에서, 세포 간 칼슘 ^{2 +} - 파도 하나의 세포에 기계적 자극을 적용하여 이끌어 할 수 있습니다. 이 세포 내 신호 IP 분자 ₃ ^칼슘의 출시에 이르게 ⁺ 이웃 세포에 기계적 자극 셀에서 ⁺ 파 동심 ^칼슘의 번식을 시작합니다. 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파를 제어하는 주요 분자 경로는 IP _3의 직접 전송을 통해와 ATP의 방출을 통해 hemichannels으로 갭 접합 채널에 의해 제공됩니다. 속성과 다른 넥신 갭 접합 채널 hemichannels로 pannexin 이소 규제의 식별 및 특성화 quantificatio에서 허용하는N 간 칼슘 ^{2 +} 파, siRNA를, 그리고 갭 접합 채널 hemichannels 억제제의 사용의 확산. 여기, 우리는 그 결과로 간 ^칼슘이 세포의 급성, 짧은 지속 변형에 의해 자극 통제 및 지역화 기계적 자극에 대한 응답으로 Fluo4 암으로로드 차 각막 내피 세포의 단일 층에있는 ⁺ 파를 측정하는 방법을 설명 이하 1 ㎛의 팁 직경 micromanipulator에 제어 유리 micropipette를 가진 세포막을 감동. 우리는 또한 주 소 각막 내피 세포와 ⁺ - 파도 ATP의 방출을 통한 세포 간 ^칼슘의 중심 세력으로 Cx43-hemichannel 활동을 평가하기위한 모델 시스템으로 사용의 분리를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 사용, 장점, 한계와 갭 접합 채널 hemichannel 연구의 맥락에서이 방법의 대안을 논의한다.

서론

간 통신 및 신호는 조직과 전체 - 장기 레벨 ^1,2에서 세포 촉진제 님의 질문에 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적입니다. 간 의사 소통의 가장 직접적인 방법은 간격 접속점의 발생에 의해 만들어집니다. 갭 접합 ^3,4 인접 셀의 두 넥신 (CX는) hemichannels (그림 1)의 헤드 투 헤드 도킹에 의해 형성 단백질 성 채널입니다 간격 접합 채널의 패이다. 갭 접합 발생 및 변조 ^칼슘 이웃 세포 ^​​6 (그림 2)의 세포 내 상점에서 ⁺ 릴리스., 칼슘 ^{2 +} 또는 IP _⁵ 등 이하 1.5 kDa의 분자량은 작은 신호 분자의 통과를 허용 갭 접합 채널은 밀접하게 산화 환원 수정 및 같은 내 및 분자간 단백질 상호 작용에 의해 및 세포 신호 전달 과정에 의해 조절된다인산화 ^7. GJS 그로 인하여 화학 및 전기 syncytium 역할, 연결된 세포의 조정 반응을 촉진한다. 예를 들어, 심방 및 심실 근육 세포를 통해 심장 활동 전위의 확산은 CX-기반 GJ 채널 ^85에 의해 중재된다. CXS는 갭 접합 채널로서 역할을 할뿐만 아니라 짝 hemichannels을 형성하여 정기적으로 이온 채널 ^8-10 (그림 1)과 유사 세포막 채널로 작동하지 않습니다. Hemichannels는 내부와 세포 외 환경 사이 이온 및 신호 분자의 교환을 제어하여 이웃 세포 사이 paracrine 신호에 참여할 수 있습니다.

많은 종류의 세포 (상피 세포, 조골 세포, 성상 세포, 내피 세포 등과 같은) 및 장기 (뇌, 간, 망막, 달팽이관과 혈관 등)에 간 칼슘 ^{2 +} - 파도 다세포 반응의 조정을위한 기본적인 ^{11. 특정 셀에 내 Ca 2 + 농도의 증가는이 셀로 제한하지만, 그로 인하여 간 칼슘 2 + 파 12,13 구축, 주변 이웃 세포에 전달되지 않습니다. 이러한 세포 간 칼슘 2 + - 파도 syncytium과 조절 장애는 병태 생리 학적 과정 11과 관련되어 같은 셀 계층의 정상적인 생리 조절을 위해 중요하다. 각막 내피 세포와 상피 세포에서, 우리 자신의 25-33 등 다른 그룹 14-24은 간 통신 메커니즘과 역할을 공부했다. 비 흥분 세포, 각막 내피 세포와 같은 세포 간 의사 소통의 두 가지 모드는 28,29, 즉 갭 접합 간 통신 및 paracrine 간 통신을 발생합니다. 갭 접합 간 통신 간격 분기점 7을 통해 신호 분자의 직접 교환을 포함한다. 갭 접합부tional 간 통신, 조직의 항상성을 유지하는 세포 증식을 조절하고, 세포 스트레스 10,34,35에 동기화 응답을 설정하기위한 중요합니다. 병리 번호, 갭 접합 커플 링으로 인해 결함이 CXS로 감소하고, 이에 갭 접합 간 통신이 36에 영향을 미치고있다. 이 다세포 생물의 격차 접합부 간 의사 소통의 중요성과 영향력을 강조한다. 그것이 확산 성 세포 메신저 (그림 2)의 방출을 포함 이후 격차 접합부 간 통신 대조적으로, paracrine 간 통신, 세포 - 세포 동격에 종속되지 않습니다. 신호 분자의 종류는 세포 신호에 의해 세포 공간에 해제됩니다. 분자 다음은 특정 수용체​​ 단백질에 의해 감지 된 대상 셀에 전송됩니다. 이후 수용체 신호 단지 어떤 세포 반응을 유도신호를 비활성화 또는 탈감작의 제거에 의해 종료됩니다. 출시 친 화성 세포 신호 메신저 멤브레인을 통과하고 세포 내 수용체에 작용합니다. 반면, 친수성 ​​메신저는 응답 세포의 세포막을 통과하지 않는다, 그러나 세포 내 환경에 신호를 중계 표면 발현 수용체 단백질에 결합하는 리간드 역할을합니다. 이온 채널 연결, 효소 결합, 및 G 단백질 - 연결 : 세포 표면 수용체 단백질의 세 가지 주요 가정은이 과정에 참여한다. 발표 메신저 분자가 가까이 (paracrine)에서 표적 세포에 동일한 셀 (autocrine)의 수용체에 작용하거나 순환 시스템 (내분비)가 필요 먼 표적 세포에.}

각막 내피 세포 ^28,29 등 많은 종류의 세포에서, ATP는 세포 간 칼슘 ^{2 +} - 파도 ^37-40의 번식을 구동 주요 친수성, paracrine 요인 중 하나입니다. 지속여러 에이전트가 ING 기계적 변형, 저산소증, 염증이나 자극, ATP는 전단 응력, 스트레칭, 또는 삼투는 ^{44,45 붓기에} 대한 응답으로 ^41-44 건강한 세포에서 해제 할 수 있습니다. 다른 ATP 방출 메커니즘은 기공을 갖는 exocytosis를 ^44과 같은 ATP 결합 카세트 (ABC) 전송기, plasmalemmal 전압에 의존하는 음이온 채널 ^46, P2X7 수용체의 채널 ^47,48뿐만 아니라, 같은 전송 메커니즘의 과다 등 가정되었다 넥신의 hemichannels ^49-52과 pannexin의 hemichannels ^43,49,53. 세포 ATP는 ADP, AMP에 빠르게 가수 분해와 세포 외 환경에 존재하는 ectonucleotidases로 ^54,55를 아데노신 수 있습니다. extracellularly 발표 ATP와 그 대사 산물 ADP ⁵⁶ 확산을 통해 확산됩니다. 이웃 세포에서 퓨린 수용체 이러한 뉴클레오티드의 연속적인 상호 작용은 P에 연루되어있다간 칼슘 ^{2 +} - 파도 ^28,37,51의 ropagation. 퓨린 수용체의 두 가지 클래스가 존재한다 : 두 퓨린 (ATP, ADP)과 피리 미딘 (UTP, UDP) 뉴클레오티드 가장 P2-purinoceptors ^57에 따라 행동하면서 아데노신은 P1-purinoceptors의 주요 천연 리간드이다.

간 통신 등의 부스러기 로딩, 염료 전송, IP ₃ 칼슘 ^{2 +,} 기계적 자극, 등과 같은 작용제 지역의 uncaging 등 다양한 방법으로 조사 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 ⁺ 웨이브 전파는 단일 세포의 기계적 자극으로 이끌어 ^칼슘의 연구를 설명합니다. 기계적 자극에 의해 칼슘 ^{2 +} 파 전파 연구의 장점은 ⁺ 파 시간에 ^칼슘의 확산을 정량화하기 쉬운 도구를 제공하고 정량적으로 세포의 다른 전처리를 비교 할 수 있다는 것입니다. 각막 내피 세포에서 이러한 세포 간 칼슘 ^{2 +} - 파도 공동 수단층에서 조정 된 응답, 이에 안구 수술하는 동안 세포 스트레스를 견딜 수있는 내피를 돕는 비 재생 각막 내피 세포의 가능한 방어 메커니즘으로 작용 또는 면역 거부 또는 포도막염 ^58,59 동안 염증 매개체에 노출에.

프로토콜

1. 각막 내피 세포의 분리

시작하기 전에 : 눈 enucleating 후 현지 도축장, 가능한 한 빨리 얻은 신선한 눈에서 세포를 분리. 눈이 최대 18 개월 5 분 사후과 얼의 균형 소금 용액에 보존의 소에서 적출되었는지 확인 - 4의 1 % 요오드 용액 실험실 운송 ° C.

1. 얼의 균형 소금 솔루션의 밖으로 눈을 가지고 - 1 % 요오드 용액을 페트리 접시 (100 X 20mm)에 넣습니다.
2. 70 % 에탄올을 포함하는 용액으로 눈을 소독하고 1 % 요오드를 포함 얼의 균형 소금 용액으로 씻어.
3. 에서이 단계에서, 멸균 후드에서 작동합니다. 조심스럽게 눈에서 각막을 해부하고 위로 향하게 상피 세포 층과 얼의 균형 소금 솔루션을 포함하는 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)에 배치합니다. 주의 깊게 남아있는 홍채 조직 STI를 제거필요한 경우 각막에 부착 것이다.
4. 위로 내피 세포의 레이어와 페트리 접시를 포함하는 다른 얼의 균형 소금 솔루션에 각막을 전송하고 얼의 균형 소금 용액으로 두 번 헹구십시오.
5. 컵 모양의 접시입니다 모래에 위로 향하게 내피 층 각막을 전송하고, 성장 매체로 커버. 성장 매체는 25 mM의 포도당, 10 % 소 태아 혈청, 6.6 % L-글루타민, 2.5 ㎍ / ㎖ 암포 테리 신-B, 1 % 항생제 항진균 혼합물을 10,000 단위를 포함하는 / 페니실린의 ML, 10,000 μg을 함유 Dulbecco의 수정 이글의 중간으로 구성 스트렙토 마이신 / ㎖, 25 ㎍ / ㎖ 암포 테리 신 B.
6. 흡입 피펫 매체를 제거합니다.
7. 각막의 내피 층 (트립신을 포함하는 모든 단계가 같은 농도를 사용하여 수행 할 수 있습니다)에 트립신 용액 (0.5 g / L)의 300 μl를 적용합니다.
8. 적용 페트리 접시에 각막을 포함하는 모래 시계를 놓고 INC에 넣어37 30 분 동안 ubator ° C와 5 % CO _2.
9. 부드럽게 멸균 후드에 불 세련된 후크 모양의 유리 파스퇴르 피펫으로 각막에서 멀리 내피 세포를 긁어.
10. 내피 세포를 포함하는 솔루션을 빨아 문화 매체의 4 ML을 포함하는 문화 플라스크 (25cm ^2)에 추가합니다.
11. 각막에 성장 매체 300 μl를 적용하고 긁기를 반복하고 문화 플라스크에 내피 세포가 포함 된 솔루션을 추가합니다.
12. 한 번 더 마지막 단계 (1.11)를 반복합니다.
13. 문화를 놓고 37 배양기에서 배양 배지 ° C와 5 % CO _2에서 각막 내피 세포를 포함 플라스 크입니다.
14. 이틀, 문화 매체의 10 ML을 추가합니다.
15. 격일로 성장 매체를 새로 고칩니다.

2. 세포 배양

1. 배지를 제거하고 도달 자랄 얼의 균형 소금 솔루션 (이란게 내에서 두 번 세포를 씻으분리 후 T는 10 일).
2. 를 분리하고 인큐베이터에 플라스크를 배치 할 셀에 1.5 ML 트립신 솔루션을 추가 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 3-4 분.
3. 성장 매체 12 ML을 추가합니다. 세포를 분산하고 세포를 계산하기 위해 밖으로 중간 세 번 피펫.
4. 세포 밀도와 인큐베이터에 넣어 따라 변수 부분에 씨앗 세포를. 165,000 세포의 세포 수 (cm ² 당 세포 밀도 39,286) 두 잘 챔버 슬라이드 (4.2 cm ^2의 면적)를 준비. cm ² 당 6,250의 밀도에 새로운 통과를 위해 80cm ² 문화 플라스크를 준비하고 25 ML의 총 볼륨에 신선한 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
5. 이틀 매체를 새로 고칩니다.
6. 세포 층 자랄는 3-4일에 도달 한 후에. 실험 세포를 사용합니다.
7. 플라스크의 세포 층의 confluency에 도달하면, 2.6 단계 2.1를 반복합니다. 통행 최대 2 세포 배양 F를 사용할 수 있습니다또는 실험.

3. 유도 칼슘 웨이브 기계적 자극

1. 10 μM 플루오-4와 챔버 슬라이드에 세포를로드하기에 오전 37시 30 분 생리 인산염 버퍼 ° C 가볍게 흔들어.
2. 플루오-4 솔루션 AM 제거, 생리 인산염 버퍼와 세포 다섯 번 씻어 염분 인산 버퍼로 세포를 배양 및 측정 전에 실온에서 적어도 5 분 동안 세포를 둡니다.
3. 아르곤 레이저를 사용 빔 스플리터 HFT 488와 488 nm에서 흥분은 longpass 방출 필터 LP 505를 사용하여 530 nm에서 형광 방출을 수집 최소한 핀홀을 설정합니다. 기름 침지 40X 목표 (공기, 1.2 NA)를 사용합니다. ARL-67156를 가진 실험에서 10X 목표를 사용 (공기, 0.3 NA).
4. 세포가 공 촛점 현미경에 합류되는 필드를 검색합니다.
5. 위치는 45 챔버 슬라이드에 대하여 10 °와 세포막을 터치에서되도록 피펫을.하나의 셀에 짧은 (≈ 1 초) 기계적 자극을 자극. 기계적 자극 잠깐입니다 앰프를 통해 운영 압전 크리스탈 나노 위치에 결합 된 유리 마이크로 피펫 (팁 직경 <1 ㎛)로 세포막의 1 % 미만을 만져 세포의 급성, 짧은 지속 변형으로 구성 마이크로 매니퓰레이터에 장착. 유리 마이크로 피펫을 미세 전극 풀러와 함께 만들어집니다. 나노 위치가 기계적 자극하는 동안 0.2에서 1.5 V 사이의 전압으로 작동되어 있는지 확인합니다. 1.5 V보다 높은 전압 세포가 손상 될 수 있습니다. 각 세포 유형 및 조건, 세포 손상없이 기계적 자극에 대한 최적의 전압은 신중하게 높은 (1.5 V) 전압 (0.2 V)에서부터 시작 전압의 시리즈를 적용하여 결정해야합니다. 이 전압이 세포막에 적용되는 기계적 응력과 변형을 결정 때문에 전압은 자극의 힘에 대한 척도이다.기계적 자극의 힘은 지역에 기계적 스트레스를 곱하여 계산할 수 있습니다. 면적 (<3.14 μm의 ²⁾ 및 기계적 스트레스가 모두 매우 낮은이기 때문에, 기계적 자극의 힘은 낮다. (세포가 손상되었을 때, 세포와 세포 밖으로 형광 누출이 어두워합니다.)
6. 공간적 변화를 측정 [칼슘 ^{2 +]} 공 촛점 현미경으로 기계적 자극에 따라 _전.
7. 이미지를 수집하고 저장합니다.
8. 공 초점 현미경의 소프트웨어를 사용하여 반응 세포 (활성 영역, AA)의 총 면적을 정의하는 관심 다각형 영역을 그립니다.

결과

모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되고 설명되는 프로토콜은 KU 루벤의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다.

소 각막 내피 세포 (BCEC)에서 기능성 간격 접속점은 표현 격차 접합부 간 통신 및 paracrine 간 통신을 모두 상호 작용하는 방식 간 통신에 크게 기여하지만 주요 통로에 의해 중재 paracrine 간 통신 경로로 표시되었습니다 있습니다 Cx43 기반 hemichannels ^28,29을 통해 ATP 자료. ATP와 ADP는 ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside 인산 diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase)에 의해 인산염 (AMP)을 아데노신을 가수 분해하고, 이후 5'-ectonucleotidase CD73 ^28,29으로 아데노신 할 수 있습니다. ATP와 ADP는에 기여P2Y1와 P...

토론

이 논문에서, 우리는 마이크로 피펫을 사용하여 지역화 및 제어 기계 자극을 제공함으로써 주 소 각막 내피 세포의 단일 층에 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 기계적 자극 세포는 ^+, 둘은 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파 ^{11,67 운전} 필수적인 세포 내 신호 전달 분자 세포 내 IP ₃ 칼슘 ² 지역의 증가와 함께 응답합니다. 칼슘 ^{2 +} hemichannels의 개방과 G-단백질 결합 P2의 활성화를 통해 이웃 세포에서 칼슘 ^{2 +} 신호를 트리거 ATP ^68,69의 방출을 유발하면서 IP ₃ 직접 갭 접합 채널 ^5를 통해 이웃 세포에 전달된다 수용체 ^37-40. 갭 접합 채널이 과정에서 hemichannels의 상대적 기여도는 CX-모방의 사용에 의해 특징...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco의 PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-B,G-Dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	맞춤형 펩타이드 합성
Gap27 (SRPTEKTIFII)	맞춤형 펩타이드 합성
제어 펩타이드 (SRGGEKNVFIV)	맞춤형 펩타이드 합성
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTt)	어닐링된 siRNA는 다음에서 구입했습니다. Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAdTdT)	Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.
TAT-L2 (TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, 독일)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, 독일)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
피에즈– lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Micr– lectrode puller	Zeitz Instrumente (뮌헨, 독일)	WZ DMZ-Universal Puller