세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

요약

간 카 ^{2 +} - 파도 갭 접합 채널 hemichannels에 의해 구동됩니다. 여기, 우리는 세포 간 칼슘을 측정하는 방법을 설명 ^{2 +} - 파 지역의 단일 셀 기계적 자극과 속성과 간격 접합 채널 hemichannels의 규정을 조사하기 위해 해당 응용 프로그램의 질문에 답변 세포 단층합니다.

초록

간 통신은 뇌, 간, 망막, 달팽이관 및 혈관 등의 장기와 조직의 다양한 세포 사이의 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적이다. 실험 설정에서, 세포 간 칼슘 ^{2 +} - 파도 하나의 세포에 기계적 자극을 적용하여 이끌어 할 수 있습니다. 이 세포 내 신호 IP 분자 ₃ ^칼슘의 출시에 이르게 ⁺ 이웃 세포에 기계적 자극 셀에서 ⁺ 파 동심 ^칼슘의 번식을 시작합니다. 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파를 제어하는 주요 분자 경로는 IP _3의 직접 전송을 통해와 ATP의 방출을 통해 hemichannels으로 갭 접합 채널에 의해 제공됩니다. 속성과 다른 넥신 갭 접합 채널 hemichannels로 pannexin 이소 규제의 식별 및 특성화 quantificatio에서 허용하는N 간 칼슘 ^{2 +} 파, siRNA를, 그리고 갭 접합 채널 hemichannels 억제제의 사용의 확산. 여기, 우리는 그 결과로 간 ^칼슘이 세포의 급성, 짧은 지속 변형에 의해 자극 통제 및 지역화 기계적 자극에 대한 응답으로 Fluo4 암으로로드 차 각막 내피 세포의 단일 층에있는 ⁺ 파를 측정하는 방법을 설명 이하 1 ㎛의 팁 직경 micromanipulator에 제어 유리 micropipette를 가진 세포막을 감동. 우리는 또한 주 소 각막 내피 세포와 ⁺ - 파도 ATP의 방출을 통한 세포 간 ^칼슘의 중심 세력으로 Cx43-hemichannel 활동을 평가하기위한 모델 시스템으로 사용의 분리를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 사용, 장점, 한계와 갭 접합 채널 hemichannel 연구의 맥락에서이 방법의 대안을 논의한다.

서론

간 통신 및 신호는 조직과 전체 - 장기 레벨 ^1,2에서 세포 촉진제 님의 질문에 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적입니다. 간 의사 소통의 가장 직접적인 방법은 간격 접속점의 발생에 의해 만들어집니다. 갭 접합 ^3,4 인접 셀의 두 넥신 (CX는) hemichannels (그림 1)의 헤드 투 헤드 도킹에 의해 형성 단백질 성 채널입니다 간격 접합 채널의 패이다. 갭 접합 발생 및 변조 ^칼슘 이웃 세포 ^​​6 (그림 2)의 세포 내 상점에서 ⁺ 릴리스., 칼슘 ^{2 +} 또는 IP _⁵ 등 이하 1.5 kDa의 분자량은 작은 신호 분자의 통과를 허용 갭 접합 채널은 밀접하게 산화 환원 수정 및 같은 내 및 분자간 단백질 상호 작용에 의해 및 세포 신호 전달 과정에 의해 조절된다인산화 ^7. GJS 그로 인하여 화학 및 전기 syncytium 역할, 연결된 세포의 조정 반응을 촉진한다. 예를 들어, 심방 및 심실 근육 세포를 통해 심장 활동 전위의 확산은 CX-기반 GJ 채널 ^85에 의해 중재된다. CXS는 갭 접합 채널로서 역할을 할뿐만 아....

프로토콜

1. 각막 내피 세포의 분리

시작하기 전에 : 눈 enucleating 후 현지 도축장, 가능한 한 빨리 얻은 신선한 눈에서 세포를 분리. 눈이 최대 18 개월 5 분 사후과 얼의 균형 소금 용액에 보존의 소에서 적출되었는지 확인 - 4의 1 % 요오드 용액 실험실 운송 ° C.

1. 얼의 균형 소금 솔루션의 밖으로 눈을 가지고 - 1 % 요오드 용액을 페트리 접시 (100 X 20mm)에 넣습니다.
2. 70 % 에탄올을 포함하는 용액으로 눈을 소독하고 1 % 요오드를 포함 얼의 균형 소금 용액으로 씻어.
3. 에서이 단계에서, 멸균 후드에서 작동합니다. 조심스럽게 눈에서 각막을 해부하고 위로 향하게 상피 세포 층과 얼의 균형 소금 솔루션을 포함하는 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)에 배치합니다. 주의 깊게 남아있는 홍채 조직 STI를 제거필요한 경우 각막에 부착 것이다.
4. 위로 내피 세포의 레이어와 페트리 접시를 포함하는 다른 얼의 균형 소금 솔루션에 각막을 전송하고 얼의 균형 소금 용액으로 두 번 헹구십시오.
5. 컵 모양의 접시입니다 모래에 위로 향하게 내피 층 각막을 전송하고, 성장 매체로 커버. 성장 매체는 25 mM의 포도당, 10 % 소 태아 혈청, 6.6 ....

결과

모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되고 설명되는 프로토콜은 KU 루벤의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다.

소 각막 내피 세포 (BCEC)에서 기능성 간격 접속점은 표현 격차 접합부 간 통신 및 paracrine 간 통신을 모두 상호 작용하는 방식 간 통신에 크게 기여하지만 주요 통로에 의해 중재 paracrine 간 통신 경로로 표시되었습니다 있습니다 Cx43 기반 hemichannels ^28,29을 통해 ATP 자료. ATP와 ADP는 ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside 인산 diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase)에 의해 인산염 (AMP)을 아데노신을 가수 분해하고, 이후 5'-ectonucleotidase CD73 ^28,29으로 아데노신 할 수 있습니다. ATP와 ADP는에 기여P2Y1와 P.......

토론

이 논문에서, 우리는 마이크로 피펫을 사용하여 지역화 및 제어 기계 자극을 제공함으로써 주 소 각막 내피 세포의 단일 층에 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 기계적 자극 세포는 ^+, 둘은 간 칼슘 ^{2 +} 파 전파 ^{11,67 운전} 필수적인 세포 내 신호 전달 분자 세포 내 IP ₃ 칼슘 ² 지역의 증가와 함께 응답합니다. 칼슘 ^{2 +} hemichannels의 개방과 G-단백질 결합 P2의 활성화를 통해 이웃 세포에서 칼슘 ^{2 +} 신호를 트리거 ATP ^68,69의 방출을 유발하면서 IP ₃ 직접 갭 접합 채널 ^5를 통해 이웃 세포에 전달된다 수용체 ^37-40. 갭 접합 채널이 과정에서 hemichannels의 상대적 기여도는 CX-모방의 사용에 의해 특징.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco의 PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-B,G-Dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	맞춤형 펩타이드 합성
Gap27 (SRPTEKTIFII)	맞춤형 펩타이드 합성
제어 펩타이드 (SRGGEKNVFIV)	맞춤형 펩타이드 합성
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTt)	어닐링된 siRNA는 다음에서 구입했습니다. Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAdTdT)	Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.
TAT-L2 (TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, 독일)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, 독일)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
피에즈– lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Micr– lectrode puller	Zeitz Instrumente (뮌헨, 독일)	WZ DMZ-Universal Puller