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방법 논문

배아 심실 내피 세포의 분리

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50463

⸱

2013년 7월 20일

 , 
1McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

초록

세포 배양 크게 수많은 배양 조건에서 세포의 개별 인구를 평가하는 능력을 강화했다. 불후의 세포 라인 사용의 용이성에 상당한 이점을 제공하지만, 이러한 세포 라인은 모든 잠재적 세포 유형에 사용할 수 없습니다. 특히 형질 전환 마우스의 관심의 특정 지역의 일차 전지를 분리하여,보다 미묘한 연구를 수행 할 수 있습니다. 기본 기술은 장기 또는 그 일부 장기 (심장 또는 심장의 특정 지역 등) 해부 및 단일 세포로 장기 해리 ​​포함한다. 이 세포는 그 관심의 세포 유형을 인식하는 항체 복합 자석 구슬로 배양한다. 그 세포는 그 구슬에서 세포를 해리 짧은 트립신 보육과, 자석의 사용으로 격리 할 수​​ 있습니다. 이 고립 된 세포는 다음 배양하고 원하는 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 원래 성인 마우스의 장기를 위해 설계되었습니다들하지만, 쉽게 여기에서 알 수 있듯이, 배아 장기 사용하기 위해 아래로 확장 할 수 있습니다. 우리의 관심을 개발하는 관상 동맥 혈관에 있기 때문에, 우리는 특정 배아 단계에서 세포의이 인구를 공부했습니다. 따라서, 원래의 프로토콜은 배아 심실의 작은 크기와 이러한 발달 단계에서 내피 세포의 낮은 잠재적 인 수확량과 호환되도록 수정해야했습니다. 이 스케일 다운 방식 활용, 우리는 유전자 변형 배아 심실 내피 세포의 관상 동맥 신경 얼기 리모델링을 평가했다.

서론

불후의 세포 라인의 출현은 기본적인 세포 생물학 1 혁명을 일으켰다. 현재 세포주 기관의 다양한에서 파생 된 모든 주요 세포 유형을 포함하고 있습니다. 그러나 설립 세포 라인은 몇 가지 제한이 있습니다. 불멸화 과정은 분명히 특히 수명과 확산에 대해, 세포의 동작을 변경하지만, 또한이 세포 골격 단백질과 같은 예기치 않은 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 다른 세포 라인을 사용할 수 있지만 또한, 전체 유기체 내에서 단 한 번의 세포 유형 간의 유의 한 다양성이있다. 특히 쇼 다양한 행동의 내피 세포는 동맥이나 정맥 흐름의 종류는 용기 3에 존재하는 그들은 선 여부에 따라. 발달의 관점에서 훨씬 더 시급한 그러나, (참조, 예를 들면 t 사용할 수있는 세포 라인의 대부분이 성인 조직에서 파생 된 것입니다ATCC 통해 사용할 그가 컬렉션). 이러한 성인 세포주 가능성이 자신의 배아 전구체의 동적 특성을 요점을 되풀이하지 않습니다. 개발하는 동안 관찰 빠르게 변화하는 시공간 유전자 발현 패턴은 특정 발달 단계에서 하나의 기관에서 내피 세포가 다른 발달 단계에서 동일한 기관에서 내피 세포와 같은 방식으로 작동하지 않을 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

시중 불후의 세포 라인을 사용하는 대신, 일차 전지는 관심의 특정 조직에서 분리 할 수​​ 있습니다. 이 기술의 장점 가운데 이러한 기본 세포도 특정 기관이나 특정 발달 단계에서 기관의 부분으로부터 격리 할 수​​ 있습니다. 또한, 이러한 기본 세포는 유전자 녹아웃 등의 transfection 효율성과 같은 다른 문제를 피하면서 노크에서의 체외 연구에서 허용 가능한 형질 전환 동물의 다양한 격리 할 수 있습니다. 되지 놀랍게도, 많은기술은 특정 세포 유형 4,5 분리하는 방법에 대해 자세히 발표되었다. 일반적으로,이 기술은 세포 태그 관심의 특정 세포 유형을 해리하고 추가 분석을 위해 그 세포를 분리, 관심의 영역을 모으는 포함한다.

관상 동맥 내피 세포의 초기 배아 인구를 연구하기 위해, 우리는 작은 장기 사용하기 위해 이전에 게시 된 기술 4 축소. 이 축소 된 절차로, 우리는 특정 배아 단계에서 배아 마음에서 관상 동맥 내피 세포를 분리 할 수​​ 있습니다. 이러한 세포는 그런 마이그레이션 분석과 같은 전통적인 내피 분석에 사용할 수 있습니다. 초기 배아 세포 라인이 더 널리 될 때까지, 일차 전지 작업을하는 것은 매우 중요한 기술이다.

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프로토콜

1. 항체 - 복합 구슬을 준비

  1. 이전 해부 어느 날, 제조업체의 지침에 따라 해당 Dynabeads (쥐 제기 항체 예를 들어, 쥐의 IgG Dynabeads, 4 × 10 8 구슬 / ㎖)로 선택의 항체를 결합합니다. BD 쥐 항 CD31 항체 (0.5 ㎍ / ㎕의 내피 세포를 분리하는 데 사용)의 경우, 3 μL 항체 최종 1.5 μg 항 CD31 항체의 농도 / 1 × 10 7 비즈를 들어, 매 25 μL 비즈에 추가됩니다 25 μL 버퍼입니다.
  2. 4 ° C.에 구슬과 밤새 항체를 품어

2. 콜라겐 플레이트를 준비

  1. 단지 콜라겐 코팅 플레이트에 반대 콜라겐 겔에서 재배 할 때 절연 세포는 더 빠르게 세관을 형성한다. 6에 설명 된대로 따라서 콜라겐 젤은, 해부 전날 밤에 만들어집니다. 조직 문화 후드에서 얼음에 다음과 같은 시약 (충분히 19 우물) 결합 : 206.4 μL 멸균 H를 <서브> 2 O, 140.4 μL 콜라겐 유형 I (4.08 밀리그램 / ML), 38.4 μL 배 M199, 그리고 1.15 μL 5 M NaOH를.
  2. 384 잘 조직 배양 플레이트의 우물에이 콜라겐 젤의 피펫 20 μL. 30 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
  3. 각 well에 80 μL DMEM을 추가하고 37 15 분 동안 품어 ° C. 배지를 제거하고 두 번 더 반복합니다.
  4. 최종 헹굼 후, 잘 FBS / DMEM 각각 80 μL 10 %를 추가하고 37 밤새 품어 ° C. 분리 된 세포를 추가하기 전에 배지를 제거합니다.

3. 소비세 심장을 소화

  1. 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
  2. 앙와위에서 마우스로, 자유주의 ​​이전에 70 % 에탄올로 여성의 복부 측면을 살포해부. 내부 장기에서 멀리 하복부 피부와 근육을 들어 올려 집게를 사용하여 내부 장기를 시각화하는 여성의 낮은 복강을 열고 잘라.
  3. 집게와 자궁 경부를 잡고 조심스럽게 핀셋으로 꼬리 잘라 내기 및 복강에서 자궁을 들어 올려 시작합니다. 자궁을 들어 올리면서 그 자리에 경적을 보유하고있는 결합 조직을 잘라. 자궁을 절개 완료하려면 자궁을 무료로 난관과 자궁의 접합부를 잘라.
  4. 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라.
  5. 배아를 절단 실수 방지하고 배아를 검색하는 태반의 교차점에서 배아 주머니와 배아를 자르면. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다.
  6. 디가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 배아를 ecapitate. 유전자형이 필요한 경우,이를 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 저장 꼬리를 잘라.
  7. 그것의 뒤에 배아와, 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 다음, 부드럽게 방식의 가슴 벽을 당겨 밖으로, 마음을 절단 방지하기 위해, 갈비뼈의 하단에 가로 컷 다음 앞발 근처 흉곽의 측면을 따라 수직 절단,합니다. 최대 약 배아 일 13.5을 통해, 가슴 벽 시각화 은닉, 투명합니다.
  8. 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 폐 혈관이 절단되지 않은 경우, 폐는 마음으로 제거 할 수 있습니다. 필요한 경우 따라서, 폐와 같은 불필요한 조직을 제거합니다.
  9. 분리 심실에서 심방과 큰 혈관을 버립니다. 가위 사용하여 작은 조각 (약 1mm 3 <에 심실을 말하다/>를 한모금) 약 500 μL 콜라게나 제 (멸균 PBS 1 MG / ML)에서 개최. 모든 심실 다진과 콜라에 배치 될 때까지 얼음에 샘플을 유지한다.
  10. 심실은 별도의 에펜 도르프 튜브에 각각의 마음을 수집, 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 모든 배아가 동일한 유전자형이 있다면, 마음은 하나의 에펜 도르프 튜브에 풀링 할 수 있습니다. 한 번에 처리 된 샘플의 수는 분리에 사용되는 자석에 따라 제한 될 수 있습니다; DynaMag (123-21D)는 16 에펜 도르프 튜브의 최대 보유하고 여기에 사용.
  11. 45 분 동안 흔들 37 ° C에서 다진 심실를 놓습니다. 매 15 분, 부드럽게 샘플을 제거하고 기계적으로 세포를 해리 아래로 피펫.

4. 내피 세포를 분리

  1. 세포의 나머지 덩어리를 제거하는 필터 70 μm의를 통해 뇌실 - 콜라게나 솔루션을 전달합니다.
  2. 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 폐기상층 액은 DMEM 약 200 μL 10 % FBS로 교체하고, 세포를 떼어 놓다 아래로 피펫.
  3. 일단 이전 단계를 반복합니다. 두 번째 10 % FBS / DMEM 세척 후 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 50 μl를 10 % FBS / DMEM에 세포를 resuspend을.
  4. 최종 원심 분리 단계에서 구슬을 준비합니다.
    1. 1 분 자석에 항체 비즈를 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다.
    2. 자석에 장소 튜브, 상층 액을 제거하십시오. 자석에서 튜브를 제거하고 약 100 μL 10 % FBS / DMEM을 추가합니다.
    3. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거하고 10 % FBS / DMEM 다시 씻는다. 3 세척의 총 반복합니다.
    4. 마지막 세척 후, 10 % FBS / DMEM에 항체가 결합 된 비즈 (샘플 당 5 μL)을 resuspend을.
  5. 각각의 세포 샘플, 항체 결합 된 구슬의 5 μl를 추가합니다. 락 FO와 4 ° C에서 비드 세포 현탁액을 배치R 30 분.
  6. 층류 후드에서 1 분 자석에 세포와 항체 - 복합 구슬을 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거 자석에서 튜브를 제거하고, 약 100 μL 10 % FBS / DMEM으로 세척한다. 5 세척을 반복합니다.
  7. 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 약 100 μL DMEM을 추가합니다.
  8. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓고, 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 100-200 추가 μL 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 prewarmed. 37 샘플을 품어 ° C와 5 분 5 % CO 2.
  9. 2 분 자석에 튜브를 놓습니다. 신선한 에펜 도르프 튜브에 세포를 포함하는 상층 액을 조심스럽게 전송할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 원심 분리기.
  10. 상층 액을 제거합니다. 예상 수익률에 따라, 또는 384 잘 대우 배양 접시 - 80-100 ㎕의 성장 배지 및 플레이트 96에있는 세포를 resuspend을(E14.5 - E16.5 배아의 심실에서 약 450-600 세포). 내피 세포 (아래 정의) 내피 성장 배지를 사용합니다.

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결과

CD31를 인식 내피 세포 특이 항체를 이용하여 내피 세포는 배아 (E) 13.5 (그림 1A) 및 18.5 (피규어 1B-1D) 배아의 심실에서 분리되었다. 치료 배양 접시에 성장하면,이 세포는 둥근 남아 근처 합류 (그림 1A) 만약 조약돌 패턴을 형성한다. 희석 콜라겐은 또한 우물 코트에 사용되어 왔으며, 내피 세포가 (그림 1B)을 준수 할 때, 그들은보다 적은 체인을 형성 할 때 콜라겐 겔에 도금 (그림의 1C 및 1D). 내피 세포는 콜라겐 코팅에 비해 콜라겐 겔에 성장 잘 때 콜라겐 겔 (그림의 1C 및 1D)를 형성 세포 - 세포 상호 작용과 콜라겐을 재배 할 때 분기를 시작 폼 체인이 과정을 포함하여 빠르게 발생의 성장 플레이트. 이 내피 체인 내피 세포 마커 ISO-렉틴과 긍정적 라벨 ( 그림 1D). 분리 ...

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토론

기본 배아 세포와 작업 새로운 실험 개발의 체외 중요한 단계에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 분리 절차는 간단하지 않습니다. 세포의 모든 유형을 분리하는 중요한 단계는 세포가 잘 그들이 잘 세척 단계에서 중단되는 다음 콜라 소화에 분리되는 것을 보장 이용하실 수 있습니다. pipetting하여 기계적 박리 크게 콜라 단계에서 세포를 분리하는 데 도움이, 그리고 필터링 단계는 세포의 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 이 단계는 인구 순도를 향상시키고 얻을 수 있습니다.

도금 밀도는 작은 기관의 세포를 분리 중요한 관심사입니다. 관 형성 내피는 세포 밀도 7에 의존하고 있기 (위해) 때문에, 우리는 도금 밀도를 높이기 위해 384 잘 조직 배양 플레이트에 의존. 심지어이 고려, 우리는 낮은 세포 밀도 (다이어와 패터슨, 프로의를 수용하기 위해 몇 가지 분석을 수정해야했다) 진행률. 휴대폰 번호가 우려되고있는 경우, 작은 크기의 ...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 중요한 원고 읽기, 시간 경과 이미징 지원 UNC의 현미경 서비스 연구소 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강한>시약< / 강한>
임신 한 마우스아 단계에서 해부
마우스 안티 마우스 CD31BD Bioscience553370
쥐 IgG DynabeadsInvitrogen110-35
콜라겐BD Bioscience354236
PBS (1x)
콜라겐 분해 효소, 유형 IWorthington 생화학LS004196
DMEMCellgro
FBS시그마 - 알드리치F2442
내피 세포 성장 배지(노트에 설명 된대로 실험실에서 만든)DMEM 함유 20 % FBS, 5 μ M β-머캡트– 탄올, 50 μ g/ml ECG 및 1x 페니실린/스트렙토마이신
β-메르캡트– 탄올시그마-알드리치M6250
ECGS생물 의학 기술, Inc.BT-203
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140
트립신-EDTAGibco25300
384-웰 배양 플레이트GreinerT-3037-6플레이트는 6; 작업 표면적 10 mm2
Collagen type IBD354236최종적으로 사용에 설명된 바와 같이 얇은 콜라겐 겔로 제조되었습니다. 1.5 mg/ml
M199의 농도, 10xInvitrogen11825-015
Syto-16InvitrogenS757813
EQUIPMENT
Stereoscopic microscopeNikonSMZ645
Cell culture incubatorThermo3110
DynaMag의 지시에 따라 사용Invitrogen123-21D
탁상용 원심분리기Thermo75002430
관심 배

참고문헌

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