배아 심실 내피 세포의 분리

요약

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

초록

세포 배양 크게 수많은 배양 조건에서 세포의 개별 인구를 평가하는 능력을 강화했다. 불후의 세포 라인 사용의 용이성에 상당한 이점을 제공하지만, 이러한 세포 라인은 모든 잠재적 세포 유형에 사용할 수 없습니다. 특히 형질 전환 마우스의 관심의 특정 지역의 일차 전지를 분리하여,보다 미묘한 연구를 수행 할 수 있습니다. 기본 기술은 장기 또는 그 일부 장기 (심장 또는 심장의 특정 지역 등) 해부 및 단일 세포로 장기 해리 ​​포함한다. 이 세포는 그 관심의 세포 유형을 인식하는 항체 복합 자석 구슬로 배양한다. 그 세포는 그 구슬에서 세포를 해리 짧은 트립신 보육과, 자석의 사용으로 격리 할 수​​ 있습니다. 이 고립 된 세포는 다음 배양하고 원하는 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 원래 성인 마우스의 장기를 위해 설계되었습니다들하지만, 쉽게 여기에서 알 수 있듯이, 배아 장기 사용하기 위해 아래로 확장 할 수 있습니다. 우리의 관심을 개발하는 관상 동맥 혈관에 있기 때문에, 우리는 특정 배아 단계에서 세포의이 인구를 공부했습니다. 따라서, 원래의 프로토콜은 배아 심실의 작은 크기와 이러한 발달 단계에서 내피 세포의 낮은 잠재적 인 수확량과 호환되도록 수정해야했습니다. 이 스케일 다운 방식 활용, 우리는 유전자 변형 배아 심실 내피 세포의 관상 동맥 신경 얼기 리모델링을 평가했다.

서론

불후의 세포 라인의 출현은 기본적인 세포 생물학 ¹ 혁명을 일으켰다. 현재 세포주 기관의 다양한에서 파생 된 모든 주요 세포 유형을 포함하고 있습니다. 그러나 설립 세포 라인은 몇 가지 제한이 있습니다. 불멸화 과정은 분명히 특히 수명과 확산에 대해, 세포의 동작을 변경하지만, ^또한이 세포 골격 단백질과 같은 예기치 않은 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 다른 세포 라인을 사용할 수 있지만 또한, 전체 유기체 내에서 단 한 번의 세포 유형 간의 유의 한 다양성이있다. 특히 쇼 다양한 행동의 내피 세포는 동맥이나 정맥 흐름의 종류는 용기 ^3에 존재하는 그들은 선 여부에 따라. 발달의 관점에서 훨씬 더 시급한 그러나, (참조, 예를 들면 t 사용할 수있는 세포 라인의 대부분이 성인 조직에서 파생 된 것입니다ATCC 통해 사용할 그가 컬렉션). 이러한 성인 세포주 가능성이 자신의 배아 전구체의 동적 특성을 요점을 되풀이하지 않습니다. 개발하는 동안 관찰 빠르게 변화하는 시공간 유전자 발현 패턴은 특정 발달 단계에서 하나의 기관에서 내피 세포가 다른 발달 단계에서 동일한 기관에서 내피 세포와 같은 방식으로 작동하지 않을 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

시중 ....

프로토콜

1. 항체 - 복합 구슬을 준비

1. 이전 해부 어느 날, 제조업체의 지침에 따라 해당 Dynabeads (쥐 제기 항체 예를 들어, 쥐의 IgG Dynabeads, 4 × 10 ⁸ 구슬 / ㎖)로 선택의 항체를 결합합니다. BD 쥐 항 CD31 항체 (0.5 ㎍ / ㎕의 내피 세포를 분리하는 데 사용)의 경우, 3 μL 항체 최종 1.5 μg 항 CD31 항체의 농도 / 1 × 10 ⁷ 비즈를 들어, 매 25 μL 비즈에 추가됩니다 25 μL 버퍼입니다.
2. 4 ° C.에 구슬과 밤새 항체를 품어

2. 콜라겐 플레이트를 준비

1. 단지 콜라겐 코팅 플레이트에 반대 콜라겐 겔에서 재배 할 때 절연 세포는 더 빠르게 세관을 형성한다. ^6에 설명 된대로 따라서 콜라겐 젤은, 해부 전날 밤에 만들어집니다. 조직 문화 후드에서 얼음에 다음과 같은 시약 (충분히 19 우물) 결합 : 206.4 μL 멸균 H를 <서브> 2 O, 140.4 μL 콜라겐 유형 I (4.08 밀리그램 / ML), 38.4 μL 배 M199, 그리고 1.15 μL 5 M NaOH를.
2. 384 잘 조직 배양 플레이트의 우물에이 콜라....

결과

CD31를 인식 내피 세포 특이 항체를 이용하여 내피 세포는 배아 (E) 13.5 (그림 1A) 및 18.5 (피규어 1B-1D) 배아의 심실에서 분리되었다. 치료 배양 접시에 성장하면,이 세포는 둥근 남아 근처 합류 (그림 1A) 만약 조약돌 패턴을 형성한다. 희석 콜라겐은 또한 우물 코트에 사용되어 왔으며, 내피 세포가 (그림 1B)을 준수 할 때, 그들은보다 적은 체인을 형성 할 때 콜라겐 겔에 도금 (그림의 1C 및 1D). 내피 세포는 콜라겐 코팅에 비해 콜라겐 겔에 성장 잘 때 콜라겐 겔 (그림의 1C 및 1D)를 형성 세포 - 세포 상호 작용과 콜라겐을 재배 할 때 분기를 시작 폼 체인이 과정을 포함하여 빠르게 발생의 성장 플레이트. 이 내피 체인 내피 세포 마커 ISO-렉틴과 긍정적 라벨 ( 그림 1D). 분리 .......

토론

기본 배아 세포와 작업 새로운 실험 개발의 체외 중요한 단계에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 분리 절차는 간단하지 않습니다. 세포의 모든 유형을 분리하는 중요한 단계는 세포가 잘 그들이 잘 세척 단계에서 중단되는 다음 콜라 소화에 분리되는 것을 보장 이용하실 수 있습니다. pipetting하여 기계적 박리 크게 콜라 단계에서 세포를 분리하는 데 도움이, 그리고 필터링 단계는 세포의 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 이 단계는 인구 순도를 향상시키고 얻을 수 있습니다.

도금 밀도는 작은 기관의 세포를 분리 중요한 관심사입니다. 관 형성 내피는 세포 밀도 ^7에 의존하고 있기 (위해) 때문에, 우리는 도금 밀도를 높이기 위해 384 잘 조직 배양 플레이트에 의존. 심지어이 고려, 우리는 낮은 세포 밀도 (다이어와 패터슨, 프로의를 수용하기 위해 몇 가지 분석을 수정해야했다) 진행률. 휴대폰 번호가 우려되고있는 경우, 작은 크기의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
< 강한>시약< / 강한>
임신 한 마우스			아 단계에서 해부
마우스 안티 마우스 CD31	BD Bioscience	553370
쥐 IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
콜라겐	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
콜라겐 분해 효소, 유형 I	Worthington 생화학	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	시그마 - 알드리치	F2442
내피 세포 성장 배지	(노트에 설명 된대로 실험실에서 만든)		DMEM 함유 20 % FBS, 5 μ M β-머캡트– 탄올, 50 μ g/ml ECG 및 1x 페니실린/스트렙토마이신
β-메르캡트– 탄올	시그마-알드리치	M6250
ECGS	생물 의학 기술, Inc.	BT-203
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140
트립신-EDTA	Gibco	25300
384-웰 배양 플레이트	Greiner	T-3037-6	플레이트는 6; 작업 표면적 10 mm2
Collagen type I	BD	354236	최종적으로 사용에 설명된 바와 같이 얇은 콜라겐 겔로 제조되었습니다. 1.5 mg/ml
M199의 농도, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	13
EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110
DynaMag의 지시에 따라 사용	Invitrogen	123-21D
탁상용 원심분리기	Thermo	75002430

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