항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

Summary

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

Abstract

황색 포도상 구균 균주의 광범위한 호스트 범위와 페니실린 결합 단백질 (PBP 2a에) 항체 결합 라텍스 구슬이 메티 실린 내성 (MRSA)에 민감 (MSSA) S의 차별을 위해 디자인 된 바이오 센서를 만드는 데 활용 된 데 구조적 변화 용해성 살균 . 구균 종 ^1,2. 용해성 파지는 물에 클로로포름 인터페이스와의 접촉에 의해 파지 상체로 변환되었습니다. 파지 회전 타원체 단층은 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) ^기법에 의하여 바이오 센서의 표면에 이동되었습니다. 생성 된 바이오 센서는 박테리아 파지 상호 작용을 평가하기 위해 분산 추적을 가진 석영 크리스탈 마이크로 (QCM-D)로 조사되었다. 박테리아 회전 타원체 상호 작용은 감소 공진 주파수와 MRSA와 MSSA 균주 모두에 대한 분산 에너지 상승했다. 세균 바인딩 한 후,이 센서는 또한 페니실린 결합 단백질 항체 라텍스 비드에 노출 된의. MRSA로 분석 센서는 2A 항체 비즈 PBP에 응답, MSSA에 검사 센서는 응답을 준 없지만. 이 실험 구별은 메티 실린 저항하고 민감한 S. 사이에 명확한 차별을 결정 구균의 변종. 마찬가지로 바운드 및 언 바운드 살균은 표면에 물 현탁액에있는 박테리아의 성장을 억제합니다. 용해성 파지가 상체로 변경되면, 그들은 그들의 강한 용해성 활동을 유지하고 높은 세균 캡처 기능을 보여줍니다. 파지와 파지 상체는 항생제 내성 미생물의 테스트 및 살균을 위해 이용 될 수있다. 다른 응용 프로그램은 박테리오파지 요법과 항균 표면에서의 사용을 포함 할 수 있습니다.

Introduction

황색 포도상 구균의 메티 실린 내성은 필수 감염과 원내 발생 ^4-8에 영향을 미치는 요인으로 제시되었다. 이러한 디스크를 확산 oxacillin 한천 스크린 테스트, 또는 국물 microdilution으로 메티 실린 저항의 인식의 일반적인 방법은, 저항의 표현을 향상시키기 위해 맞춤형 배양 조건에 의존한다. 변경은 oxacillin의 활용, ° C보다는 37 ° C 이상 30 35 배양 및 성장 매체의 NaCl의 포함이 (가) 있습니다. 또한, 기술의 이러한 유형으로 정확한 탐지를 위해, 24 시간의 긴 잠복기 대신에 16-18 시간의 필요합니다. 메티 실린 저항의 식별을위한 감도 적절한 (> 96 %) 수준의 빠른 기술은 3-11 시간 후 결과를 같은 VITEK GPS-SA 카드, 신속한 ATB 포도상 구균 시스템 및 신속한 Microscan은 패널 시스템으로 자동 microdilution 기술을 포함 ^9-11. 크리스탈 MRSA ID 시스템은 S.의 성장 인식에 따라 빠른 방법입니다 2 % 염화나트륨과 산소에 민감한 형광 센서 리터 당 oxacillin 4 MG의 존재 구균. 주장 감도는 배양 ^12-14 4 시간 후에 100-91 % 사이가 다양합니다. 이러한 표현형 방법은 서로 다른 저항을 표현하는 유행 균주의 영향으로 자신의 정확도에 제한됩니다. 따라서 메티 실린 저항의 인식을위한 가장 널리 사용되는 방법은 메카 유전자 ^15의 PCR 또는 DNA 혼성화입니다. 그러나이 기술은 정제 된 DNA가 필요하며 세포 파편 ¹⁶ 등 각종 혼화제 (불순물)에 매우 민감합니다.

또한, 이러한 기술을 수행하는 데 오랜 시간이 필요합니다. 메카 유전자 제품, 단백질 PBP 2a에의 인식 전략은 저항을 결정하기 위해 활용 될 수 있으며 표준 시험 방법 ^17에 비해 더 신뢰할 수 있습니다.

그것은 이전 살균 12600은 메티 실린 저항 ^1,2,18을 갖는 포함 황색 포도상 구균의 변종에 대한 인식 조사로 활용 될 수 있음을 표시했다. 이 작품에서 우리는 실시간으로 MRSA의 형태와 함께 박테리아의 인식과 같은 MRSA의 특정 인식 및 탐지에있는 새로운 기술을 제안 하였다. 이 특정한 목적 S.에 대한 단백질에 대한 단클론 항체와 결합 된 호스트의 다양한 스펙트럼 (MRSA 균주 포함) 구균 살균은 (PBP 2a에) 사용되었습니다. PBP 2a에는 세포벽 단백질이며 MRSA의 항생제 저항의 원인입니다. 그러나 PBP 2a에 항체는 S.에 대한 구체적인 없습니다 다른 박테리아 이후 구균 PBP 2a에 ^19,20에 서열의 유사성과 항생제 결합 단백질이 있습니다. 따라서 본 연구에서는 S. PBP 2a에 단백질에 대한 구균 살균 및 항체가 사용되었습니다. specifi에 바이오 센서를 개발 할 수 있으려면,으로 두 단계 동작을 활용 한로 장치를 인식하고 MRSA를 식별합니다. 초기 단계는 S.를 사용 센서 프로브와 같은 구균 살균의 단층, 두 번째 단계는 PBP 2a에 특정 항체를 고용하면서. 따라서 하나 S를 인식 단계 구균 박테리아, 다른 하나 항생제 결합 단백질에 민감 할 것입니다. 두 단계에서 수신 신호가 긍정적 인 경우는 MRSA의 특정 감지를 나타냅니다.

Protocol

1. 스테이지 설정

1. 형 균주 S.를 얻을 구균 ATCC 12600, S. 구균 ATCC의 27690과 바실러스 서브 틸리 스 ATCC는 6051입니다. S.의 메티 실린 내성 구균 - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis의 Sterne 다음, 살모넬라 티피 뮤 리움 LT2, 시겔 flexneri, 예 르시 니아 enterocolotica, 프로 테우스 mirabilis의, 폐렴 간균 13882, 용해성 파지 12600.
2. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬을 구하십시오.
3. ²¹ 설명 된대로 NZY 매체를 준비합니다.
4. 인산를 얻기는 생리 식염수 (PBS)를 버퍼.
5. 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 단층 증착 subphase로 증류수를 준비합니다.

2. 박테리오파지 전파 및 적정

1. S.의 하룻밤 문화 5 mL를 품다 파지의 500 μL (3 구균 ATCC 12600 (3.6 × 10 ⁸ 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖) × 10 ^{9 <}/ 37 ° C에서 하룻밤 쉐이커 인큐베이터에 2 L 플랙 500 ML의 NZY 매체에)> PFU / ㎖을 먹다.
2. 4시 10 분 4,424 XG에 문화를 원심 분리기 ° C.
3. 4 10 분 11,325 XG에서 다시 원심 분리 상층 ° C.
4. 0.22 μm의 밀리 포아 필터를 통해 필터 상층 액.
5. 1.5 시간 동안 75,395 XG에서 여과 액을 원심 분리기.
6. 증류수 100 μL에 펠렛을 녹인다.
7. NZY 매체에 파지 현탁액의 10 배 희석을 준비합니다.
8. S.의 하룻밤 (ON) 문화 판 1 ML 모든 표면이 포함되어 있는지 확인하는 NZY 한천 2 플레이트의 각 상 구균 ATCC 12600을. 문화의 과잉을 제거하고 30 분 동안 표면을 건조 할 수 있습니다.
9. 판의 표면에 적절한 파지 희석 시료 (10 μL)을 발견하고 18-24 시간 동안 37 ^℃에서 배양한다.
10. 플라크의 형성을 검토하고 파지 역가를 계산합니다. 살균 역가 (T)가 P의 수에 기초하여 추정laques (N)는 파지 서스펜션과 희석 계수 (F) 10 μL 부피 (V) 당 형성했다. . T는 = N / (VXF) 예를 들어, 희석 ^10-7에서 플라크의 수를 75 부피 10 μL (10 × 10 ^-3 ML)의 경우, 역가가 75 / 같습니다 : 역가가 공식으로 계산 하였다 (10 × 10 ^-3 × 10 ^-7) = 7.5 × 10 ¹⁰ 플라크 형성 단위 (PFU) 당 ML 정지.

3. 금 고정 파지

1. 다음 10 분 동안 아르곤 에칭 플라즈마에 의한 깨끗한 골드 코팅 된 석영 조각 (60mm ²⁾ 살균 캐비닛에 UV 빛의 밑에 6 시간 동안 살균.
2. 멸균 페트리 접시에있는 각 조각의 금 표면에 1 × 10 ⁹ PFU / ㎖ 파지 현탁액의 50 μl를 추가하고 실온에서 습기 챔버에서 하룻밤 배양한다.
3. 나머지 파지 현탁액을 제거하고 역가.
4. 언 바운드를 제거하는 PBS로 파지와 조각 5 번 씻으십시오파지.

4. 건조한 표면에 고정 파지 감염성 테스트

1. NZY 한천 배지에 S. 구균 ATCC 12600의 O / N 문화를 확산하고 건조 할 수 있습니다.
2. 플레이트 얼굴에 고정 파지와 금 조각을 아래로 놓습니다.
3. 37 12 시간 배양 한 후 용해의 영역을 관찰 ° C 그 감염을 나타냅니다.
4. 제어 실험없이 파지와 골드 커버 조각을 사용합니다.

5. 액체의 무료와 바인딩 파지의 용해성 활동의 테스트

1. S.의 ON 문화 추가 네 300 ML 사이드 암 플라스크의 모든 (6 × 10 ⁶ CFU / 각 플라스크에 ml)에 NZY의 구균 ATCC 12600-10 ML.
2. 두 개의 플라스크 2 × 10 ⁶ PFU / 무료 파지의 ML에 추가합니다.
3. 컨트롤과 같은 다른 두 플라스크를 사용합니다.
4. S.의 시간 경과를 모니터링 모든 플라스크 30 분 간격으로 광학 밀도 측정 (OD _600)의 570 분 구균 세포 용해.
5. 24 시간에서 최종 측정을 가져 가라.
6. 단계 5.1-5.5를 반복하지만, 제어 플라스크 없음 파지 골드 바운드 파지 대신 무료로 파지와 조각, 골드 조각을 사용합니다.

6. 부화하는 동안 바인딩 파지 손실

1. 실온에서 하룻밤 습도 챔버에 배치됩니다 페트리 접시에 무균 금 조각의 표면에 1 × 10 ⁹ PFU / ㎖ 파지의 50 μl를 추가합니다.
2. 금 표면과 역가에서 언 바운드 파지와 서스펜션을 제거합니다.
3. 8 시간 동안 37 ° C에서 5 PBS로 시간과 장소 쉐이커 배양기에서 15 ML 튜브 1 ML의 NZY 솔루션 바운드 파지와 금 조각을 씻으십시오.
4. 2에 설명 된대로 분리 된 파지의 역가를 결정합니다.

7. 파지 상체 준비

1. 1 ML 유리 병의 분광 등급 클로로포름의 동일한 볼륨 스톡 파지 12600 서스펜션 (10 ¹¹ PFU / ㎖)의 400 μl를 결합실온에서.
2. 부드럽게 소용돌이 5-6 시간 (5 초 간격) 일분 기간 동안 파지 - 클로로포름 서스펜션.
3. 30 초 동안 안정하고 상체는 단층 준비를 위해 전원 피펫되었다가 포함 된 상위 단계의 피펫 현탁액을 허용했다.
4. 전송 및 주사 전자 현미경 상체 현탁액의 몇 마이크로 리터를 가져 가라.
5. 바이오 센서의 제조에 남아있는 회전 타원체 현탁액을 사용합니다.

8. 바이오 센서 제조

1. 10 분 PDC-32G Harrick 플라즈마 클리너 아르곤 플라즈마 에칭에 의한 청소 QCM-D 센서.
2. 모든 유기 불순물을 제거하는 헥산으로 센서를 씻어.
3. 준비하고 ^22에 설명 된 필름의 균형 구유를 청소하십시오.
4. subphase 솔루션 LB 트로프를 입력하고 여물통 장벽을 청소하고 20 통을 안정화 ± 0.1 ° C
5. 수성 suspensi에있는 파지 12600 300 μL 나누어지는 확산LB의 subphase 상 (10 ¹¹ PFU / ㎖)에.
6. 부분적으로 subphase ^22,23으로 침수되는 경사 적실 유리 막대를 실행하는 파지 12600 현탁액 300 μL 나누어지는 (10 ¹¹ PFU / ㎖)함으로써 LB의 subphase 솔루션에 파지 단층을 준비합니다.
7. 10 분 동안 준비된 단일 층을 안정화하고 일정한 압력까지 19 N / m를 달성되어, 30mm / 분 (45cm ² / 분)의 비율로 압축합니다.
8. 연속적으로 단층의 일곱 번 센서에서 찍기에 의해 밖으로 4.5 mm / min의 속도로 수직으로 QCM-D 센서에 수직 증착을 수행합니다. 박테리아 샘플에 노출 레이어 (데이터 표시되지 않음), 연속 균질하고 균일 한 것으로 나타났다 전에 전자 현미경으로는 파지 단일 층을 증착.
9. 반복 3 준비 파지 구형 서스펜션 4.5-4.8 단계를 반복합니다.
10. MRSA 검출, 전자에 대한 제작 파지 바이오 센서를 사용하여현미경, 및 타원.

9. 바이오 센서 테스트, 메티 실린 저항의 차별과 민감한 황색 포도상 구균 박테리아

1. 이 프로토콜에서는 수정되지 않은 수정 된 파지 및 파지 상체와 바이오 센서는 준비가되어 있습니다. 네 개의 센서 유량 용기를 가진 석영 크리스탈 마이크로는 QCM 센서의 표면에 고정 파지에 박테리아의 바인딩을 모니터링하는 데 사용됩니다. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별하기 위하여 이용된다. 모든 측정은 5 MHz에서 유동 모드 (50 μL / 분)에서 실시하고 있습니다.
2. 물 (~ 30 분)에 QCM 센서의 기본 라인 공진 주파수를 설정합니다.
3. 테스트 셀을 통해 물에 살고있는 메티 실린 민감 황색 포도상 구균 박테리아 세포 (10 ⁹ CFU / ㎖)의 현탁액을 그립니다.
4. 지속적으로 최초의 배음, USI에 대한 센서의 공진 주파수와 에너지 소모의 변화를 모니터링NG는 Q-소프트 소프트웨어입니다.
5. 센서의 공진 주파수와 손실의 변화가 포화 수준에 도달 할 때, 주파수와 소비의 지속적인 모니터링 중에 흐름 PBP 항체 결합 라텍스 구슬 (6.77 배 ¹⁰ 비즈 / ML)의 정지를 추가합니다.
6. 반복 메티 실린 내성 포도상 구균 박테리아 세포 (MRSA)에 대한 9.2-9.5 단계를 반복합니다.
7. C는 상수 (C = 17.7 NG X cm ^-2 X Hz에서 ^-1 5 MHz의 질량 감도 Sauerbrey 식 ^24,25 Δf에 =-ΔM XN / C에 의해 바인딩 세균에 의한 질량 변화를 통해 주파수 변화를 정의 ), M은 질량 n은 배음의 수 (N = 1)입니다.
8. 기록에서 에너지 소비의 변화 (Δ D)를 정의 진동의 지수 감쇠 (주파수와 진폭 진동의 한주기 동안 소비 및 저장 에너지의 정량화를 허용하는 완충,각각 E는 _소비와 E가 _저장 : Δ D = E _소산 / 2 πE가 _{저장됩니다.} Δ D는 분산 단위 (DU), 하나의 DU = 10 ^-6 상대 단위)로 측정됩니다.

Results

파지는 S.의 시험 균주에 대한 용해성 활동을 보여 로 파지 현장 시험에 의해 표시 MRSA 균주를 포함 구균. 플라크의 크기는 일반적으로 5 ~ 15 mm까지였다. 활동은 다른 테스트 배양 (표 1)에 대해 찾을 수없는 경우.

S.의 정상적인 성장 37 쉐이커 인큐베이터에 NZY 매체 구균 ATCC 12600는 ° C는 그림 1A (빈 원으로 표시된 곡선)에 표시됩니다. 세균의 수는 4.0으로 X 10 ⁶ 3.2로 증가 × 10 ⁸ CFU / ㎖. 그림 1A는 (채워진 원으로 표시된 곡선) 2.0 × 10의 공동 재배의 결과를 보여줍니다 ⁶ PFU / ㎖ 무료 파지 동시에로 추가 S.의 동일한 농도 구균 ATCC 12600. 금 표...

Discussion

그것은 잘 파지는 세균 병원체 ²⁸ 바이오 센서 프로브로 사용할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 빠른 차별 항생제 내성 민감한 균주 : 그것은 PBP 2a에 항체과 함께 파지 이전 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있는이 작품에서 보여줍니다.

그것은 그러나 이러한 일반적인 수정되지 않은 포도상 구균 파지들이 박테리아를 바인딩에도 불구하고, QCM 장치와 세균 검출에 적합하지 않습니다 발견되었다. 파지의 꼬리는 음향 파도 파지 꼬리의 끝 부분에 바인딩 박테리아 "에 도달 할 수 없습니다"너무 깁니다. 이 조건은 (그림 3A 및 3B) EM에 의해 이미지를 보여 상당한 바인딩에도 불구하고 공진 주파수 및 분산 변경 사항을 등록하는 "누락 매스"효과 ²⁹ 무능력의 결과. 이 문제는 쉽게 상체에 그대로 파지를 교체하여 해결되었다, 파지는 클로로포름 물 처리에 의해 수정. 이 치료는...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
분광광도계 등급 클로로포름	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
에틸 알코올	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a 항체 접합 라텍스 비드	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 및 American Type Culture Collection(버지니아주 머내서스)의 Bacillus subtilis ATCC 6051	;
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. 탄저병 Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; 용해성 파지 12600	Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB 필름 밸런스	KSV Chemicals, 핀란드
광학 현미경 광학 시스템	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä 스트라 Frö 룬다, 스웨덴	E4
주사전자현미경(SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
투과전자현미경(TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μ m, GP Express PLUS
멤브레인 바이오 분석 접시	NUNC A/S, 덴마크	240835	치수(mm), 245 x 245 x 25
피펫	Gilson, Pipetman, 프랑스	P100, P200, P1000
C24 인큐베이터 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽, CT	클래식 C24
골드 코팅 석영 조각	Auburn University, AL		수제
페트리 접시	Fisher Brand, 미국		0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
배양 플라스크	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml 삼각 플라스크
광학 분광계	Genesys 20. 써모 스펙트로닉, 미국.	4001
플라즈마 클리너	Harrick Plasma, 미국	PDC-32G
Millipore 정수 시스템	Millipore	Direct-Q
이미징 타원계	Accurion, 미국	nanofilm_ep3se
소프트웨어	Q-Sense AB, 스웨덴	QSoft, QTools