항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

Summary

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

Abstract

황색 포도상 구균 균주의 광범위한 호스트 범위와 페니실린 결합 단백질 (PBP 2a에) 항체 결합 라텍스 구슬이 메티 실린 내성 (MRSA)에 민감 (MSSA) S의 차별을 위해 디자인 된 바이오 센서를 만드는 데 활용 된 데 구조적 변화 용해성 살균 . 구균 종 ^1,2. 용해성 파지는 물에 클로로포름 인터페이스와의 접촉에 의해 파지 상체로 변환되었습니다. 파지 회전 타원체 단층은 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) ^기법에 의하여 바이오 센서의 표면에 이동되었습니다. 생성 된 바이오 센서는 박테리아 파지 상호 작용을 평가하기 위해 분산 추적을 가진 석영 크리스탈 마이크로 (QCM-D)로 조사되었다. 박테리아 회전 타원체 상호 작용은 감소 공진 주파수와 MRSA와 MSSA 균주 모두에 대한 분산 에너지 상승했다. 세균 바인딩 한 후,이 센서는 또한 페니실린 결합 단백질 항체 라텍스 비드에 노출 된의. MRSA로 분석 센서는 2A 항체 비즈 PBP에 응답, MSSA에 검사 센서는 응답을 준 없지만. 이 실험 구별은 메티 실린 저항하고 민감한 S. 사이에 명확한 차별을 결정 구균의 변종. 마찬가지로 바운드 및 언 바운드 살균은 표면에 물 현탁액에있는 박테리아의 성장을 억제합니다. 용해성 파지가 상체로 변경되면, 그들은 그들의 강한 용해성 활동을 유지하고 높은 세균 캡처 기능을 보여줍니다. 파지와 파지 상체는 항생제 내성 미생물의 테스트 및 살균을 위해 이용 될 수있다. 다른 응용 프로그램은 박테리오파지 요법과 항균 표면에서의 사용을 포함 할 수 있습니다.

Introduction

황색 포도상 구균의 메티 실린 내성은 필수 감염과 원내 발생 ^4-8에 영향을 미치는 요인으로 제시되었다. 이러한 디스크를 확산 oxacillin 한천 스크린 테스트, 또는 국물 microdilution으로 메티 실린 저항의 인식의 일반적인 방법은, 저항의 표현을 향상시키기 위해 맞춤형 배양 조건에 의존한다. 변경은 oxacillin의 활용, ° C보다는 37 ° C 이상 30 35 배양 및 성장 매체의 NaCl의 포함이 (가) 있습니다. 또한, 기술의 이러한 유형으로 정확한 탐지를 위해, 24 시간의 긴 잠복기 대신에 16-18 시간의 필요합니다. 메티 실린 저항의 식별을위한 감도 적절한 (> 96 %) 수준의 빠른 기술은 3-11 시간 후 결과를 같은 VITEK GPS-SA 카드, 신속한 ATB 포도상 구균 시스템 및 신속한 Microscan은 패널 시스템으로 자동 microdilution 기술을 포함 ^9-11. 크리스탈 MRSA ID 시스템은 S.의 성장 인식에 따라 빠른 방법입니다 2 % 염화나트륨과 산소에 민감한 형광 센서 리터 당 oxacillin 4 MG의 존재 구균. 주장 감도는 배양 ^12-14 4 시간 후에 100-91 % 사이가 다양합니다. 이러한 표현형 방법은 서로 ....

Protocol

1. 스테이지 설정

1. 형 균주 S.를 얻을 구균 ATCC 12600, S. 구균 ATCC의 27690과 바실러스 서브 틸리 스 ATCC는 6051입니다. S.의 메티 실린 내성 구균 - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis의 Sterne 다음, 살모넬라 티피 뮤 리움 LT2, 시겔 flexneri, 예 르시 니아 enterocolotica, 프로 테우스 mirabilis의, 폐렴 간균 13882, 용해성 파지 12600.
2. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬을 구하십시오.
3. ²¹ 설명 된대로 NZY 매체를 준비합니다.
4. 인산를 얻기는 생리 식염수 (PBS)를 버퍼.
5. 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 단층 증착 subphase로 증류수를 준비합니다.

2. 박테리오파지 전파 및 적정

1. S.의 하룻밤 문화 5 mL를 품다 파지의 500 μL (3 구균 ....

Results

파지는 S.의 시험 균주에 대한 용해성 활동을 보여 로 파지 현장 시험에 의해 표시 MRSA 균주를 포함 구균. 플라크의 크기는 일반적으로 5 ~ 15 mm까지였다. 활동은 다른 테스트 배양 (표 1)에 대해 찾을 수없는 경우.

S.의 정상적인 성장 37 쉐이커 인큐베이터에 NZY 매체 구균 ATCC 12600는 ° C는 그림 1A (빈 원으로 표시된 곡선)에 표시됩니다. 세균의 수는 4.0으로 X 10 ⁶ 3.2로 증가 × 10 ⁸ CFU / ㎖. 그림 1A는 (채워진 원으로 표시된 곡선) 2.0 × 10의 공동 재배의 결과를 보여줍니다 ⁶ PFU / ㎖ 무료 파지 동시에로 추가 S.의 동일한 농도 구균 ATCC 12600. 금 표.......

Discussion

그것은 잘 파지는 세균 병원체 ²⁸ 바이오 센서 프로브로 사용할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 빠른 차별 항생제 내성 민감한 균주 : 그것은 PBP 2a에 항체과 함께 파지 이전 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있는이 작품에서 보여줍니다.

그것은 그러나 이러한 일반적인 수정되지 않은 포도상 구균 파지들이 박테리아를 바인딩에도 불구하고, QCM 장치와 세균 검출에 적합하지 않습니다 발견되었다. 파지의 꼬리는 음향 파도 파지 꼬리의 끝 부분에 바인딩 박테리아 "에 도달 할 수 없습니다"너무 깁니다. 이 조건은 (그림 3A 및 3B) EM에 의해 이미지를 보여 상당한 바인딩에도 불구하고 공진 주파수 및 분산 변경 사항을 등록하는 "누락 매스"효과 ²⁹ 무능력의 결과. 이 문제는 쉽게 상체에 그대로 파지를 교체하여 해결되었다, 파지는 클로로포름 물 처리에 의해 수정. 이 치료는.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
분광광도계 등급 클로로포름	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
에틸 알코올	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a 항체 접합 라텍스 비드	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 및 American Type Culture Collection(버지니아주 머내서스)의 Bacillus subtilis ATCC 6051	;
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. 탄저병 Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; 용해성 파지 12600	Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB 필름 밸런스	KSV Chemicals, 핀란드
광학 현미경 광학 시스템	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä 스트라 Frö 룬다, 스웨덴	E4
주사전자현미경(SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
투과전자현미경(TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μ m, GP Express PLUS
멤브레인 바이오 분석 접시	NUNC A/S, 덴마크	240835	치수(mm), 245 x 245 x 25
피펫	Gilson, Pipetman, 프랑스	P100, P200, P1000
C24 인큐베이터 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽, CT	클래식 C24
골드 코팅 석영 조각	Auburn University, AL		수제
페트리 접시	Fisher Brand, 미국		0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
배양 플라스크	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml 삼각 플라스크
광학 분광계	Genesys 20. 써모 스펙트로닉, 미국.	4001
플라즈마 클리너	Harrick Plasma, 미국	PDC-32G
Millipore 정수 시스템	Millipore	Direct-Q
이미징 타원계	Accurion, 미국	nanofilm_ep3se
소프트웨어	Q-Sense AB, 스웨덴	QSoft, QTools