신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다 생체 내 컨텍스트. 정확하게 혈관 신경 얼기를 시각화하는 면역 형광 염색 연구의 이러한 유형의 성공에 필수적이다.
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이 논문에서
요약
초록
혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 발아에 의해 정의 된 새로운 혈관 형성의 복잡한 과정이다. 혈관 신생은 암, 실명 및 허혈성 질환 등의 혈관 형성 dysregulated되는 많은 질병, 또한뿐만 아니라 장기 및 조직의 정상적인 발달에 중요한 역할을하지만. 혈관 질병에 특히 새로운 혈관 형성을 시도하고 조절하는 새로운 약물 개발을위한 중요한 목표 그래서 성인 생활에, 혈관은 일반적으로 정지합니다. 더 나은 혈관을 이해하고이를 조절하는 적절한 전략을 개발하기 위해 모델은 정확하게 관련된 다른 생물학적 단계를 반영해야합니다. 동맥, 정맥 및 모세 혈관이 출생 후 첫 주 동안 혈관 신경 얼기를 형성하기 위해 개발 때문에 마우스 신생아 망막 혈관의 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한이 모델은 두 디를 갖는 장점이있다mensional (2D) 구조는 다른 혈관 네트워크의 복잡한 3D 해부학에 비해 간단하게 분석을하고. 출생 후 다른 시간에 망막 혈관 신경 얼기를 분석하여, 그것은 현미경으로 혈관의 여러 단계를 관찰 할 수 있습니다. 이 문서 isolectin 혈관 특정 항체와 형광 염색법을 사용하여 마우스 망막의 혈관을 분석 간단한 절차를 보여줍니다.
서론
혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 형성에 의해 정의 된 여러 신호 전달 경로에 의해 조절되는 복잡한 발달 과정입니다. 이들 중 가장 눈에 띄는 VEGF 경로입니다. VEGF는 주변 혈관의 싹이 혈관의 개시에 허혈성 세포와 리드에 의해 발표된다. 새싹 새 혈관에서 선도적 인 내피 세포는 VEGF의 근원을 향해 밖으로 도달하는 filopodia를 생산하는 '팁'세포이며, '줄기'내피 세포 증식옵니다. 이러한 방법으로, 활성화 된 내피 세포는 마이그레이션하고 새로운 혈관 튜브를 형성하는 곳 무혈성 지역으로 확산. 혈액의 흐름을 지원하기 위해 이러한 튜브를 안정화하기 위해, 내피 세포는 혈관 주위 세포와 새로운 혈관 1 서라운드 평활근 세포와 상호 작용합니다. 혈관은 태아 성장 조직의 혈관을 위해 필수적이다. 그러나, 그것은 또한 많은 pathologi에 기여암과 같은 칼 장애, 혈관의 결함은 허혈성 질환과 관련된 반면. 질병을 치료하는 수단으로 혈관 신생을 조절하는 효과적인 약물 치료의 개발은 큰 관심을 따라서이다. 예를 들어, 효과적인 안티 - 혈관 요인은 암의 성장을 줄일 프로 혈관 전략 허혈성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 반면됩니다. 따라서, 혈관의 모델은 더 나은 새로운 혈관 형성과 혈관 성장을 강화하거나 줄일 수있는....
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프로토콜
달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다.
1. 출생 후의 눈의 안구 적출술 및 고정
- 옆에 강아지 인도적 사망 마우스를 놓고 가위로 눈을 덮고있는 피부를 제거합니다.
- 눈을 명백히 가위와 집게를 사용합니다.
- 탈핵 눈 아래 장소 가위는 시신경과 주변 조직을 잘라 눈을 밖으로 들어 올립니다. 실온에서 2 배 PBS에서 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다.
- 각각의 눈은 10 수정 할 수 있습니다 - 10 분 - 15 분 후, 5 얼음 차가운 배 PBS로 전송할 수 있습니다. 그것은 고정의 정도가 각각의 눈에 대한 동일한지 확인 enucleations 및 후속 고정을 엇갈리게하는 것이 좋습니다.
2. 출생 쥐과 망막의 해부
- 2X PBS를 포함하는 페트리 접시에 전송 눈들이 상자 아래에 구멍과 장소를 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여현미경을 cting.
- 집게와 가위를 사용하여 눈 주위 모든 지방을 제거합니다.
- 피어스 날카로운 가위로 각막의 가장자리와 각막과 홍채 및 폐기 주....
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결과
절개 후 망막 평면 꽃 (그림 1)과 같다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내피 세포는 안티 - 알파 평활근 액틴 (그림 2)를 사용하여 시각화하는 isolectin B4-Alexa488 염색을 사용하여 혈관 근육 세포를 지원 볼 수 있습니다. 그림 2에서 5 배 목표를 사용하여 저전력보기는 망막의 혈관 조직의 개요를 할 수 있습니다. 또한, 위의 프로토콜에 주어진 항체의 다른 조합을 사용하여, 내피 세포는 항-CD31 면역 염색 및 지원 혈관 주위 세포가 NG2 (그림 3) 또는 최근 desmin (그림 4)에 대한 항체를 사용하여 볼 수를 사용하여 볼 수 있습니다. 반대로 최근 desmin 염색은 혈관 주위 세포의 과정처럼 손가락을 시각화하고 밀접 내피 세포와 연결되어 있는지 여부를 확인하는 데 유용합니다. 반면에, 반대로 NG2 염색 할 때 유용합니다, 각 혈관 주위 .......
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토론
여기에 제시된 방법은 혈관의 쉽게 정량화 및 생리학 관련 모델을 만들고, 신생아 마우스 망막의 스테인드 전체 마운트 준비의 이미지를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 처음에는 마우스 아이는 작은 크기와 지구본 모양으로 인해 해부하는 것은 매우 어려울 수 있습니다, 연습과 좋은 해부 도구는 신뢰할 수있는 결과를 위해 필요하므로. 이 눈에서 물 손실 소량의 원인과 절개를 용이하게 내부 궤도 압력을 줄일 수 있기 때문에 PBS의 2 배 농도에서 제조 된 눈의 해부 중요하다. 망막의 좋은 준비는 여러 가지 이유로 중요합니다. 첫째는 혈관의 무결성을 유지합니다. 유리체의 혈관이 잘 제거되지 않은 경우 둘째, 배경의 높은 수준에 이르는, 항체 염색법의 효율성을 줄이고 해상도를 감소. 망막의 PFA 고정 시간이 너무 긴 경우이 문제가 발생할 수 있습니다. 하지만,이전의 염색에, -20 ° C의 냉동고에 메탄올 몇 개월 장기 저장을 위로 이전 isolectin 염색을 표 1에 항체 가장 적합합니.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 Wellcome 트러스트와 영국 심장 재단에 의해 후원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| < 강한> 재질 < / 강> | |||
| 플라스틱 피펫 3 ml | 과학 실험실 용품 | PIP4210 | 가위로 팁을 제거하여 넓은 구멍을 만듭니다 |
| BD Falcon 24 웰 플레이트 | 과학 실험실 용품 | 353226 | |
| 페트리 접시 TV 90mm | 과학 실험실 용품 | SLS2002 | |
| Histobond 슬라이드 | VWR | 631-0624 | |
| 커버 슬립 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont 핀셋 # 5 | 세계 정밀 기기 | 14095 | |
| 스프링 가위 길이 10.5cm, 직선 8mm 블레이드 세계 | 정밀 기기 | 501235 | 적출에 사용 |
| Vannas 가위 길이 8.5cm, 직선 7mm 블레이드 및 0.025 x 0.015mm 극상 팁 | 세계 정밀 기기 | 500086 | 8cm |
| 길이의 직선 3mm 블레이드와 0.015 x 0.015 mm 극세 팁이 있는 초미세 반나 가위를 | 세계 정밀 기기 | 501778 | 를 해부하는 데 사용됩니다 |
| ’ 튜브 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate 이염기성 | 시그마 | S0876 | PBS 시약 |
| 인산칼륨 일염기 | 시그마 | P5655 | PBS 시약 |
| 염화나트륨 | 시그마 | S9625 | PBS 시약 |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | P6148 | 2x PBS로 구성하고 -20 °에서 보관하십시오. C |
| BSA | 시그마 | A7638 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T9284 | |
| 당나귀 혈청 | 시그마 | D9663 | |
| 염소 혈청 | 벡터 | S-1000 | |
| Prolong Gold 퇴색 방지 시약 | Invitrogen | P36930 | 장착 시약 |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | 사용 1:200 희석 |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | 1:200 희석 |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal) | Millipore | AB5320 | pericytes |
| Detection Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detect astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, | Millipore | 04-585 | 주피세포 검출 |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | 혈관 기저막 |
| 검출 안티알파 평활근 actin-Cy3 (클론 1A4, 마우스 단클론) | Sigma | C6198 | 혈관 평활근 세포를 검출합니다. |
| Anti-Endoglin (클론 MJ7/18, 쥐 단클론) | BD Pharmingen | 550546 | 내피 세포 검출 |
| Anti-CD31 (클론 MEC13.3, 쥐 모노클론) | BD Pharmingen | 553370 | 내피 세포 |
| 검출 Anti-VE-Cadherin (클론 11D4.1, 쥐 모노클로날) | BD Pharmingen | 550548 | 내피 세포 접합 |
| 검출 Anti-Alk1 (염소 다클론) | R& D Systems | AF770 | 내피 세포 |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | 모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 °C에 보관됩니다. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 °C에 보관됩니다. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | 모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 °C에 보관됩니다. |
| 염소 안티-마우스-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 °C에 보관됩니다. |
| 당나귀 anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | 모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 °C에 보관됩니다. |
| < 강한> 현미경 | |||
| 해부 현미경 | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 카메라 | Zeiss | Axiocam HRc | 카메라 해부 현미경 |
| 용 Epifluorescent 현미경 | Zeiss | Axioimager Apotome | |
| Axiocam HRm | 카메라 Axioimager | ||
| 컨포칼 현미경 | 니콘 | A1R | |
참고문헌
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004....
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재인쇄 및 허가
