의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에서 우리는 공 초점의 intravital 현미경의 사용을 기반으로 라이브 설치류에 이미지 세포 내 구조에 절차를 설명합니다. 그들은 몇 가지 장점을 제공하기 때문에 모델 기관으로, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘을 사용합니다. 첫째, 그들은 쉽게 광학계에 액세스 할 수 있도록 노출, 및 심장 박동과 호흡에 의한 모션 아티팩트의 감소를 용이하게 안정화 될 수있다. 이것은 크게 이미징 및 작은 세포 내 구조를 추적을 용이하게한다. 둘째, 침샘의 세포 인구의 대부분은 장기의 표면에서 액세스 할 수 있습니다. 이는 두 개의 광자 현미경과 같은 생체 내 이미징을 위해 사용 된 다른 기술,보다 높은 공간 해상도를 공 초점 현미경의 사용을 허용한다. 마지막으로, 침샘 쉽게 따라서 분자 수준에서 생물학적 과정을 조사 할 수있는 강력한 시스템을 제공, 약리학 적 및 유전 조작 할 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 선방 세포에서 분비 과립의 세포 외 유출 및 분비 과립 베타 - 아드레날린 수용체의 자극에 융합 혀끝의 세포막의 역학의 역학을 수행하도록 설계된 프로토콜에 초점을 맞 춥니 다. 특히, 우리는 세포질의 GFP 및 형광 단백질 탠덤 토마토와 융합 막 대상 펩타이드를 공동으로 표현 형질 전환 마우스를 사용. 그러나, 우리는 침샘을 안정시켜 화상에 사용되는 절차는 다른 마우스 모델로 확장하고 엔도 좀, 리소좀, 미토콘드리아 등 다양한 세포 내 구조의 시각화를 가능하게 생체 내 세포 성분에 라벨을하기위한 다른 방법으로 결합 될 수 있고, 액틴 세포 골격.
서론
지난 20 년에 살고있는 현미경의 출현과 형광 단백질의 사용은 따라서 세포 생물학 1에 대한 우리의 이해를 발전, 상상할 수있는 모든 세포 과정에 대한 주요 분야를 이끌고있다. 이 필드는 실험 조작에 관해서 특히 매우 강력한 모델 시스템이다 포유 동물 세포 배양의 사용에서 엄청난 혜택을 받았다. 그러나, 그들은 종종 복잡한 다세포 생물 2의 생물학의 진정한 표현을 제공하지 않습니다. 이 문제는 신경 생물학, 면역학 및 종양 생물학 3 등의 분야에서 중요한 생물 학적 질문 조사에 문을 열었습니다 그의 intravital 현미경 (IVM)의 개발에 의해 해결되기 시작했다. 지금까지, IVM에 기초 연구의 대부분은 세포 내 구획의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않고, 조직 및 개개의 세포 수준에서 수행되었다. 최근에, 우리의 실험실 및 기타의 라이브 설치류 4-7, 13-15 및 생체 내에서 약물 및 유전자 조작을 허용 이미징 세포 내 구조 할 수 IVM 기술을 개발했습니다. 이 방법은 생체 내에서 막 인신 매매를 연구하기 위해 우리가 사용하고,보다 구체적으로 이입과 세포 외 유출 6,7를 규제하고있다.
우리의 실험....
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프로토콜
제 1 부 : 현미경 및 이미징 설치 준비
- 어떤 반전 공 초점 현미경은 IVM에 적합해야한다. 본 연구에서는 Fluoview-1000 레이저 스캐닝 공 초점 유닛을 탑재 올림푸스 IX81 도립 현미경을 사용 하였다. 최상의 해상도를 달성하기 위해, 예를 들면 물에 침수 UPLSAPO 60x/1.20 NA, 기름 침수 계획 - 아포 60x/1.42 NA 높은 NA 목적의 사용을 권장합니다. 오일 침지 목적은 높은 수집 효율을 가지고 그들이 조직과 대물 간의 커버 슬립의 사용을 필요로하더라도 표면으로부터 15 ~ 20 ㎛의 내 이미지 영역에서 사용하는 경우, 그들은 더 나은 영상 품질을 제공한다. 또한, 오일의 사용은 더 긴 이미징 세션 중에 수분 증발에 대한 우려를 제거한다. 온도 및 습도를 유지하기 위해, 현미경은 완전히 밀폐되어야하고, 따뜻한 습윤 공기가 공급. 대안 적으로, 동물, 현미경 스테이지 및목적은 다른 수단에 의해 따뜻하게해야합니다. 예를 들어, 화학 열 패드 동물과 스테이지를 위해 사용될 수 있고, 특별히 설계된 대물 히터 대물 (도 1a)에 사용될 수있다. 대물 히터 절차를 시작하기 전에 30 분에 전환해야한다. 참고 : 열 패드 거즈 패드와 피부 사이에 배치하는 따뜻한 동물을 유지하기 위해 사용하는 경우. 피부가 화상을 모....
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결과
GFP / mTomato 마우스에서 선포 세포는 세포 내 GFP 및 막 대상 직렬 - 토마토 펩타이드 (그림 2, 점선을) 표현으로 명확하게 구별되는 구조를 나타납니다. 개별 선포 세포에서 선포 세포는 탠덤 - 토마토 펩타이드로 구분된다. GFP는 명확하게 (그림 2, 화살표) 선포 세포 내부에 볼 수 있습니다 핵에서 발견됩니다. 세포질 GFP는 직경 약 1.5 ㎛, 어두운 원형 소포 (그림 2, 삽입, 화살촉)를 표시 분비 과립에서 제외됩니다. exocytic 이벤트를 시각화하기 위해, 우리는 (3, 별표 그림) 분비 과립에 충실 세포막의 한 영역에 초점을 맞 춥니 다. 0.1 ㎎ / kg의 이소 피하 주사 후에, 우리는 원형질막 (도 3, 초록색 화살표)에 가까운 위치에 분비 과립의 일부 주변의 GFP 형광 수준의 증가를 관찰한다. P로revi.......
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토론
지금까지 세포 내 구조는 주로 체외 (즉, 세포 배양) 또는 종종 그대로 살아있는 조직 (6)의 특성을 요점을 되풀이하지 않는 생체 (즉, 장기 배양, 조직 조각, 선포 준비) 모델 시스템의 이미지가되었다. 그것은 살아있는 생쥐의 특정 막 인신 매매 단계 (즉, 규제 세포 외 유출)의 역학을 영상화 할 수 있기 때문에이 점에서, 여기에 제시된 방법은 중요한 돌파구를 나타냅니다.
이 프로토콜은 체강 10,11,13-15에서 SG를 또는 다른 장기의 생체 내 이미징을 위해 설계된 다른 절차에 대한 존중과 함께 상당한 발전을 나타냅니다. 우리의 이전 연구의 일부는 수술에 더 탄력적 큰 기관이 쥐에서 수행하고, 마우스에 비해 감소 된 심장 박동했다. 생쥐의 절차를 설정하기가 어렵습니다,하지만, 그들은 여러 ADVA을 제공질병 모델, 형질 전환 및 녹아웃 동물의 광범위한 스펙트럼을 .......
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감사의 글
이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 치과와 두개 안면 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| < 강한>시약 < / 강> | |||
| 이소 플루 란 (Forane) | Baxter | 101936-40 | 화학 후드 아래 핸들 |
| 케타민 (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | 재고 용액 100 mg / ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | 재고 용액 100 mg / ml |
| Neomycin / Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | 마우스의 눈을 윤활하는 데 사용 |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-소르비톨 | 시그마-알드리치 | S1876 | |
| 트리에탄올아민 | 시그마-알드리치 | 90279 | 용액이 응고되는 것을 방지하기 위해 드롭 와이즈를 추가하십시오 |
| 시그마-알드리치 | 16504 | 필요할 때 식염수에 새로운 용액을 준비하십시오. 재고는 -20 ° C | |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (기화기) | Braintree Scientific | 190AF | |
| HEPA 필터가 장착된 휴대용 다운드래프트 | 테이블 Hazard Technology | PDDT | |
| 열 램프, 모델 HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T 온도계 | Braintree Scientific | TW2 | |
| 작동 가위 (11.5cm 스트레이트 | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 곡선 팁 핀셋 | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk 봉합사 # 4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
| 거즈 스폰지 2 "x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
| 렌즈 클리닝 티슈 | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
참고문헌
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294
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재인쇄 및 허가
