방법 논문

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

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DOI:

10.3791/50587

⸱

2013년 8월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics Programme, The Babraham Institute, 2Epigenetics Programme, The Babraham Institute, 3Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge

이 논문에서

요약

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

초록

3D DNA 물고기 핵의 3 차원 조직을 분석하는 중요한 도구가되고 있으며, 기술의 여러 가지 변화는 출판되었습니다. 이 문서에서 우리는 견고성, 재현성, 사용의 용이성을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 염료의 화학 결합에 의해 다음 아미노 allyldUTP 닉 - 번역에 의해 생성됩니다. 3 차원 DNA 물고기는 세포 permeabilization에 대한 동결 융해 단계 및 프로브와 핵 DNA의 동시 변성 가열 단계를 사용하여 수행됩니다. 프로토콜은 세포 유형의 범위 및 프로브의 다양한 (세기관지, 플라스미드, fosmids, 또는 전체 염색체 페인트)에 적용하고 높은 처리량 자동으로 이미징 할 수 있습니다. 이 방법으로 우리는 정기적으로 세 염색체 지역 최대의 핵 지방화를 조사합니다.

서론

제자리 교잡에있는 DNA 형광 (DNA 물고기)는 세포주기의 모든 단계에서 각각의 유전자 좌위, subchromosomal 도메인, 심지어 전체 염색체의 3 차원 시각화 할 수 있습니다. 3D 물고기 광범위 계면 동안 게놈과 그 기능의 공간적 조직 (내부 1,2 참조) 사이의 관계를 조사하기 위해 사용하고있는 동안 2D FISH는 중기 연구에 사용됩니다. 역사적으로, 공동 협회 연구는 FISH에 의한 개별 유전자좌의 수백 수만을 조사하여 수행되었다. 이러한 4C와 Hi-C와 같은보다 최근 강력한 높은 처리량 3C-기반 기술은 서로 다른 유전자 좌의 수천 분자 사이 크로스 토크의 조사를 허용, 3 개발되었습니다. 3C 기반 기술과 DNA 물고기 보완 방법이 될 수 있지만, 그들은 반드시 같은 질문에 대답하지 않습니다. 3C 기반 방법은 능성이 결과, 혼합 세포 인구의 앙상블 판독을 제공합니다공동 연관들에 대한 ITY. 대조적으로, 처리량이 낮은 반면, 생선, 기반 기술은 발달이나 세포주기 단계에 따라 각각의 세포에있는 유전자 좌 또는 염색체의 공간 배열을 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 따라서, 생선, 핵 구조 기능 관계를 프로빙을위한 중요한 도구가 될 것입니다.

성공적인 3D FISH 실험을 수행하는 두 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 이들은, 1. 최적 표시된 프로브 및 2를 획득. 고정, 사전 및 사후 하이브리드 단계, 프로브 하이브 리다이 제이션에 대한 충분한 접근 DNA를하는 동안 최대한의 핵 형태를 보존하는 등 세포 치료의 선택. 효율적인 프로브 레이블은 물고기 매우 중요합니다. 전통적으로, 닉 - 번역 hapten 또는 형광 - 복합 뉴클레오티드 4 중 하나를 소개하는 데 사용되었습니다. 마찬가지로, 상업 흠 변환 키트는 직접 hapten 또는 형광 법인, 부 사용할 수 있습니다T는 또한 두 단계 라벨링 aminoallyl 세포핵과 아민 반응성 염료를 사용하여. 후자는 DNA 중합 효소에게 작업 할 적은 부피가 큰 분자를 제공하여보다 효율적인 염료 법인을 렌더링합니다. 최근에는 DNA의 비 효소 라벨링 키트는 핵산에 백금 배위 결합을 악용하는 개발되었다. FISH 프로브는도 이미 5 표시 구입할 수 있습니다. 키트 및 상업적으로 제조 된 프로브 의심의 여지가 사용 편의성을 제공하지만, 그들은 상당히 사내 프로브를 개별 구성 요소를 구입하고 생산보다 더 비싸다. 우리가 직접 여러 색상의 다양한 BAC 프로브 레이블을하기 위해 저렴한 비용으로 닉 번역 프로토콜을 최적화. 우리는 고순도의 BAC의 DNA를 얻는 것은 10에 비해, FISH 슬라이드 당 프로브의 10-20 NG에 대한 요구 사항에 중요하고 결과임을 발견 - 20 배 더 불순한 템플릿 DNA를 사용하는 경우, 주요 결과 비용과 시간 비용 절감. 아미노 allyldUTP의 사용은 유연하게 표시 할 수 있습니다가능 아민 반응성 염료 (예 : 알렉사 플 루어 나 사이프러스 염료) 또는 haptens (예 : 비오틴, digoxigenin)를 검색합니다. Hapten - 라벨 프로브는 신호를 증폭하고 시각화하는 형광 - 복합 항체 또는 스트렙 타비 딘에 의해 감지됩니다. 밝은 직접적으로 표시된 프로브는 일반적으로 적은 배경 염색을 표시하고 따라서 핵 현지화 및 궤적 형태의보다 정확한 표현의 결과로, 신호에 증폭을 피할 수 있습니다.

NaOH를 변성, 염산 변성과 포름 알데히드 고정과 글루 타르 알데하이드 고정, 열 변성과 포름 알데히드 고정 6-9 : 다른 고정액 사전 처리 및 사후 하이브리드 세척을 사용할 수는 있지만 일반적으로 다음과 같은 범주에 속하는 여러 가지 FISH 기법이 있습니다 . 이러한 각각의 장점과 단점이 있습니다. 글루 타르 알데하이드 고정 좋은 핵 구조 보존 결과,하지만 최소화하기 위해 환원제 치료를 필요로그 결과자가 형광과 NaOH를 처리 신중하게 충분한 DNA 변성 및 핵 구조 6 잠재적 인 손상의 균형을 조절해야합니다. 포름 알데히드 고정 핵 구조의 교란의 증가 가능성을주고, 덜 강력한뿐만 아니라, 일반적으로보다 강력하고 안정적인 신호와 9자가 형광 낮은 제공. 염산 처리는 프로브 DNA에 좋은 액세스를 제공, 단백질 아웃 DNA 및 스트립을 depurinates뿐만 아니라, DNA 나누기를 소개 할 수 있습니다. 난방 물리적으로 좋은 대상 하이브리드 및 강한 신호의 결과 두 DNA 가닥을 분리하지만, 핵 구조 8 일부 교란을 일으킬 수 있습니다. 이러한 기술 각각의 단백질 항원에 미치는 영향의 정도는 실험적으로 각 단백질의 면역 FISH 실험에 사용할 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 요구 사항의 결과로 널리 6,9 다릅니다.

더 '완벽한'DNA FISH 테는 없지만잘 조절하면 chnique, 그들은 모두 유용 할 수 있습니다. 우리의 목표는 가장 안정적인 신호 가열 방법에 초점을 맞추고, 세포 유형 10의 다양한 여러 유전자좌의 공간적 위치를 조사하기 위해 강력하고 재현 DNA 물고기에 대한 프로토콜을 최적화 할 수 있었다. 이것과 자동화 영상 시스템의 사용으로 우리는 핵 협정의 단일 세포 분석을위한 처리량을 증가 목표.

프로토콜

1. 닉 번역에 의해 직접 레이블 DNA 프로브를 생성

참고 : 세기관지에게서 직접 표시된 프로브 (100-250킬로바이트)는 일관되게 밝은 신호를 생성한다. 작은 프로브가 필요한 경우 5-10의 KB 삽입을 포함 fosmids (40-50킬로바이트) 또는 플라스미드를 사용합니다. BAC 또는 앙상블이나 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 특정 유전자에 해당하는 fosmid 클론을 식별합니다. 반복 침전 고품질 BAC DNA를 준비하거나 시판 키트를 사용합니다. 이하는 준비가 세균의 게놈 DNA로 오염을 덜 프로브는 슬라이드 당 필요합니다. 두 단계 라벨링 수행 닉 번역 aminoallyl-dUTP와 아민 반응성 염료의 화학 결합을 소개합니다.

1.1. 닉 번역

닉 번역하는 동안, DNase의 I는 단일 가닥 나누기를 만드는 데 사용됩니다. DNA 중합 효소 나는 새, T로 기존의 세포핵을 대체 흠 '이의 끝'3 길게한다 이에 '번역'닉 따라서 레이블이 세포핵을 통합 할 수있는 기회를 제공한다. Aminoallyl-dUTP는 DNA 중합 효소에 의해 때문에 효율적인 정관의 선택 I과 아민 반응성 염료 또는 haptens 나중에 화학 결합에 대한 가능성. 그것은 DNase의 I의 새김 및 DNA 중합 효소 I은 번역 사이의 올바른 균형을 유지하는 것이 중요합니다, 너무 DNase의 I도 약간의 번역을 시작하는 효소에 대한 충분한 흠을 생산하지 않습니다, 낮은 수율과 짧은 조각의 크기를주는 과도한 DNA 소화가 발생합니다 큰 조각 크기와 aminoallyl-dUTP 가난한 결합을 제공. 다음 프로토콜은 잘 작동하지만 다른 배치하거나 서로 다른 제조 업체에서 DNase의 I 적정 할 필요가있다.

  1. 16에서 2 시간 동안 얼음과 부화에 반응 라벨 ° C. 설정 이 0.5 μg 닉 번역 된의 DNA를 생성해야하며 최대 확장 할 수 있습니다. DNase의 I 버퍼에 DNase의 I 1시 반 (즉, 0.3 U / μL)을 희석.
1 "> 구성 요소 주식의 농도 볼륨이나 용량 BAC DNA 5-10 μg NTB 버퍼 배 5 μL DTT 0.1 M 5 μL dNTP 혼합 배 5 μL Aminoallyl-dUTP 0.5 mM의 6 μL DNA 중합 효소 I 10 U / μL 1 μL DNase의 I 10 U / μL 1 μL (1시 반 희석) H 2 O 50 μL에
  1. 라벨 조각의 크기를 확인하기 위해 2 % 아가로 오스 겔 1 μl를 실행합니다. 당신은 젤을 실행하는 동안 얼음에 반응을 유지합니다. 성공 닉 translati에는 1 ~ KB (: 대표 결과를 참조 중요한 단계)에서 몇 가지 큰 조각과 150 BP 700 BP 사이에 실행되는 조각의 부피와 얼룩의 원인이됩니다. 필요한 경우, 15-30 분 동안 16에서 신선한 1시 반 DNase의 I 희석과 부화의 또 다른 1 μL ° C를 추가합니다. 배양 시간은 BAC DNA의 양과 질에 따라 달라집니다.
  2. 10 분 동안 ° C 75 가열 DNase의 I을 비활성화.
  3. PCR 정제 키트를 사용하여 청소 아민 수정 DNA. 100 μL H 2 O에서 용출
  4. 10 μl의 3 M NaOAc (산도 5.2) 275 μL 에탄올을 추가하여 에탄올 침전 DNA. 적어도 1 시간 또는 하룻​​밤 -20 ° C에 남겨주세요. 4에서 30 분 동안 최대 속도로 회전 ° C. 500 μL 70 % 에탄올로 펠렛을 씻고 건조 공기 수 있습니다. 이 단계는 라벨 반응을 방해 추적 아민을 제거합니다. 1X 초기 반응 당 6 μL H 2 O의 펠렛을 Resuspend.
  5. 아민 수정 된 DNA의 농도를 결정하기 위해 1 μL를 사용하여microvolume UV 분광 있습니다.

1.2. 형광 염료의 결합

프로브의 형광 라벨링 염료의 화학 결합에 의해 이루어진다. 알렉사 플 루어 석신 에스테르 염료하여 직접 레이블 프로브를 생산, 공유 결합을 형성하는 아미노 allyldUTP 수정 된 DNA의 아민과 반응. 알렉사 플 루어 488, 555, 및 647 염료는이 과정에 대한 성공했다.

  1. 5 μL의 볼륨 아미노 알릴 수정 된 DNA의 4 μg을 조정, 95 열 ° C 5 분, 얼음 멋진 스냅 0.2 M NaHCO3를 3 μl를 추가합니다.
  2. 상온에서 2 μL 무수 DMSO에 아민 반응성 염료의 하나의 나누어지는을 녹입니다. NaHCO3를, 소용돌이, 1 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 펄스 스핀과 부화로 8 μL 수정 된 DNA를 추가합니다.

참고 : 아민 반응성 염료는 다음과 같은 방식에 따라 하나 이상의 프로브 레이블을 사용할 수 있습니다. 오 전프로브의 NLY 10-20 NG가 슬라이드 라벨마다 사용되며, 1 μg은 50 ~ 100 슬라이드에 대한 충분한 조사를 제공합니다. 그것은 -20 ° C.에서 미래의 라벨 반응 아민 수정 DNA를 저장하는 것도 가능합니다

DNA 양 DNA 양 0.2 M NaHCO3를 염료의 양 합계 충분한위한
4 x 1 μg 1.25 μl를 각 825 μl를 각 0.5 μl를 각 2.5 μL (1 / 4) 50-100 슬라이드 각
3 × 1.35 μg 1.67 μl를 각 1 μl를 각 0.67 μl를 각 3.34 μL (1 / 3) 65-130 슬라이드 각
2 × 2 μg 2.5 μl를 각 1.5 μl를 각 1 μl를 각 5 μL (1 / 2) 100-200각 슬라이드
1 × 4 μg 5 μL 3 μL 2 μL 10 μL (전체) 200-400 슬라이드
  1. 90 μL H 2 O와 PCR 정제 키트를 사용하여 정화 표시된 프로브를 추가합니다. 100 μL 10 mMTris-CL (산도 8.5)에서 용출.
  2. 맥주 램버트 방정식 (지침은 알렉사 플 루어 반응성 염료를 동반하거나 온라인으로 찾을 수 데이터 시트에 나와있다)를 사용하여 microvolume 전체 스펙트럼 분광기 (그림 2 참조) 프로브 농도와 라벨의 효율성을 결정합니다. 100 bp의 당 3-6 염료를 포함하는 프로브는 잘 작동합니다. 법인의 낮은 학위를 가진 프로브는 약한 물고기 신호를 제공 할 수 있습니다. 또한, DNA하지 않고 2 % 아가로 오스 겔에 5 μL를 실행 얼룩 phosphoimager를 사용하여 형광 염료의 결합을 확인합니다. ethidium의 브로마이드 또는 DNA 염색 대안 젤을 게시 얼룩 총 DNA에 표지 DNA를 비교합니다.
2. DNA 물고기

다음 단계를 통해, 그 세포를 슬라이드에 고정 투과된다. 세포의 DNA에 직접 표시된 프로브는 다음 핫 플레이트에 함께 변성과 빛을 꽉 가습 챔버에 하룻밤 교배 있습니다.

2.1. 1 일

  1. 프로브 강수량
    주 : 1 일 동안 어떤 시점에서 침전물 프로브. 이 편안 세포의 치료를 병렬로 수행 할 수 있으며, 하루의 시작에서 수행 할 필요가 없습니다.
    1. 10-20 NG 직접 레이블 프로브, 6 μL C 0t-1 DNA (6 μg), 연어 정소에서 1 μL 단일 가닥 DNA (9.7 μg)를 혼합하고 물 100 μL로 볼륨을 조절하십시오.
    2. 소용돌이로 교반하여 10 μl의 3 M NaOAc 275 ㎕의 에탄올과 혼합을 추가합니다. -20 ℃에서 최소 1 시간 동안 침전
    3. 4시 30 분 최대 속도의 microfuge에 스핀 ° C. 70 % 에탄올로 펠렛을 씻고 다시 회전. 건조 펠렛5 μL 탈 아미드에 resuspend을. 빛으로부터 보호 1000 RPM (thermomixer에 자리 호일)에 떨고있는 동안 37 ° C에서 30 분간 resuspend을.
    4. 37 덱스 트란 황산염 혼합 5 μl를 추가하고 추가로 10 분 동안 흔들어 ° C 다시 빛으로부터 보호됩니다. 단지 coverslip을에 피펫 전에 아래 피펫.
      참고 : BAC 프로브, 편리한 옵션이 사용 준비 하이브리드 믹스에서 제공되는 모든 염색체 페인팅 프로브와 함께 염색체 페인팅하십시오. 를 Resuspend는 BAC 프로브를 침전 (C 0와 연어 정소에서 T1 DNA와 단일 가닥 DNA)를 피펫 아래로 10 ㎕의 염색체 페인트 혼합합니다. 10 분간 300 ~ 500 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 알을 품다. 염색체 페인트 / 현장 당 BAC 프로브 믹스의 10 μl를 사용합니다.
  2. 슬라이드에 세포를 부착
    참고 : 슬라이드에 부착하는 세포 성향은 크게 세포의 유형에 따라 다릅니다. 각 세포 유형에 대해를 결정최적의 경험적 시간과 세포 밀도를 정착. 일관된 결과, 세포는 단일 세포 현탁액에 있어야합니다.
    PBS에 재 부유 셀이 반드시 필요한 것은 아니지만 사용하는 원형의 용이성을 위해 세포 영역은 소수성 펜에서 발견됩니다. 소수성 장벽, 슬라이드에 확산 중단을 방지 슬라이드 잘 구분에 세 샘플까지 유지하고 면역 물고기 항체 솔루션의 아주 작은 볼륨을 사용할 수 있습니다. 세포의 숫자가 낮은 경우에도, 안보 영역은 최소로 유지 될 수 있습니다.
  3. 마우스 태아 간 세포
    1. 그리고 위아래로 pipetting하여 PBS와를 Resuspend의 약 1.5 ㎖에 각 E13.5 마우스 태아 간을 수집합니다. 2 분 동안 3,000 rpm에서의 microfuge에 스핀. 반복을 세 번 씻어. 70 μm의 체를 통해 최종 세척, 변형 세포에서. 160 μl의 PBS에서 하나의 간에서 세포를 resuspend을하고 자리 당 50 μ를 사용합니다. 상온에서 2 분 동안 정착 세포를 둡니다.
  4. 엠여러개 ES 세포
    1. 마우스 ES 세포는 슬라이드에 쉽게 붙어 있지 않습니다. 슬라이드에 원이 영역은 세포 소수성 펜에서 발견됩니다. 원형으로 보통 배지, 피펫에 80-100 μL 당 20,000-50,000 세포 현탁액을 준비하고 가습 배양기 주 약 3 시간 동안 부착 둡니다. 또한, ES 세포를 슬라이드에 배양 할 수 있지만, 그 형성 자동화 된 영상을 방해 할 수 식민지.
  5. 고정 셀
    1. 일부 실험은 그 자체로 슬라이드에 부착하지 않는 고정 된 세포의 사용을 필요로합니다. cytocentrifuge를 사용하여 3 분 동안 300 rpm에서 부드러운 회전은 세포의 입체 구조를 유지하고 세포가 떨어지지 않도록합니다.
세포 유형 의 서스펜션 안정 시간 논평
마우스태아 간 PBS 2 분 벤치에
마우스 ES 보충과 DMEM 4 시간 가습 배양기에서 37 ° C
마우스 림프구 PBS 2 분 벤치에
마우스 P20 생식 세포 솔루션 수정 Cytospin 벤치에
  1. 10 분 : 셀, 4 % PFA에 부드럽게 잠수함 슬라이드 (흄 후드에서 수행주의) 수정합니다. . 세포의 최고의 유지 (팁 상자의 뚜껑을 예를 들면 50 ML 4 % PFA)에 대한 트레이 평면 슬라이드 노트로 세포를 고정 :이 단계는 슬라이드에 첨부하기 전에 고정 셀에 적용되지 않습니다.

모든 후속 단계, 50 ML, 100 ML 플린 항아리를 사용합니다. 단지 사이에 슬라이드를 이동할 때 세포를 긁어하지 않도록주의하십시오.

  1. 0.1 M 트리스-C로 해소L, RT에서 10 분 산도 7.4.
  2. 0.1 %의 셀을 Permeabilize saponin/0.1 % 트리톤 실온에서 10 분 동안 PBS에서 X - 100.
  3. RT에서 5 분 PBS로 두 번 씻으십시오.
  4. . 20 % 글리세롤 / RT에서 PBS 참고 적어도 20 분 동안 품어 :이 시점에서, 슬라이드는 적어도 몇 주 동안 -20 ° C에서 50 % 글리세롤 / PBS에 저장할 수 있습니다. 그것은 신호 강도 9의 증가에 적어도 하루에 결과가 저장 관찰되었다. . 참고 진행하기 전에 실내 온도 20 % 글리세롤 / PBS에 재 보정 :이 프로브 (2.1.1 참조) 침전를 시작하는 편리한 포인트입니다.
  5. 배 동결 / 액체 질소에 해동. 작은 듀어를 사용하여 액체 질소에 한 번 잠수 한 슬라이드. 몇 초 특성 터지는 소리 후 철회 및 해동에 종이 타월에 장소. 다시 동결 후 사라 불투명 냉동 글리세롤 기다립니다. 최대 15 슬라이드 세 가지 동결 / 해동 사이클의 회전 편안하게 수행 할 수 있습니다.
  6. WRT에서 5 분 두 번 PBS 화산재.
  7. RT에서 30 분 동안 0.1 M 염산에 품어.
  8. RT에서 5 분 PBS로 세척 할 것.
  9. RT에서 30 분 동안 0.5 % saponin/0.5 %의 트리톤 X-100/PBS에 Permeabilize.
  10. RT에서 5 분 PBS로 두 번 씻으십시오.
  11. RT 적어도 10 분 동안 50 %의 formamide/2x SSC의 평형.
  12. coverslip을 위에 피펫 프로브. 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 셀 스팟 (들)의 주위에 초과 액체를 건조. 포름 아미드 빠르게 건조로, 세포를 건조하지 않도록주의하십시오. 두 개 또는 세 개의 셀 반점 슬라이드의 경우 슬라이드의 위치를​​ 탐지하는 X 50mm의 coverslip에 해당하는 22mm에 자리 당 프로브의 10 μl를 적용합니다. 스팟 (들)을 통해 슬라이드에 coverslip을 반전. 고무 시멘트로 밀봉이 완전히 건조 할 수 있습니다. 이후의 모든 단계에서 빛으로부터 보호합니다.
  13. 78 열 슬라이드 ° C 뜨거운 접시에 정확히 2 분 (거꾸로 가열 블록 중요한 단계를 예 : 토론 참조). 커버 (판지 상자 또는 SIM을 배치 핫 플레이트에 ILAR)는 변성 동안 빛으로부터 보호합니다.
  14. 빛을 꽉 가습 챔버에 37 ° C에서 밤새 품어. , 축축하게 빛 단단한 상자에 종이 타월을 놓고 물을 저해 할 수 있습니다.

2.2 2 일

  1. 다음 세척 단계에 적합한 온도에서 솔루션 플린 항아리를 준비합니다. 이후의 모든 단계에서 가능한 한 많은 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다. 커피 플린 단지에 대한 좋은 빛 단단한 덮개하게 할 수 있습니다.
  2. 고무 시멘트와 2X SSC에서 개최 슬라이드 벗겨 coverslips는이 느슨하게 밀어 때까지.
  3. 45 ℃에서 15 분 동안 50 %의 formamide/2x SSC로 세척 수조에 장소 뚜껑은 빛으로부터 보호합니다.
  4. 63시 15 분 0.2X SSC에 씻어 ° C.
  5. 45 ℃에서 5 분 2X SSC로 세척
  6. RT에서 5 분 2X SSC로 세척 할 것.
  7. RT에서 5 분 PBS로 세척 할 것.
  8. RT에서 플린 항아리에 2 분 DAPI (5 ㎍ / 2X SSC의 ML)와 얼룩.
내용 "> 참고 : DAPI 용액을 4에 저장할 수 있습니다 ℃에서 2 개월 동안 어둠 속에서 C.

  1. RT에서 5 분 PBS에 Destain.
  2. 커버 슬립을 마운트하려면, 피펫 커버 슬립에 매체를 장착. 한 자리, 그리고 22mm 2-3 반점 X 50mm coverslips를위한 22mm X 22mm의 coverslips를 사용하여, 세포 장소 당 10 μl를 사용합니다. 세포 현장 최대한의 주위에 PBS를 건조하지만, 세포를 건조하지 않도록주의. 슬라이드에 coverslip을하고 손톱 광택과 도장을 반전.

결과

프로토콜은 여기에 설명 (개요 그림 1) 게놈 조직의 분석을위한 높은 처리량 이미지 캡처와 DNA 물고기를 결합하여 큰 효과 사용되었습니다. 좋은 품질의 프로브 세대 (토론 참조)의 성공에 매우 중요합니다. 그림 2는 FISH 프로브에 대한 두 가지 중요한 품질 컨트롤을 보여줍니다. 흠 번역 한 후, DNA의 얼룩은 150 사이 700 BP (그림 2A)를 실행하는 조각의 대부분과 함께 볼 수 있어야합니다. 화학 결합하면 형광 염료의 결합은 프로브의 분광 분석 (그림 2B)에 의해 계측 할 수 있습니다.

좋은 프로브를 사용할 때, DNA 물고기 프로토콜에 따라 일반적으로 낮은 배경에 밝은 DNA 물고기 신호에 발생합니다. 우리는 성공적으로 다른 세포 유형의 다양한이 프로토콜을 사용하고, 에피 형광 또는 공 촛점 현미경 하나와 함께했다. 에피 fluorescenc를 사용하여 자동 영상공 초점 현미경은 더 강렬한 신호를 필요로하면서 전자 현미경, 약간의 배경 (그림 3) 날카로운, 쉽게 식별 FISH 신호가 필요합니다. 그림 4A 대표적인 처리 된 이미지를 보여줍니다. FISH 신호의 핵 좌표를 얻을 수 있으며, 게놈 지역의 공간적 관계는 (예를 들어, 그림 4b 참조) 계산 할 수 있습니다. 우리는 또한 염색체 지역에서 FISH 신호의 3D 모델링 (동영상 1)에 대한 공 촛점 현미경으로 얻은 이미지 스택을 사용했습니다.

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그림 1. 프로브 라벨 및 DNA 물고기 워크 플로. 프로브 준비가 파란색으로 표시됩니다. DNA 물고기 절차는 녹색 세부 설명과 검은 색으로 표시됩니다.

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그림 2. 흠 번역 및 라벨 프로브의 품질 관리에 의해 프로브를 라벨. DNA 사다리, 차선 2와 3 : 흠 변환 후 세기관지)) 젤 DNase의 I (레인 1을 비활성화하기 위해 가열하기 전에 최적의 얼룩을 표시합니다. 파편 150-700 bp의 범위에 있어야합니다. ~ 1킬로바이트에 추가 세포진 검사는 자주 성공적인 흠 번역 반응을 관찰합니다. 표시된 프로브 B) Microvolume 전체 스펙트럼 분석. 알렉사 플 루어 488 : 495 nm의, 알렉사 형석 555 : 555 nm의, 알렉사 형석 647 : 650 nm의 260 nm에서 DNA 피크는 프로브가 표시되어 형광의 흡수 파장에 해당하는 두 번째 피크로 관찰된다. 같이 좋은 법인 세 프로브 위치 : 형광 흡광도 피크는 비슷한 높이 또는 DNA 피크보다 높은 수 있습니다. 알렉사 플 루어 647은 일반적으로 높은 흡광도가다시 알렉사 플 루어 488보다 높은 흡광도가 알렉사 플 루어 555보다. 알렉사 플 루어 488도 따라서이 조사의 첫 번째 피크가 다른 사람보다 높은 260 nm에서 약간의 빛을 흡수한다. 가난한 법인 쇼 형광 흡광도와 프로브 DNA 흡광도보다 낮은 2-3 배. DNA 피크보다 2 배 높은 형광 피크보다 더와 프로브는 일반적으로 물고기의 배경이 발생할 수 있습니다 접합 염료를 포함합니다.

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그림 3. 일반적인 세 가지 색 물고기 실험을 보여주는 MetaCyte 3D 피쉬 이미징 소프트웨어의 스크린 샷은. 화면을 여러 부분으로 나누어 져 있습니다. Metafer / MetaCyte 슬라이드 스캔 시스템에 의해 캡처) 생 시야 (FOV) 이미지. B) 갤러리가 유엔이 확인 된 핵의 이미지어 신호 dergone 이미지 처리 및 분할. 다양한 유형의 데이터는 각각의 갤러리 이미지를 표시 할 수 있습니다. 에서 스캔 영역 슬라이드의 분석. D에서 확인 된 핵의 수와이 예제 세포 수의 다양한 interallelic 및 interlocus 거리는 오른쪽 상단에 각 이미지 아래 양쪽에 왼쪽에 표시됩니다. C)는 슬라이드 이름) 묘사 스캔 영역의 시스템입니다. E)의 확대. 흰 반점은 FOV마다 확인 된 핵을 나타냅니다. F) 처리 된 데이터를. 이 예에서는 녹색 신호 (위)과 빨간색 신호 (아래) 사이의 최대 interallelic 거리가 표시됩니다. 데이터가 표시 마우스 P20 배아 세포에서이다. 프로브는 HBB 및 HBA의 유전자와 히스톤 클러스터를 포함하는 서로 다른 염색체에 위치하고 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 4. 처리 이미지와 파생 된 위치 데이터의 예. Myc를하고 Kcnq1 유전자 (각각 MYC와 KvDMR, 색, 녹색, 빨강,라고) interallelic 거리를 나타내는. B) Tukey의 상자 수염 플롯을 다루는 서로 다른 염색체에있는 BAC 프로브로 염색 E13.5 마우스 태아 간 세포) 가공 이미지 600 핵에서 동일한 궤적에 대한 유통. Interallelic 거리가 핵의 크기 변동을 고려하기 위해 핵 '반경 (거리 / 반지름)의 분수로 나타내었다. ES 세포의 핵 주위에 5 ㎛의 반경. (: p <0.01, 짝 t-test를 ***) 빨간색 프로브는 녹색 프로브보다 가까이 크게합니다. 10의 데이터.

영화 1. 그들의 염색체 t에서 두 유전자좌의 3D 모델링erritory. 마우스 염색체 7의 한쪽 끝 부근에있는 두 개의 BAC 프로브는 표시 (빨간색과 멀리 빨간, (의사 색 흰색))와 마우스 ES 세포에 전체 염색체 페인트 (녹색)와 함께 교배 하였다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

3D DNA 물고기 핵에 공간 배열을 분석 할 수있는 널리 인정 도구가되고있다. 물고기와 같은 모든 기술로, 시각 및 직접 결과를 제공하지만, 하나는 그 한계를 인식해야합니다. DNA 물고기는 상대적으로 가혹한 치료가 궁극적으로 분석하는 핵 구조 매우 일을 방해 FISH 프로브에 대한 염색질에 액세스 할 수 있도록하는 데 필요한 것을 고유의 문제에 직면 해있다. 몇 가지 전략은 접근성과 구조 보존을 저글링을 추구하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 염색체 DNA는 프로브 하이브 리다이 제이션 이전 셀과 열 변성의 동결 - 해동 permeabilization에 의해 접속이 가능합니다. Solovei, 외., (2002)과 유사한 치료 후 구조 변화를 분석하고 염색질 영역의 평균 변위 게놈 8 대략 1 메가 지역에 구조 해석의 해상도를 제한 300 나노 것으로 나타났습니다. 이 고해상도하지 않지만,핵의 위치를​​ 분석하기위한 적절한 규모이다.

FISH 분석을위한보다 실용적인 고려 사항은 해당 이미지 수집 및 원자력 거리의 측정 분석 할 수있는 핵의 수를 제한 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다 수 있습니다. 우리는 높은 처리량 자동화 이미징을 수행 할 목적으로 간헐적 이벤트를 연구하기 위하여. 그런 장소에 적절한 컨트롤, 충분한 숫자는 공간 관계의 강력한 통계 분석을 할 수 있도록 비교할 수 있습니다. 우리는 일상적으로 우리가 핵 볼륨 내의 모든 FISH 신호의 3D 좌표를 결정하는 데이터 포인트 당 600 핵을 분석합니다. 이러한 데이터는 매우 적은 저장 공간을 필요로 간 및 내부 대립 유전자 거리, 및 모든 상위 지점에서 반경 위치의 분석을 할 수 있습니다. 또한, 자동화 된 처리가 매우 무의식적 편견의 가능성을 감소 연구원 블라인드 방식으로 수행 할 수 있습니다.

높은 처리량 분석가의이 종류를 설정하려면우리의 목표는 DNA 물고기를 수행하는 빠르고 효율적인 방법을 확립하는 것이었다됩니다. 우리는 프로토콜이 지속적으로 낮은 배경으로 밝은 신호를 생산하는 매우 강력한 것으로 여기에 설명하였습니다. 그것은 우리가 슬라이드에 세포를 부착하는 단계를 맞게 제공하려고 모든 세포 유형했다. 또한, 한 가지 예외를 제외하고, 우리가 사용하는 모든 세기관지는 밝은 프로브로 전환 할 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 DNA 물고기 후 항체 염색 핵 단백질의 숫자를 발견했다. 이 잘 작동 몇 가지 단백질 동안, 우리는 IF 및 DNA 면역 물고기 (11 비교) 사이의 항체 염색 패턴의 일관성을 유지하기 위해 기존의 면역 (IF)와 비교를 추천합니다.

일반적으로, 우리는 서로 다른 색으로 표시된 프로브는 동일한 결과를 생산 것을 발견했다. 라벨 염료를 선택할 때 단, 다음과 같은 측면이 고려되어야한다. 첫째, 형광의 색깔은 현미경 U에 의해 잘 감지해야SED. 둘째, 형광에 의해 방출되는 빛의 파장은 다른 채널로 통해 출혈을 피하기 위해 충분히 달라야합니다. 이 현미경의 필터에 따라 달라집니다. 셋째, 적어도 우리 손에, 약간 색이 더 일관되게 다른 사람보다 밝은 신호를 생성한다. 우리는 항상 프로브를 라벨링 좋은 선택을 알렉사 플 루어 555 (빨강), 488 (녹색)를 만드는 counterstain으로 DAPI를 (파란색)를 사용하고, 647 (먼 빨간) 있습니다. 우리의 영상 시스템으로, 우리는 알렉사 플 루어 488 (녹색) 다음에 밝은 신호를 생성하는 알렉사 플 루어 555 (빨강)를 발견했다. 알렉사 플 루어 647 (지금까지 적색)은 인간의 눈으로 감지 할 수없고 현미경을 찾을 때 따라서 신호가 볼 수없는 것이 단점이있다. 두 가지 색 물고기를하는 경우 따라서, 우리는 빨간색과 녹색 염료의 조합을 추천합니다.

두 가지 주요 문제가 발생할 수 있습니다 : 셀 슬라이드 약한 신호를 씻어. 또한 세포가 슬라이드에 부착하는 방법은 상당히 변수 betw입니다een과 세포 유형, 세포가 결정해야 / 씨앗을 해결하는 최선의 프로토콜입니다. 우리는 성공적으로 사용하고 하나 양전하 또는 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드 (사용할 준비가 구입 한), 그러나 세포는 일반적으로 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 잘 부착하였습니다. 우리는 또한 세포가 자동으로 영상을 방해 한 반면 너무 조밀 전체 영역, 시트로 벗겨 것 하였을 때 세포가 너무 부족한한다면 것으로 나타났습니다. 샘플이 너무 귀중하지 않은 경우, 따라서 다른 세포 수는 이상적인 밀도를 결정하기 위해 시드해야합니다. 세포가 씻어 특히 경향이있는 경우, 소수성 장벽 펜을 사용할 수 있습니다, 그리고 물고기 단계를주의 깊게 슬라이드에 직접 솔루션을 pipetting하여 수행 할 수 있습니다. 피펫은 크게 필요한 시약의 양을 줄일 수 있지만, 여러 슬라이드를 할 때 상당히 오래 걸립니다.

약한 신호는 일반적으로 가난한 프로브로 인해, 그리고 그것은 좋은 사람을 만들기에 시간을 투자 할 가치입니다. 청소 BAC DNA 사용되어야한다반복 침전 또는 시판 키트에 의해 얻을 수있는 재료를 시작으로 라. 세균의 게놈 DNA의 오염에 부정적인 세포 용해 동안 프로브의 품질과 취급에주의에 영향을 미치는 세포 lysate를 필터링은 최소로 유지하기 위해 필요합니다. 이 크게 수율을 감소시키기 때문에 그것은, 그러나, 선형 DNA를 소화하는 exonuclease 단계를 사용할 필요가 없습니다. 프로브의 효율 라벨이 매우 중요합니다. 이 단계에서 가장 중요한 품질 관리 (대표 결과를 참조) 닉 번역 후 단편 크기를 확인합니다. '좋은'얼룩은 거의 항상 밝은 색깔의 프로브가 발생합니다. 그러나, 우리는 때때로 특정 BAC가 좋은 프로브로 처리하고 다른 BAC를 선택해야 할 수 없다는 것을 발견했다. 또 다른 중요한 단계는 열 변성이다. 온도가 너무 낮 으면, DNA는 부분적으로 변성되며 프로브 하이브 리다이 제이션이 손상됩니다. 온도가 너무 높은 경우, 핵 구조 위스콘신필요 이상을 교란 할 것이다. 우리 손에, 거꾸로 핫 블록에 78 ° C는 이상적인 타협이다, 그러나 이것은 사용 된 각각의 핫 블록에 따라 달라질 수 있습니다.

우리는 Vectashield 설치 매체를 사용하여 좋은 결과를했지만, SlowFade 골드가 적은 배경을 가지고 있으며, 이상에 대한 형광 신호를 보존 것으로 나타났습니다. 우리는이 차원 구조에 영향을 미치는 시간이 지남에 공기 방울을 형성하는 발견으로 우리는 열심히 세트 설치 매체의 사용을 권장하지 않습니다.

결론적으로, 여기에 설명 된 DNA 물고기 프로토콜과 함께 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 생물 학적 질문의 다양한 적용됩니다 핵 아키텍처의 강력하고 신속한 분석을위한 효율적인 솔루션을 제공합니다.

공개 사항

이 문서의 생산은 부분적으로 칼 자이스 혈구와 MetaSystems에 의해 후원되었다.

감사의 글

이 작품은 BBSRC와 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 의해 투자되었다. 우리는 생물 정보학 분석과 도움을 영상과 펠릭스 크루거에 대한 지원은 사이먼 워커에게 감사의 말씀을 전합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent/Material
NTB bufferStep 1.1.1 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)
DTTInvitrogenD-1532Step 1.1.1
dNTPsBiolineBIO-39025Step 1.1.1 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)
Aminoallyl-dUTPAmbionAM8439단계 1.1.1
DNA 중합효소 INew England BiolabsM02095단계 1.1.1
DNase I 재조합 RNase freeRoche4716728001단계 1.1.1
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104단계 1.1.4, 1.2.3
NaOAcVWR27653단계 1.1.5, 단계 2.1.1.2
NaHCO3시그마S5761단계 1.2.1
마이크로어레이 응용 분야를 위한 Alexa Fluor 반응성 염료 데카팩(분자 프로브)A32750, A32756, A32757단계 1.2.2
DMSO(무수) Sigma Aldrich276855단계 1.2.2
SYBR 안전 DNA 겔 염색Life TechnologiesS33102단계 1.2.4(브롬화 에티듐 대체)
Cot-1 DNAInvitrogen18440-016Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA는 대량으로 집에서 만들 수 있으며 잘 작동)
연어 고환의 단일 가닥 DNA SigmaD7656단계 2.1.1.1
탈 이온화 포름 아미드SigmaF-9037단계 2.1.1.3 (건강 위험)
덱스트란 황산염Sigma Life SciencesD89062.1.1.4 단계 (아래 'FISH 버퍼 및 반응 혼합물' 목록 참조)
XMP 페인팅 프로브MetaSystems000000-0528-837단계 2.1.1.4
폴리-L-라이신 코팅 슬라이드Sigma AldrichP0425단계 2.1.2 단계 2.1.2
소수성 펜(ImmEdge)Vector LaboratoriesH-4000단계 2.1.2
70 μ m sieve (마우스 f– tal liver cells only)BD Falcon352350Step 2.1.2.1
PFASigma AldrichP6148Step 2.1.3 (가연성, 부식성, 급성 독성, 건강 위험) (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)
Tris-ClStep 2.1.3 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)
Quillaja 껍질의 사포닌Sigma Aldrich47036Step 2.1.4, 2.1.11 (급성 독성), (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)
Triton X-100SigmaT9284Step 2.1.4, 2.1.11 (급성 독성, 환경 유해성)
10 x PBSLife Technologies (GIBCO)70011-036Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
GlycerolFisher ScientificG/0650Step 2.1.6
HClVWR20252단계 2.1.9 (급성 독성, 부식성)
포름 아미드시그마 Aldrich47670단계 2.1.14, 2.2.3 (건강 위험)
SSC단계 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (아래 'FISH 버퍼 및 반응 혼합물' 목록 참조)
커버슬립 22 x 22Menzel-GlaserBB022022A1단계 2.1.15
커버슬립 22 x 50Menzel-GlaserBB022050A1단계 2.1.15
고무 시멘트Marabu2901 (10 000)단계 2.1.15 (가연성, 건강 위험, 환경 위험)
DAPIInvitrogen Molecular ProbesD3571단계 2.2.8 단계 (건강 위험)
SlowFade GoldInvitrogenS36936단계 2.2.10 (장착 매체)
투명 매니큐어모든 공급 업체단계 2.2.10
Equipment
strong>Nanodrop 2000Thermo ScientificStep 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimagerGE Life SciencesStep 1.2.4
Coplin jarsSigma-AldrichS6016 (6EA)/S5516 (6EA)Step 2.1.3 이후
액체 질소 듀어 모든 공급업체단계 2.1.7
검은색 뚜껑이 있는 베이스(광밀폐 챔버)SimportM920-2단계 2.1.17
Thermomixer comfortEppendorf5355 000.011단계 2.2.3 (또는 37°C에서 쉐이커 사용; C room)
이미징 및 이미지 처리
Metafer - 이미징 자동화 플랫폼MetaSystems자동화 이미징 소프트웨어
MetaCyte - 자동화된 간기 FISH 분석MetaSystems자동화 이미징 소프트웨어
Axio Imager Z2 uprightZeissepifluorescence microscope with automated imaging
IX81 컨포칼 현미경 (FV1000)Olympus컨포칼 현미경
Bitplane, 버전 7.3Imaris이미지 분석 및 3D 모델링 소프트웨어
Scientific volume Imaging, 버전 4.1Huygens이미지 분석 및 디콘볼루션 소프트웨어
FISH 버퍼 및 반응 믹스
Name CompositionComments
10 x NTB 완충액0.5 M Tris-HCl, pH 7.5
0.05 M MgCl2
0.5 mg/ml BSA
dNTP 믹스0.5 mM dGTP스토어 50 μ l -20에서 부분 표본 ° C
0.5 mM dATP
0.5 mM dCTP
0.125 mM dTTP
4 % PFAPBS에 4 g/100 ml PFA의 무게를 달고 62 °C.로 가열합니다. NaOH로 pH를 7.0으로 조정하여 잔여 PFA. -20°C에서 50ml 분취량을 저장합니다. C, 재동결하지 마십시오 < / td > < / tr>
2 % 사포닌 용액 < / td > 100ml PBS 당 2g 사포닌을 장기간 교반하여 용해합니다. NaOH로 pH를 용해하고 7.0으로 조정합니다. ddH20과 오토클레이브를 1리터로 가져오십시오. -20°C에서 5ml 분취량을 보관하십시오. C
20 x SSC무게 175.3g, 구연산나트륨 88.2g을 넣고 80ml ddH20에 넣습니다. NaOH로 pH를 용해하고 7.0으로 조정합니다. ddH20 및 autoclave.
덱스트란 황산염 혼합물20% 덱스트란 황산염을 2 x SSC 완충액에 넣어 1l로 만듭니다. 와류 용액과 하룻밤 사이에 로커에 믹스합니다.Store 500 μ l -20에서 부분 표본 ° C

참고문헌

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  4. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).
  5. Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).
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  9. Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. FISH: A Practical Approach. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
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  11. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).

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