방법 논문

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

DOI:

10.3791/50597

⸱

2013년 8월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

초록

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문화의 세포 (체외 분석)의 연구는 복잡한 생물학적 시스템에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 생체 분석을위한 기존의 방법과 장비가 잘 밀리미터 규모의 볼륨 (≥ 0.1 ml)에 세포 (≥ 10 5) 다수의 연구 적합합니다. 그러나, 관심 및 / 또는 그들의 문화, 자극, 또는 처리에 필요한 시약 세포의 소비를 줄이기 위해 문화 크기를 확장 할 필요하거나 바람직되는 많은 경우가 있습니다. 불행하게도, 기존의 접근 방식은 마이크로 스케일 문화의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않으며, 현재 사용 가능한 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문입니다. 마이크로 스케일의 볼륨 -이 문제를 해결하기 위해, 우리는 자동화 된 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를 위해 간단하고 다양한 기술 플랫폼을 개발했습니다S (1 - 20 μL). 이 플랫폼은 마이크로 스케일 문화를 확립, 유지 및 자극하는 내 fibronectin의 코팅 microcapillaries ( "세포 관류 실")의 집합으로 구성되어 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브에 장착 된 디지털 마이크로 유체 (DMF) 장치 ")하고 재관류 챔버에서 루트 세포 및 시약되는, 힘의 재관류 챔버와 중앙 허브 사이의 자료 전송 고정밀 주사기 펌프, 어떤, 재료의 전송 제어 기능을 제공하는 전자 인터페이스입니다 조정과 미리 정해진 스크립트를 통해 자동화. 예를 들어, 우리는 박테리아와 도전에 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를 촉진하는 플랫폼을 사용했다. 플랫폼의 사용은 우리가, 세포 및 시약의 소비를 줄이는 실험 - 투 - 실험 변동을 최소화 할 수있게하고, 다시 직접 손에 노동. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성, 오 부여UR 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.

서론

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(체외 분석) 문화 유지 세포의 연구는 복잡한 생물학적 시스템과 인간의 건강을 지배하는 기본 원리와 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 문화, 자극, 그리고 페트리 요리의 microtiter 플레이트를 활용 분석을위한 세포의 수집을위한 기존의 방법은 밀리미터 규모의 문화 볼륨의 셀 (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml)에 많은 인구 연구를 위해 설계되었습니다. 그러나, 세포의 제한된 양을 사용할 수있는 많은 경우 (예 : 일차 전지), 또는 세포의 작은 집단 (예를 들면 인구를 통해 휴대 전화의 변동성을 줄이기 위해) 바람직한, 또는 필요한 시약 얻기 어렵다 또는 엄청나게 비싼 (예 : 정제 된 세포 분비 인자). 이러한 문제를 성공적으로 배양 크기를 아래로 조정에 의해 해결 될 수있는 모든 소비를 줄이는 이점이 있습니다시약은 체외 분석 1,2에 필요합니다. 불행하게도, 기존의 장비와 방법은 마이크로 스케일의 문화와 3-11이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문화되어 현재 사용할 수있는 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않습니다.

마이크로 스케일 볼륨에서 (1 - 20 μL) -이 보고서에서, 우리는 자동으로 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를위한 간단하고 다양한 기술 플랫폼의 조립 및 사용을 설명합니다. 피브로넥틴 코팅 microcapillaries는 ( "세포 관류 실"모듈) 마이크로 스케일 문화의 확립, 유지 보수 및 자극에 대한 사이트 역할의 집합, 그리고 디지털 마이크로 유체 (DMF : 플랫폼 아키텍처 (그림 1) 모듈 식 디자인 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브"모듈) 14,15 노선 세포 장착) 12,13 장치과하고 재관류 챔버에서 시약. DMF는 사용자가 개별적으로 동시에 여러 방울을 해결하고 장치 하드웨어를 변경하지 않고 조작을 (예 : 재구성 샘플 처리 기차)를 변경하거나 다시 주문 할 수 있습니다. 그 엄청난 유연성 세포 배양 16, 17, 효소 분석 18,19, 면역 20,21, DNA 분석 22,23, 단백질 처리, 24,25 등 다양한 애플리케이션의 핵심 기술로 최근의 출현에 분명하다 임상 검체 처리. 26,27 우리의 중앙 허브는 DMF 장치에 내재 된 유연성을 활용, 더욱 전문화 된 주변 장치의 조작의 일부를 (예를 들어, 세포 배양) 수행 할 기회를 제공 microcapillary 인터페이스의 추가를 통해 향상 오히려 DMF 장치 자체에보다 모듈. 이런 방식으로 처리 열차의 구획화는 괞 찮아의 설계를 단순화TForm 클래스 아키텍처 (모든 처리 단계를 수행 할 수 DMF 장치를 구축 할 필요 없음) 새로운 함수로의 진화를 촉진는 (단순히 필요에 따라 새로운 주변 장치 모듈을 통합)가 필요합니다. 중앙 허브에서 세포 및 시약의 수송은 DMF 장치 13,28 내에 전극을 순차적으로 활성화에 의해 생성 된 힘 전기 습윤에 의해 구동됩니다;에서 전송로 및 재관류 챔버 내에서 고정밀 주사기에 의해 생성 된 압력 변화에 의해 제공됩니다 펌프. 이러한 유체 움직임의 모든 간단한 전자 인터페이스를 통해 제어되고 미리 정해진 스크립트를 사용하여 자동화되어 있습니다.

대표적인 예로서, 우리는 박테리아의 반칙으로 (그림 2)에 따라 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를위한 플랫폼을 사용하는 방법을 보여줍니다. 플랫폼에서 이러한 실험을 수행하는 것은 우리가 세포의 작은 숫자 (experimen 당 ~ 1,000 작동 할 수있게탈 조건), 실험 - 투 - 실험 다양성, 보존 시약 및 노동 손에 다시 직접을 최소화합니다. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성을 감안할 때,이 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.

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프로토콜

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이 일반적인 프로토콜은 연구의 폭 넓은 다양한 플랫폼의 응용 프로그램을 지원하도록 설계되어,이 보고서에서 설명하는 대표적인 연구로 특정 측면은 괄호 밖으로 분리되어 그림 2 프로토콜을 사용하여 수행 대표적인 연구 결과를 보여줍니다.. 프로토콜에서 모든 "지시"명령은 미리 정해진 스크립트를 사용하여 자동화되어 있습니다. 2 단계는 1 단계 (단계 1.7 및 1.8시 등)와 병렬로 수행 할 수도 있습니다, 그 단계 2.1은 종종 무시됩니다 (패턴 / 코팅 DMF 장치 플레이트를 세척하고 재사용 할 수 있기 때문에, 단계 5.2 참조) .

1. 세포 관류 챔버를 조립하고 채우기

  1. 코트 살균 (멸균) microcapillaries (융합 된 실리카 15cm 길이; 679 μm의 외경, 534 μm의 ID)의 내부 표면 살균 피브로넥틴 용액 (50 ㎍ / ㎖의 30 μl를) 그릴 주사기 펌프를 지시하여 피브로넥틴과 함께, 각에microcapillary,, (37 2 시간 동안 ° C) 잠복기 솔루션을 철회 할 수있는 주사기 펌프를 지시하고, microcapillaries 건조 (6 시간 실온 (RT))시키는.
  2. CapTite 피팅 (6 재관류 챔버, 8 포트 주사기 펌프)를 사용하여 폴리 카보 네이트 튜브 (500 μm의 외경, 100 μm의 ID) 및 멀티 포트 주사기 펌프 튜브에 각 피브로넥틴 코팅 microcapillary (재관류 챔버)를 연결합니다.
  3. 테이프를 사용하여 원하는 온도로 설정 열 블록 (37 ° C) 각 재관류 챔버의 본체를 고정합니다.
  4. 저수지의 재관류 챔버의 열린 끝 (물론 microcentifuge 튜브 또는의 microtiter 플레이트) 신선한 성장 매체에 정지를 포함하는 세포 (P388D.1 쥐 대 식세포) (RPMI 1640, 10 % FBS, 500 단위 / ML 페니실린, 500 μg 빠져 / 원하는 농도 (10 6 세포 / ML)에서 ML 스트렙토 마이신).
  5. 충분히 AI 다음 각 재관류 챔버에 세포를 (10 μL, 10 4 세포) 그릴 주사기 펌프를 지시R은 열 블록에 고정 섹션에 액체 플러그 (~ 4.5 cm)를 이동합니다.
  6. 세포 관류 실의 fibronectin의 코팅 내부 표면 (- 2 시간 37 ° C 1)을 준수 할 수 있습니다. 한편, 세포 저수지에서 신선한 성장 매체를 포함하는 새로운 저수지 재관류 챔버의 열린 끝을 전송할 수 있습니다.
  7. 준수 기간 후에, 낭비 새로운 배지 (10 μL)을 철회하고, 준수를 통해 새로운 액체 플러그 (새로운 배지)를 위치하기에 충분한 공기를 따라 액체 플러그 (에어컨 미디어 및 무소속의 세포)를 보낼 주사기 펌프를 지시 세포.
  8. 세포 인구가 (- ~ 1,000 세포 / 챔버의 마이크로 스케일의 문화 생성 인구의 24 시간 16) 충분히 평형 및 확장 될 때까지 일정한 간격 (매 2 시간)에서 매체 교환 (즉, 단계를 반복 1.7) 수행을 계속합니다.

2. DMF 장치를 조작하고 허브 아키텍처를 조립

    으로 십육 인듐 주석 산화물 (ITO) 포토 리소그래피와 에칭 전극 (물방울 작동의 드라이버), 5 파릴 렌-C의 μm의 50와 코트 DMF 장치의 바닥 판을, 이전에 14,29 설명한 패턴 테플론 AF의 뉴 멕시코. 위와 같이, 코팅 테플론 AF로 패터닝되지 않은 ITO 유리 기판을 DMF 장치의 상단 덮개를 형성한다.
  1. 이 간격, 작동 전극의 크기 (2.5 mm 2)와 함께 물방울 볼륨 (2.5 μL를 정의 금속 압축 프레임을 사용하여 판 사이 400 μm의 간격을 유지 오목과 폴리머 캐스트 14,30으로 DMF 플레이트를 고정 전극 당). DMF 어셈블리가 단순한 수단 (24)에 의해 수행 할 수 있습니다.
  2. 삽입 테프론 코팅 전송 microcapillaries (360 μm의 외경, 100 μm의 아이디, 3.5-4.0 ㎝ 길이) DMF 플레이트 사이의 공간에, 그 동족 작동 전극의 가장자리로 확장하는 각각의 위치.
  3. 반대 EN에각 전송 microcapillary 부착 CapTite 피팅 라.
  4. ITO 전극에 전압을 공급하는 전원 커넥터를 갖습니다. 전극 활성 시퀀스는 미리 정해진 스크립트를 실행하는 컴퓨터 제어 전자 인터페이스를 사용하여 자동화되어 있습니다.
  5. 옵션 : 물방울의 추적을 용이하게하기 위해 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 (DCR-HC96 (소니, 일본))가 장착 된 현미경의 번역 단계 (SZ-6145TR (올림푸스, 일본))에 조립 DMF 허브로 이동 . 31

3. DMF 허브로 재관류 챔버를 연결하고 세포 집단을 자극

  1. 중간 저수지에서 재관류 챔버의 열린 끝을 (단계 1.6 참조)를 제거하고 DMF 허브의 전송 microcapillaries (단계 2.4 참조)의 끝 부분에 부착 된 CapTite 피팅에 삽입.
  2. 낭비 재관류 챔버의 액체 플러그 (에어컨 미디어)를 보낼 주사기 펌프를 지시합니다.
  3. 이달온 - 보드 저수지에서 (E. 대장균은 0.1 % 플루로 닉 F127 W / V 신선한 배지에서 100 ㎍ / ㎖에서 BioParticles) 자극을 그리고 각 전송 ​​microcapillary에 적절한 크기 (10 μL)의 비말을 제공하기 위해 DMF 허브를 ruct . 온 - 보드 저수지는 원통 모양 구획 (1.5 × 1.5 cm 각)으로 구성되어 있으며 튜브를 통해 DMF 허브에 연결되어 있습니다.
  4. 자극이 전달 microcapillaries에 연결 그려 재관류 챔버의 세포 집단에 플러그를 배치하기에 충분한 공기를 따라 주사기 펌프를 지시합니다.
  5. 자극과 세포를 (- 4 시간 37 ° C 1) 품어. 선택 사항 : 정기적으로 신선한 자극 (즉, 단계를 반복 3.2-3.4)에 대한 환율.

4. 자극을 종료 및 분석을위한 세포 용 해물을 복구

  1. 옵션 : 포스트 자극 기간이 필요한 경우 (즉, 단계를 반복합니다 3.2 새로운 매체에 대한 자극 함유 액체 플러그를 교환 - 3.4) 자극에 대한 새로운 매체를 대체하고, 배양하고 필요에 따라 교환을 계속한다.
  2. 환율 세척 버퍼 (전주곡 직접 용해 모듈의 버퍼 B) (즉, 단계를 반복 3.2-3.4, 자극에 대한 세척 버퍼를 대체)에 대한 재관류 챔버의 액체 플러그, 그리고 (5 분)이 필요 품어.
  3. 교환 용해 용액의 액체 플러그 (버퍼 세척) (전주곡 직접 용해 모듈의 버퍼 0.1 % 플루로 닉은 F127 W / V와 함께) (즉, 단계를 반복 3.2-3.4, 자극에 대한 용해 용액을 대체) 및 배양이 필요 (5 분) .
  4. DMF 허브에 액체 플러그 (세포 용 해물)를 보낼 주사기 펌프를 지시합니다.
  5. DMF 허브를 분해, DMF 장치 (이것은 물방울 혼합을 초래할 수 있으므로, 옆 판을 기울 않도록주의를 사용하여)의 상판을 제거하고 오프 플랫폼 분석을 위해 Pipetman이나 주사기를 사용하여 해물 (유전자 발현 프로파일을 수집 qPCR의를 통해).

5. 클린 플랫폼 하드웨어다시 사용

  1. RT에서 10 분 동안 10 %의 표백제에 전송 microcapillaries 및 CapTite 피팅 (물에 v / v)의 몰두, 질소 가스를 이용하여 증류수, 드라이 잘 헹구십시오.
  2. RT에서 10 분 동안 10 %의 표백제 DMF 장치 플레이트를 담가, 이소프로판올 잘 씻어은 탈 이온수 다음, 건조하여 질소 가스를 10 분 동안 160 ° C에서 베이킹에 의해 따랐다.
  3. 주사기 펌프의 폴리 카보 네이트 튜브 및 DMF 디바이스의 폴리머 캐스트 및 압축 프레임, 세척하지 않고 다시 사용할 수 있습니다. 재관류 챔버 microcapillaries은 각 실험 후 삭제됩니다.

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결과

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자동화 플랫폼의 데모로, 우리는 박테리아 도전 면역 세포의 작은 인구는 마이크로 규모의 문화에서 성장했다하는 연구를 수행하는 데 사용되며 (그림 2 프로 염증 반응의 오프 플랫폼 분석을 위해 용해 ).

여섯 세포 관류 챔버의 각 성장 매체의 10 μL에 현탁 10 4 면역 세포 (P388D.1 생쥐 대 식세포) 씨앗을 품고 있었다. 준수 기간 (37 ℃에서 2 시간 동안 C)와 중간 교환 후 ~ 500 세포는 복제 마이크로 문화 분석 (세포가 킬레이트 치료를 통해 발표 및 계산을 통해 측정 된 각 챔버 (그림 3A)의 내부 표면에 붙어 남아 hemacytometer와 가벼운 현미경을 통해). 2 시간 간격으로 배지 교환 16 시간, 37 ° C에서 추가 배양은 챔버 당 ~ 1,000 세포 (그림 3B) (로 측정 일에 세포 인구를 확대위에서 설명한대로...

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토론

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우리는 마이크로 규모의 세포 배양과 자극 실험을위한 간단하고 다양한 자동화 플랫폼을 개발했습니다. 문화 크기는 더 작은 직경의 microcapillaries의 사용을 통해 줄일 수 있으며, 플랫폼은 우리가 작은 문화 볼륨 및 세포 인구 (- - 20 μL, 100 2000 세포 챔버 당 1 개)를 사용하여 작업 할 수 있습니다. 이러한 규모에서 작업 루틴 연구의 비용을 절감하고 귀중한 시약 및 / 또는 세포의 사용을 필요로 가능한 연구를합니다. 플랫폼 실행 실험은 세포와 체액이 자동화 플랫폼에서 처리되는 정밀도와 재현성 아마도 때문에 적은 변동성을 보여줍니다.

플랫폼의 현재 구성은 파종, 평형 및 재관류 챔버 세포 인구의 확장을 위해 오프 보드 저수지 (의 microcentrifuge 튜브 또는의 microtiter 플레이트 우물)에서 세포와 미디어를 그립니다. 이 사이의 불일치를 해결하는 간단한 방법입니다성장 매체 요구 사항 (예를 들...

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 DMF 장치와 DMF 허브의 설계 및 개발에 대한 그들의 공헌에 대한 로널드 F. Renzi의 마이클 S. BARTSCH 감사합니다. 이 연구는 완전히 디아 국립 연구소의 연구실 감독 연구 개발 프로그램에 의해 지원되었다. 샌디 계약 DE-AC04-94AL85000에서 에너지의 국립 핵 보안 관리의 미국학과에 대한 Sandia 공사, 록히드 마틴사의 자회사에 의해 관리 및 운영 멀티 프로그램 실험실이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Prelude Direct Lysis ModuleNuGEN1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v)GIBCO15250-061
Cell StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR 어세이Applied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR 어세이Applied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR 어세이Applied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR 어세이Applied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR 분석응용 바이오 시스템Mm99999915_g1
Pluronic F127시그마 화학2594628
Fluorinert FC-40시그마 화학51142-49-5
Parylene C 이량체특수 코팅 시스템28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
폴리이 미드 테이프ULINES-11928
인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 기판 Delta TechnologiesCB-40IN-1107
DMF 허브 테플론 코팅 용융 실리카 미세모세관Polymicro TechnologiesTSU100375
관류 챔버 미세모세관Polymicro TechnologiesTSP530700
튜빙 및 미세모세관 피팅Sandia National Laboratories
폴리카보네이트 튜빙Paradigm OpticsCTPC100-500-5
30mm(500 μ l 용량) 주사기Hamilton Company54848-01
Parylene-C 기상 증착 기기특수 코팅 시스템PDS 2010 Labcoter 2
고전압 펑션 발생기Trek615A-1 615-3
MVX10 현미경Olympus옵션(DMF 허브의 액적 추적 용이)
QIClick 디지털 CCD 카메라QImagingQIClick-F-CLR-12옵션(DMF 허브에서 물방울 추적 용이)

참고문헌

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