방법 논문

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

DOI:

10.3791/50608

⸱

2013년 11월 7일

 ,  ,  , 
1School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 2Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 3Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, University of Nottingham

이 논문에서

요약

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생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

초록

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적절한 지지체에 3 차원 배양 세포는 더 생체 내 미세 환경을 모방 및 세포 - 세포 상호 작용을 증가하는 것으로 생각된다. 그 결과 3 차원 세포 구조는 종종 차원에서 연구와 유사한 실험을보다 분자 이벤트 및 세포 - 세포 상호 작용을 공부에 더 관련이있을 수 있습니다. 발판에 걸쳐 높은 세포 생존 능력과 효과적인 3D 문화를 만들려면 산소주의 깊게 분석 농도 구배로 제어 할 산도 필요로 배양 조건은 3 차원 구조 전반에 걸쳐있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 많은 포유 동물 세포의 문화에 대한 자신의 이후의 준비와 함께 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 발판으로 생체 적합성의 pH 반응 졸 - 겔 나노 센서 및 그 설립을 준비하는 방법을 설명합니다. 산도 반응 발판은 3 차원 세포 구조 내에서 미세 환경의 산도를 결정하는 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 세부에게 산도 반응 nanose의 전달을 우리성장 전기 방사 PLGA 지지체에 의해 지원되었다 포유 동물 세포의 세포 내 환경에 nsors. 산도 응답 나노 센서의 세포질 위치는 전진 동안 실험 세포 내 산도 (PHI)를 모니터링하는 데에 이용 될 수있다.

서론

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조직 공학의 주요 전략은 형태는 교체 예정의 조직과 유사하며 세포 성장 및 1,2 함수를 지원할 수 지지체를 제조하는 생체 적합성 물질의 사용이다. 비계는 세포 부착 및 증식이 아직 3 차원 세포 구조의 틈새를 통해 세포 이동을 할 수 있도록하여 기계적인 지원을 제공합니다. 비계는 세포의 영양분의 질량 수송을 허용하고 신진 대사 폐기물 3의 제거를 방해하지 않아야합니다.

전기 방사는 세포 성장의 4-6 지원할 수있는 고분자 지지체의 제조를위한 유망한 방법으로 떠오르고있다. 그들은 종종 다공성이며 3D 셀룰러 구조 (7)의 간극을 통하여 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 세포 이동을 허용로서 생성 부직포 전기 방사 섬유 세포 성장에 적합하다. 그것은 t 중에 세포 생존을 모니터링하는 것이 중요그는 문화의 기간 및 그 세포 생존을 보장하기는 3D 구조의 전체에 걸쳐 유지된다. 분석 농도 구배가 3D 구문에 존재할 수있는 예를 들어, 이러한 산소와 pH가 배양 조건, 조심 제어를 필요로합니다. 생물 반응기 또는 관류 시스템은 격자 간 흐름의 생체 내 조건에서 결과적 증가 영양소 입금 및 대사 폐기물 제거 8로 모방하기 위해 사용될....

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프로토콜

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개요

제 1 반응은 pH가 나노 센서와 SEM을 이용하여 형광 분석법 및 사이즈를 이용하여 pH를 행 나노 센서 응답의 특성화의 제조를 설명한다.

2 장에서는 전기 방사 된 고분자 지지체 및 SEM을 사용하여 형태와 크기의 특성의 준비에 대해 설명합니다. 섹션 2는 pH가 반응 나노 센서의 포함과 함께 전기 방사 공중 발판 자기보​​고 지지체의 제조 방법을 설명합니다. 그 결과 자기보고 발판은 전기 방사 섬유의 모든 형태 학적 변화가 발생했는지 여부를 평가하기 위해 SEM을 특징으로한다. 통합 된 나노 센서에서 발생하는 자기보고 발판에서 형광 공 초점 현미경에 의해 평가된다.

3 장에서는 전기 방사 비계와 자기보고 지지체에 세포의 문화를 설명합니다. 발판은 먼저 프레파라트에 멸균비계는 살균과 세포의 문화가 자기보고 비계의 형광 기능에 영향을 미치는 여부를 결정하기 위해 평가하는 세포 배양 다음에 대한 이온. 프로토콜은 전기 방사 지지체에 배양하는 세포에 나노 센서의 전달을 설명합니다. Lysotracker 염료는 나노 센서는 휴대 산성 구획으로 수행되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다.

1. ....

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결과

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준비된 산도 응답 나노 센서의 크기 분포는 묘화 나노 센서의 인구가 측정 및 240-470 nm의 (도 1a)의 범위 내에서 나노 미터 크기를 갖는 것으로 하였다 SEM을 사용하여 분석되었다. 좁고 비교적 작은 직경의 과제는 나노 입자를 제조 Stöber 메서드를 사용과 일치한다. 그것은 산성 조건을 사용하여 제제가 입경 넓은 분산을 생성하는 반면 나노 입자 Stöber 방법을 사용하여 나노 입자의 합성 중에 염기성 pH 환경 준비 IE하여, 사이즈의 양호한 제어를 허용하는 것이 발견되었다. 설명 된 방법을 사용하여 제조 된 PLGA의 전기 방사 섬유의 대표적인 SEM 현미경 사진이 생성 된 PLGA 지지체가 섬유는 나노 미터 치수가 최소한의 구슬 장식이나 파손을 표시 부직포 섬유로 구성되어 있음을 보여주는 그림 1B에 표시됩니다. 그림 1C 5 밀리그램의 농도 PLGA 용액에 나노 센서의 첨가 /

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토론

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조직 공학은 특정 조직이나 기관의 기능을 수리, 교체, 유지 또는 향상시키기 위해 생체 조직 모델과 같은 생체 조직 대체 요법에 모두로 사용할 수있는 생물학적 대체를 만드는 목표로. 몇 년 교체하거나 조직의 원조 수리 그러나이 자주 인해 궁극적으로 거부하거나 추가 재수술에 이르게 호스트 조직 및 / 또는 감염, 가난한 통합에 실패하는 합성 대체가 사용되었습니다. 주입 이전에 실험실에서 생체 조직 생성은 완전 통합을 달성하는 문제를 해결하고 치환술에 대한 필요성을 감소시킬 수있다. 그러나 실현이 목표에 적합한 생체 외 전파와 3D 구조 내에서 세포의 조작은 체외에서 조직의 적절한 육체적 인 조절과 결합되어야한다. 이것은 하나의 근본적인 생물학에 대한 연구를 계속 진행되는 다수의 방식으로 달성 될 수있다참여뿐만 아니라, 합성 대체의 생산에 관련 엔지니어링 및 제조 문제를 조회. 그것은 설명 프로토콜이 기여하는 것을 목표로하는 것이 후자의 문제입니다.

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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BBSRC에서 자금 조달이 친절하게 인정 (허가 번호 BB H011293 / 1).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에탄올피셔32221
무수 디메틸포름아미드(DMF)시그마270547
수산화암모늄 50%(v/v) 수용액Alfa Aesar35574순수로 30%(v/v)로 희석
TEOSSigma13190-3
3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)시그마A3648
5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)InvitrogenC1311
6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)InvitrogenC1171
인산나트륨 일염기성 (0.2 M)Sigma AldrichS-9638
인산나트륨 이염기성 (0.2 M)Sigma AldrichS-0876
NaOHSigma AldrichS8045
트립신/EDTA시그마 알드리치T4174
페니실린/스트렙토마이신시그마 알드리치P0781
PBS시그마 알드리치D8537
DMEM시그마 알드리치D6046
FBS소스 생명과학배치-213-101992
L-글루타민시그마 알드리치G7513
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
OptimemInvitrogen11058-021
LysoTracker RedInvitrogenL-7528
Draq5Biostatus LtdDR50050
질소 가스BOC
DCMSigma Aldrich320269
TFASigma AldrichT6508
컨포칼 현미경Leica TCS-SP아르곤 및 크립톤 레이저와 63X 0.9NA 침수 렌즈
UV 광UVLS28 UVP, USA
교반기 플레이트SB161-3 Jencons-PLS
pH 측정기Jenway 모델 3510
회전 증발기Buchi 로터리 증발기 R200
원심분리기(나노센서)Hermle Z300
원심분리기(세포 배양)Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
VortexWhirlimixer Fisherbrand
초음파 발생기FB11021 Fisherbrand
알루미늄 시트노팅엄 대학교
35mm 세포 배양 플레이트이와키3000035
10ml 주사기Becton Dickenson
3T3 섬유 아세포유럽 세포 배양
PLGALakeshore Biomaterials7525 DLG 7E
포름산 피리디늄시그마 알드리치P8535
트리판 블루시그마 알드리치T8154
인산나트륨 일염기성시그마 알드리치S9638
인산나트륨 이염기성시그마 알드리치S5136
HCl시그마 알드리치320331
, , 컬렉션

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
  2. Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

pHPLGA3DpH

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