2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

요약

인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.

초록

간, 뛰어난 재생 능력을 가진 기관은 이러한 해독, 대사 및 항상성 같은 광범위한 기능을 수행한다. 이와 같이, 간세포 연구 문제의 큰 다양성을위한 중요한 모델이다. 특히, 인간 간세포의 사용은 약물 동력학, 독성, 간 재생 및 병진 연구의 분야에서 특히 중요하다. 따라서,이 방법은 Seglen ^한 바와 같이하여 간세포를 분리하는 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차의 수정 된 버전을 나타낸다.

이전 간세포 기계적 방법에 의해 고립되었다. 그러나, 효소 방법은 간세포 분리 후 자신의 구조적 안정성과 기능을 유지하기로 우수한 것으로 나타났다. 여기에 제시된이 방법은 77 ± 10 %의 가능성을 가진 간세포의 큰 수율 인간의 간 조각과 결과 쥐의 간을 위해 이전에 설계 방법을 적응시킨다. 주이 절차의 차이는 혈관 cannulization의 과정이다. 또한, 여기에 설명 된 방법은 또한 대등 간 또는 혈관 크기를 가진 다른 종에서의 간 적용될 수있다.

서론

간세포 현탁액을 기계적 또는 효소 적 방법에 의해 간장에서 제조 될 수있다. 전체 간 세포를 제조하는 데 사용되는 기계적인 방법은, 투박한 ^(2)를 통해 간을 강제 칸 통 ³ 유리 구슬 간 조각을 흔들면서, 수년에 걸쳐 등 느슨한 방앗 공이 ^4,5 유리 균질를 사용하는 등, 기계적인 방법 중 추락 인해 세포막에 손상 및 절연 ^6,7 간세포의 기능의 상실로 선호. 따라서, 효소 방법의 사용은 현재 간세포의 분리를위한 주요 방법입니다.

베리와 친구 ⁸ 쥐의 문맥을 통해 간을 콜라와 히알루을 관류 할 때 효소의 방법을 사용하여 간세포의 분리는 크게 향상되었다. 이것은 재관류 프로세스에 이르는, 효소는 세포의 대부분에 밀착 할 수 있도록 혈관을 살린간세포 ^8의 수율이 6 배 증가. 또한,이 방법은 사실상 고립 된 소포에 소포체없이 변환없이 미토콘드리아 손상 ^8, 구조적 무결성을 유지 세포를 얻었다.

이 방법은 간 세포 분리를위한 두 단계 관류 절차를 개척 Seglen ^1에 의해 수정되었다. 이 절차에서는 쥐의 간은 칼슘 ^{2 + 1을} 포함하는 콜라게나 버퍼 관류 다음에 칼슘 ^{2 +} 무료 버퍼 관류한다. 두 번째 단계에서 칼슘 ^{2 +의} 첨가가 최적의 콜라게나 제 활성 ^1,9 필요하면서 제 1 단계에서 칼슘 ^{2 +의} 제거는, 데즈 모섬을 방해하도록 돕는다.

상기 게시 된 작품은 쥐에서 수행 된 점을 감안,이 문서는 콧노래에서 높은 가능성을 가진 간세포의 분리에 사용할 수있는 수정 절차를 설명하는 것을 목표로간. 인간 간세포의 사용은 translational 연구를위한 동물 모델을 사용하여 실험을 검증하기위한 중요한 남아있다. 이 연구에 사용 된 인간의 간 조각은 인간의 조직과 세포 연구 재단, 국영 비영리 재단 ^(10)를 통해 지배 구조에 대한 동의를 획득했다. 병리학 진단에 필요한 있었는지를 제거 한 후, 간 조각이 남아있는 조직에서 수집되었다. 병리학 자에 의해 떨어져 구분 조직 형태 학적으로 간 절제술 후 절제에서 얻은 건강한 조직이었다.

프로토콜

1. 관류 및 격리 솔루션의 제조

1. 간 조각과 표 1에 따라 간세포의 분리의 관류에 필요한 솔루션을 준비합니다. 솔루션을 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 살균 필터 0.22 μm의 필터를 사용하는 모든 솔루션을 제공합니다.
3. 간장과 접촉 모든 솔루션은 멸균해야한다.

2. 살포 장비 및 솔루션의 준비

1. 도 1에 도시 된 바와 같이 간 매의 관류를위한 장비가 설정되어야한다.
2. 수욕은 각 특정 실험 장치에서 다른 적절한 온도, 설정해야 그들이 간 부분에 도달 할 때 용액이 37 ° C의 온도에 있는지 등. 이 경우, 물 욕 해법 1, 2, 3 및 재킷 유리 응축기 따뜻하게 41 °의 C로 설정된다. 해결 방법 4로 예열한다콜라게나 제 활성의 손실을 줄이기 위해 사용하기위한 별도의 물을 욕조에 37 ° C에서.
3. 얼마 간 관류하기 전에, 95 _%, O2 / 5 % CO ₂ 산소 장치 (그림 1E)를 가스를 포함하는 가스 탱크의 조절기의 전원을 켭니다.

3. 간 관류

1. 단 1 컷 표면에 이상적으로 가능하고 많은 그대로 Glisson의 캡슐 간 조각은 관류에 대한 병리학에서 확인하셔야합니다.
2. 천공 필터 디스크 (그림 1B)를 포함하는 뷰 흐너 깔때기에이 간 조각을 놓습니다.
3. 관류 시스템 솔루션 1 프라이머해야합니다.
4. 낮은 유량, 올리브 팁 만곡 관개 캐 뉼러는 간 매 절단면에 큰 혈관에 삽입되어야한다. 혈액이 간에서 플러시으로, 조직은 좋은 관류와 지역에서 가벼운됩니다. 다양한 크기에 사용되는 캐 뉼러의 수간의 그림 2A에 표시됩니다. 선택 게이지 크기는 장소에 캐 뉼러를 개최한다 아늑한 적합을 초래할 것이다. 작은 혈관이 간 조각 밖으로 배출하는 관류 버퍼 개방해야한다.
5. 간 (그림 2B)의 크기에 따라 ㎖ / 분 110-460 사이에 연동 펌프의 유량을 증가시킨다. 이 44 ± 16의 평균 유량 ml / 분 정맥 당 (그림 2C)가 발생합니다. 선택된 속도는 간 조각에 의존하고 간 부분에 약간의 플럼 핑의 최대 발생한다. 경우에 따라서는 상기 소 플럼 핑을 달성하기 위해 미세 혈관 클램프 개방 용기의 일부를 차단 클램핑 할 필요가있다. 간 조각에 걸쳐 밝은 색 때 좋은 관류가 관찰 할 수있다.
6. 식염수에 적신 거즈로 덮어 관류 동안 촉촉한 간 조각을 유지합니다.
7. 어떤 연구를 플러시 해결 방법 1의 1 L에 Perfuse간 피스에 혈액을 emaining.
8. 해결 방법 2로 관류 액을 변경하고 10 분 동안 perfuse.
9. 해결 방법 3으로 관류 액을 전환하고 0.5 L.와 perfuse
10. 콜라게나 제 (표 2)의 0.1 ~ 0.15 %를 함유 솔루션 4에 관류 액을 변경합니다.
11. 간을 충분히 소화 될 때까지이 단계를 들어, 관류는 9-12 분 동안 순환 방식으로 수행하거나되어야한다 간 조직은 Glisson의 캡슐에서 약간 떨어져 휴식과의 무딘면을 탐색 할 때 부드럽게 느낌이 나타납니다 메스.

4. 간세포의 분리

1. 연동 펌프를 끄고 간 조각에서 캐 뉼러를 제거합니다.
2. 해결책 5의 100 ~ 200 ㎖에 들어있는 결정화 접시에 간 조각을 놓습니다.
3. 주의 깊게 Glisson의 캡슐을 제거하고 부드럽게 세포를 흔들어. 잘 관류하지 영역이있을 경우, 메스 극복하는데 사용될 수있다이 지역에 포함 된 세포를 분리합니다. 등의 과정에서 필요한 더 많은 해결책 5를 추가합니다.
4. 500 ㎖의 최종 부피에 도달 할 때까지 더 많은 해결책 5를 첨가.
5. 두 번 세포 현탁액을 필터, 먼저 70 μm의 나일론 메쉬 다음에 210 μm의 나일론 메쉬를 통해. 다음으로, 200 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 붓는다.
6. 4 ℃에서 5 분 72 g에서 세포 현탁액을 원심 분리기 기음 뜨는 부드럽게 해결책 5 200 ㎖에 부드럽게에 resuspend 세포 펠렛.
7. 세척 단계 번호 4.6 세 번 반복합니다. 최종 원심 분리 단계에서 냉장 솔루션에 resuspend 세포 (물질의 목록 참조). 세포는 혈구 기반 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 수율과 생존 능력의 평가를위한 밀리리터 당 약 2-5000000 간세포해야한다.
8. 트리 판 블루 배제 분석을 수행하기 위해, 트리 판 블루 soluti입니다 0.5 ㎖를 포함하는의 미세 관 (≈ 2-5000000 / ml)을 적절하게 희석 세포의 0.1 ML를 추가(0.4 % 트리 판 블루는 인산 완충 식염수 (PBS)에 용해) 및 0.4 ml의 PBS. 철저 세포 현탁액을 혼합 한 후, 현탁액을 혈구로드 100X 배율로 현미경으로 조사한다. 살아있는 세포는 흠이 표시하는 동안 현미경에서 죽은 세포는 파란색 물들 일 것이다. 혈구에 표시된 1mm ² 그리드의 각에 살고있는 전체 세포의 수를 계산합니다. 생존 능력 (%), 살아있는 세포의 수율은 (ML 차가운 스토리지 솔루션 (CSS) 100 만 간세포 또는 G 간 100 만 간세포) 아래의 공식을 사용하여 계산 될 수있다.

주 :이 경우에, 트리 판 블루 희석 계수는 10이며, 혈구 계수는 10000이다.

결과

관류 설치

간 관류에 필요한 장비는 그림 1에 따라 설정해야합니다.

생존과 고립 된 인간의 간세포의 수익률

고립 된 인간 간세포의 평균 생존율은 77 ± 10 % 였고, 간세포의 평균 수익률은 ± 표준 편차를 의미로 표현 값으로, 13 ± 1100 만 간세포 / g 간이었다. 간세포 아이솔레이션의 수는이 평균 648 아이솔레이션이 1999년 1월에서 2012년 12월까지에서 실시했다 얻기 위해 실시했다.

적당한 관류 매개 변수

성공적인 플러싱 및 간 혈류를 수행하기 위해, 사용되는 캐 뉼러의 개수는 간 (도 2a)의 무게에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 4-8 캐 뉼러는 20g 이하에서 80 G까지 간 사용해야합니다. 관류의...

토론

이 프로토콜은 높은 생존 능력 및 순도 인간 간세포의 분리가 발생합니다. 이러한 결과를 달성하기 위해, 간 적합한 장으로 시작하는 것이 중요하다. 간 조각은 1 절단면을 제외한 모든 표면에 그대로 Glisson의 캡슐이 있어야합니다. 또 다른 중요한 요인은 다른 배치 소화 ¹¹ 후 간세포의 생존 정도에서 현저한 차이가 발생할 수 있으므로, 사용 콜라의 특정 배치입니다. 따라서, 콜라게나 제의 다른 배치는 테스트해야하고 최고의 가능성과 간세포를 생성하는 일괄 대량으로 얻을 수 있어야합니다. 마지막으로, 적절한 소화 시간은 얻어지는 세포의 수율 및 생존 능력에 기초하여 선택되어야한다. 예를 들어, 낮은 수율과 높은 생존 능력이 불충분 한 소화 시간을 표시 할 수 있고, 낮은 생존율과 높은 수익률은 소화 시간이 너무 긴 것을 나타낼 수 있습니다.

이 방법은 t을 적용 할 수 있습니다O 같은 간 조각에서 비 실질 세포와 간세포를 분리. 이 작업을 수행하는 한 가지...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
버블 트랩	Gaß ner Glastechnik
유리 재킷 콘덴서	Gaß ner Glastechnik
41 > C 수조	Julabo	35723-H24/EG&	nbsp;
37 &도; C 수조	GFL	1083
압축 가스 실린더 (95 % O2/5 % CO2)	Linde
가스 투과성 튜빙	Neolab	2-4440
연동 펌프	Ismatec	IP65
메스	깃털	320010
겸자	옴니랩	5171014
원뿔형 플라스크 1 L	Schott Duran	2121654
원뿔형 플라스크 5 L	Schott Duran	2121673
비커	Schott Duran	2110654
200 ml 원심분리기 튜브	Becton Dickinson	352075
결정화 접시	Omnilab	5144063
볼 팁이 있는 곡선형 관개 캐뉼러	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
마이크로 혈관 클램프	Ernst Kratz GmbH
Bü chner 깔때기	Carl Roth	HT38.1
나일론 메쉬 210 μ m	네올랩	4-1413
나일론 메쉬 70 μ m	네올랩	4-1419
0.22 &무; m 멸균 필터	Peske	99505
500ml 병	Schott Duran	2180144
1L 병	Schott Duran	2180154
혈구계	Peske	06-0001
1.5 ml 튜브	Eppendorf	0030 120,086
50ml 원뿔형 튜브	BD Biosciences	352070
얼음 양동이	Neolab	1508454
멸균 파스퇴르 피펫	브랜드	747715
전동 피펫 필러 (Pipette boy acu)	Integra	155017
재냉장 원심분리기	Eppendorf	5810R
층류	Kendro	Hera safe-KS9
흡인기 (저유량 수술용 흡입 펌프)	Atmos	C361
실험실 가스 버너	Integra	Fire Boy eco
일회용 실험실 코트	Paperlynen GmbH	MD0202414
바이저가 있는 수술용 마스크	Kimberly-Clark	48247
수술용 후드	배리어	42072
라텍스 장갑	Semper Care	CE0321
콜라겐분해효소 (배치 번호 NB 4G)	Serva	17465
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	Merck	2382
EGTA	시그마	E4378
나트륨 염화	Roth	9265.2
헤페스	로스	9105.3
염화칼	Serva	26868
알부민	Biomol	01400-2
포도당	세르바	22700
소듐 수소 카보네이	Serva	30180
0.4% Trypan 블루 솔루션	Lonza	17-942E
냉장 보관 솔루션	Hepacult GmbH