생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

요약

우리는 염증 단계를 구별하기위한 비 침습 이미징 방법을 설명합니다. 루미놀의 전신 배달 호중구의 MPO 활동에 의존 급성 염증의 영역을 보여준다. 대조적으로, lucigenin의 주입은 대 식세포에서 Phox 활동에 의존 만성 염증으로 시각화 할 수 있습니다.

초록

염증은 많은 인간의 질병의 근본적인 측면이다. 이 비디오 보고서에서, 우리는 마우스 모델에서 급성 및 만성 염증을 구별 비 침습적 생물 발광 영상 기술을 보여줍니다. 조직 손상이나 병원체 침공, 호중구는 급성 염증 반응을 중재에 중요한 역할을 방어의 첫 번째 라인이다. 염증 반응이 진행되면서, 순환 단핵구은 점차 부상의 사이트에 마이그레이션 및 만성 염증을 중재 및 조직 파편을 제거하고 항 염증 사이토 카인을 생산하여 조직 복구를 촉진 성숙한 식세포로 분화. 루미놀의 복강 내 주입 (5 - 아미노 -2,3 - 디 하이드로 -1,4 - phthalazinedione, 나트륨 염)은 주로 조직 침투 호중구에 의해 중재 급성 염증의 검출을 할 수 있습니다. 루미놀은 특히 myeloperoxidase (M에서 생물 발광의 결과 때문에 호중구의 phagosomes를 내 생성 된 과산화물과 반응PO) 매개 반응. Lucigenin (BIS-N-methylacridinium 질산)는 생물 발광을 생성하기 위해 초과 산화물과 반응. 그러나 lucigenin의 생물 발광은 MPO 독립적이며 전적으로 만성 염증시 대 식세포의 식세포 NADPH 산화 효소 (Phox)에 의존합니다. 함께 루미놀과 lucigenin 비 침습 시각화 및 급성 및 만성 염증 단계에 걸쳐 서로 다른 식세포 인구의 경도 평가를 할 수 있습니다. 인간의 질병의 다양한 염증의 중요한 역할을 감안할 때, 우리는이 비 침습 영상 방법은 병적 인 조건의 다양한 호중구와 대 식세포의 차동 역할을 조사 할 수 있습니다 믿습니다.

서론

염증은 치유 ² 상처, 당뇨병 ^3, 퇴행성 암 ^4, 심혈관 ^{5, 6,자가} 면역 질환 ⁷ 미생물 감염 ¹ 등 인간 질병의 다양한 참여 규제가 엄격한 생물 학적 반응이다. 조직의 염증은 병원균 정리, 조직 복구, 질병 해상도를 달성하기 위해 다양한 면역 세포의 적절한 조정이 필요합니다. 호중구와 대식 세포 조직 염증의 주요 면역 매개체이다. 염증의 급성 단계에서는 백혈구는 각종 유해 자극 및 조직 손상 ⁸ 번째 조치입니다. 호중구는 빠르게 세포가 항 미생물 과립 및 식균 작용을 출시하여 미생물을 침해 비활성화 곳, 순환 부상의 사이트에 extravasate. 식균 작용하는 동안, 호중구 세포가 superox의 높은 수준을 생산하는 내 phagosomes를에 미생물을 침해 침몰IDE (O ₂ · ^-). Phagosomal 과산화물은 많은 스트림 반응성 산소 종 (ROS)의 기본 소스입니다. 예를 들어, 초과 산화물은 자연 dismutation 또는 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD) ^{9, 10에} 의해 과산화수소 (H ₂ O _2)에 dismutated 할 수 있습니다....

프로토콜

참고 : 모든 동물 실험이 승인 제도 프로토콜 및 동물 관리 지침에 따라 수행되었다.

1. 시약 및 솔루션

1. SC 접종에 대한 PMA 솔루션 : phorbol 12-스틴 산 5 MG / DMSO에 ML에서 13 아세테이트 (PMA)의 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에 재고 솔루션을 저장 접종 전에 재고 솔루션을 해동하고 PBS 1 MG / ML PMA에 희석.
2. SC 접종에 대한 LPS 솔루션 : 이전 SC 접종 1 MG / ML에서 멸균 PBS에 용해 리포 다당류 (살모넬라 균의 enterica 혈청 형 장염에서 LPS).
3. 급성기 이미징 루미놀 용액 : 10 ㎎ / ㎖에서 (0.9 % 염화나트륨) 멸균 생리 식염수에 (5 - 아미노 -2,3 - 디 하이드로 -1,4 - phthalazinedione, 나트륨 염) 루미놀을 녹인다. 이 솔루션은 사용하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
4. 만성 단계 이미징 Lucigenin 솔루션 : 멸균 생리 식염수에 lucigenin (BIS-N-methylacridinium 질산)를 녹여2.5 MG / ML. 이 솔루션은 사용하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니....

결과

우리는 실험 염증 모델에서 급성 및 만성 염증을 평가하는 종 생물 발광 영상을 시행 하였다. Phorbol 12 미리 스틴 산 13 - 아세테이트 (PMA)는 수퍼 옥사이드 음이온 생산을위한 Phox을 활성화하고 ²¹ 강렬한 급성 염증 반응을 유발 강력한 단백질 키나제 C (PKC) 작용제이다. NCR 누드 마우스에있는 PMA의 50 MG의 SC 주입 주사 부위 ^{18 일 22시} 빠른 피부 자극 및 급성 ^{염증, 23를} 일으켰습니다. 우리는 PMA 주입 후 3 시간 일찍 얻은 첫 번째 이미지와 함께 사일 동안 매일 이미징을 수행 하였다. 그림 1은 기판으로 루미놀과 lucigenin를 사용하여 세로 생물 발광 영상을 보여 주었다. 염증 (3 시간)의 초기 단계에서, 우리는 PMA 주입의 사이트에서 호중구 MPO 활동의 높은 수준을 나타내는 중요한 루미놀 생물 발광을 관찰했다. 유의 lucigenin의 생물 발광은 염증이 초기 단계에서 관찰되지.......

토론

이 보고서에서, 우리는 살아있는 동물에서 염증의 비 침습 이미징을위한 생물 발광 방법을 보여줍니다. 두 개의 발광 기판, 루미놀 및 lucigenin을 활용하는 방법은 염증의 다른 단계를 구분할 수 있습니다. lucigenin의 생물 발광은 만성 단계에서 대식 세포에 의해 매개되는 반면 루미놀 생물 발광은 염증의 급성 단계에서 호중구와 연결되어 있습니다. 상대적으로 작은 (MW = 177.16 g / 몰)과 전기적으로 충전되지 않은, 루미놀은 쉽게 플라즈마 막의 phagosomal ^25-29를 모두 통과 할 수 있습니다. 또한, 루미놀 발광은 호중구 ⁹ 세포 내 MPO 활동에 고유합니다. 반면에, lucigenin 주로 인해 큰 크기 (MW = 510.5 g / 몰)과 두 개의 양전하 ^{25, 27-30.에} 스며 들지 막입니다

호중구와 대식 세포는 다른 세포 내 위치에 Phox holoenzyme를 조립합니다. 하지만 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Salmonella enterica 혈청형 엔테리티디스의 리포다당류	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
IVIS 스펙트럼 이미징 시스템, Living Imaging 4.2 소프트웨어 패키지	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA