8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 DNA에서 돌연변이 산화 DNA 병변 8 - 옥소-7 ,8-dihydroguanine (8 oxoG를) 소비세. OGG1의 운동 특성은 8 oxoG 절단 및 제품 릴리스의 속도를 측정하기 위해 실시된다. OGG1 농도가 기질 DNA보다 낮은 경우, 제품 형성의 시간 코스는 이상성이다, 제품 형성의 급속한 지수 단계 (즉 버스트) 선형 안정 상태 단계가옵니다. 제품 형성의 초기 버스트가 제대로 기판에 종사하는 효소의 농도에 해당하고 버스트 진폭은 효소의 농도에 따라 달라집니다. 버스트의 정수 1 차 비율은 8 oxoG 절단의 고유 속도에 대응하고 느린 정상 상태의 속도는 제품 릴리스 (일정한 제품 DNA 분리 속도, K 해제)의 속도를 측정합니다. 여기, 우리는 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 접근법 SP를 분리하고 측정하는 기술OGG1 촉매 순환하는 동안 ecific 단계. 형광 표지 병변을 포함하는 올리고 뉴클레오티드 및 정제 OGG1은 정확한 운동 측정을 용이하게하기 위해 사용됩니다. 낮은 효소 농도가 정상 상태 측정, 반응 시약의 혼합 수동 및 냉각을 만드는 데 사용되기 때문에 정상 상태 속도 (K 해제) 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 또한, 시간 제로의 좌표에 점으로 정상 상태 속도의 추정 제품 형성의 버스트는 첫 번째 회전율 (즉, y 절편이 양수) 동안 발생했음을 나타냅니다. 지수 버스트 위상 상수 1 차 속도는 정상 상태 단계 전에 짧은 시간 간격 (<1 초)에 형성된 제품의 양을 검사하고 8의 비율에 해당하는 빠른 혼합 및 냉각 기술을 사용하여 측정 할 수있다 - oxoG 절제 (즉, 화학). 촉매 순환이 어디에 화학적 단계는 단일 매출 방식을 사용하여 측정 할 수있다효소 (E> S)과 포화 기판 DNA에 의해 못했습니다. 이 방법은 DNA 병변의 제거 효율에 영향을 미치는 초등학교 속도 상수를 측정 할 수 있습니다.
서론
호기성 환경 게놈 불안정성을 서둘러. 산화 스트레스로 인한 주요 promutagenic DNA 병변은 7,8 - 디 하이드로-8-oxoguanine (8 oxoG)입니다. 이 8 oxoG의 모호한 코딩 가능성 때문이다. 인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 8 oxoG의 기본 절단 복구를 시작 책임이 있습니다. OGG1의 glycosylase 활동 apurinic 사이트 (AP 현장)과 제품 DNA의 결과로 8 oxoG베이스 소비세. OGG1의 약한 분해 효소 활동은 어떤 경우에 AP-사이트를 절개 할 수 있습니다.
DNA의 glycosylases의 운동 특성은 일반적으로 그들이 이상성 시간 과정을 나타내는 것을 발견. 제품 형성의 초기 빠른 단계 (즉, 버스트) 한 후, 선형 정상 상태 위상은 1-3 관찰된다. 이 동작은 가시 반면, 화학 (즉, 구조적 변화 또는 제품 릴리스) 시간 코스의 직선 부분을 진행하는 동안 속도 제한되고 다음 단계의 지표입니다종종 과도 단계로 불리는 세인트 단계, 반응의 첫 번째주기 동안 효소 활성 부위의 제품 형성에 해당합니다. 제품 출시가 정상 상태 단계 속도 제한되면 활동 측정 제품 DNA 결합력의 질적 측정을 제공하지....
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프로토콜
1. 효소와 DNA 기판의 제조
- E.의 GST 융합 단백질 등을 통해 표현 OGG1 대장균, 정화 GST-태그를 사용하고 HRV-3C 프로테아제 (그림 1) 6 절단하여 GST-태그를 제거합니다.
- 단일 8 oxoG 잔류 물을 포함하는 화학적으로 합성 5'-6-carboxyfluorescein (6-FAM)로 표시 올리고 뉴클레오티드 및 그 보완 레이블 올리고 뉴클레오티드 가닥을 구입할 수 있습니다. 34 메르 올리고 뉴클레오티드는 5'-말단의 위치 17에서 8 oxoG가 포함되어 있습니다. 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동하여 이러한 올리고 뉴클레오티드를 정화.
- 어닐링 버퍼에 1:1.2의 몰비 (10 MM 트리스 - 염산, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨, 1에서의 보완 가닥 혼합 5'-6-FAM 표시 올리고 뉴클레오티드에 의해 8 oxoG를 포함하는 이중 가닥 DNA 기판을 준비 1.5 ML의의 microfuge 튜브 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 5 분 동안 끓는 물에 부유물에 튜브를 놓습니다. R에 천천히 물이 식지 그 장소에 관두고움 온도 (이 약 2 시간 소요).
- 형광 라벨의....
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결과
정상 상태 운동 분석은 브래드 포드 단백질 분석이 결정에 따라 200 nm의 DNA 기판 및 OGG1의 네 가지 명백한 농도 (15, 30, 45, 60 nm의)를 사용하여 수행되었다. 제품 형성의 시간 코스는 2.2이었다 y 절편, 11, 15, 각각의 단백질 농도 (그림 2B)에 비해 각각 26 nm의, 결정하는 선형 방정식 맞게되었다. Y-차단은 더욱 각 실제 단백질 농도 (그림 2C)를 기준으로 꾸몄다되었다. 활성 효소의 비율은 그림 2C에서 직선의 기울기에서 38 %로 결정 하였다. 정상 상태 속도, 그림 2B의 선형 적합으로 결정 V SS를 확인하려면 Y-차단합니다 (그림 2D)를 기준으로 꾸몄다되었다. 그림 2D에서 직선의 기울기는 일정 해리 속도에 해당하는 0.0028 초
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토론
운동 방법은 초등학교 운동 상수를 정의하는 방법을 설명 여기에 설명. 제품 형성의 시간 코스의 첫 번째 효소 매출이 빠르게 발생과 이상성 경우, 화학 후 단계 이후의 촉매 턴 오버 중에 속도 제한됩니다. OGG1의 경우, 최초의 회전율도 (S E 높음) DNA의 농도를 제한하는 높은 효소 농도를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 첫 번째 경우, 반응은 '단일 매출'로 제한되며 효소의 활성 부위에 촉매 속도 측정을 제공합니다. 후자의 경우, 여러 효소 회전율을 평가한다. 이후 회전율이 촉매 순환을 제한 단계의 측정을 제공하면서 첫 매출 중 발생하는 제품 형성의 버스트는 효소의 활성 부위에 화학 이벤트의 측정을 제공합니다. 또한, 제품 형성의 버스트의 진폭은 적극적으로 관여 효소의 측정을 제공합니다. 이것은 정상 상태 속도 (K 오프 = V SS / E)에서 지속적인 제품의 해리 속도를 계산하기 위해 알고 있어야합니다.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 도움이 제안과 토론 원고 박사 라젠 드라 프라 사드의 중요한 읽기 박사 줄리 K. 호튼 감사합니다. 본 연구의 일부는 원래 생물 화학, 사사 등의 저널에 발표되었다. 알., "인간 8 Oxoguanine DNA의 Glycosylase의 Glycosylase 활동에 DNA 시퀀스 컨텍스트 효과."J BIOL 화학. 287, 36702-36710 (2012) 2. 이 작품은 교내 연구 프로그램에 건강 연구 프로젝트 그랜트 Z01-ES050158의 국립 연구소, NIEHS에 의해 전체 또는 일부를 지원 하였다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| 5'-6-FAM 표지된 올리고뉴클레오티드도 단일 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5'-P32 방사성 표지 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔 정제 등급이 권장됩니다. | |
| 비표지 올리고뉴클레오티드(상보적 가닥) | Eurofins MWG Operon | 폴리아크릴아미드 겔 정제 등급이 권장됩니다. | |
| 1ml BD Luer Lock 일회용 주사기 | BD Medical | 309628 | 다른 공급업체의 Lue Lock 일회용 주사기도 사용할 수 있습니다. |
| 10ml BD Luer Lock 일회용 주사기 | BE Medical | 309604 | 다른 공급업체의 Luer Lock 일회용 주사기도 사용할 수 있습니다. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | 모든 벤더 | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument도 사용할 수 있습니다. | |
| Typhoon PhosphorImager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager도 사용할 수 있습니다. | |
| KaleidaGraph | Synergy 소프트웨어 |
참고문헌
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H.
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재인쇄 및 허가
