고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이

Summary

우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.

Abstract

여기서, 우리는 동시에 광섬유 마이크로 스피어 계 항체 배열을 사용하여 침 육 단백질을 측정하기위한 프로토콜을 기술한다. 채용 면역 어레이 기술은 형광 현미경의 사용으로 미세 기반 서스펜션 어레이 제조의 이점을 결합한다. 비디오 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 시판되는 4.5 ㎛의 중합체 미세 물리적 미소 구체 안에 갇혀이 형광 염료의 농도에 의해 분화 된 일곱 가지 유형으로 인코딩되었다. 표면에 카르복실기를 함유하는 미소 구체는 부호화 EDC / NHS 커플 링 화학을 통해 캡쳐 항체 모노클로 개질되었다. 단백질 마이크로 어레이를 조립하기 위해, 인코딩과 기능화 미소 구체의 다른 유형들을 혼합하고, 임의로 화학적 광섬유 다발의 기단부에 에칭 된 4.5 ㎛의 마이크로 웰, 증착. 광섬유 다발 반송로 양 및 m을 묘화에 사용 된icrospheres. 일단 조립, 마이크로 어레이는 병원에서 수집 된 타액 상등액에서 단백질을 캡처하는 데 사용 하였다. 검출은 스트렙 타비 딘 - 컨쥬 형광 프로브, R-피코 에리 트린을 가진 다른 분석을 위해 비 오티 닐화 된 검출 항체의 혼합물을 사용하여 샌드위치 면역 분석법을 기반으로했다. 마이크로 어레이 마이크로 스피어 등록 및 분석 신호 하나를 세 가지 채널, 두 형광 현미경에 의해 촬영되었다. 형광 현미경은 디코딩 및 MATLAB에서 제 알고리즘을 이용하여 분석 하였다.

Introduction

마크 Schena 1990 년대 중반에서 동료에 의해보고되는 최초의 마이크로 어레이 때문에,이 강력한 도구는 생물학 연구 ^1의 많은 분야에서 활용되고 있습니다. 동시에 혈액과 같은 체액 진단, 여러 단백질을 검출 할 수있는 항체 마이크로 어레이는, 임상 진단 및 바이오 마커 검사 ^2-10에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 타액, 혈액과 같은 분석 물질의 많은 것을 포함하는, 타액 수집 안전한 비 침습적이므로 혈액 바람직한 대안으로 간주되었으며, 최소한 숙련 된 의료인 ^11-13에 의해 수행 될 수있다. 현재, 타액으로 다중화 단백질 분석은 표적 피 분석 물 ^(14)의 낮은 농도와 상이한 바이오 마커 ^(15)의 넓은 농도 범위를 포함하여 여러 가지 중요한 요인에 의해 제한된다.

.

여기서, 우리는 육 단백질의 분석을 설명 : 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터페론 감마 - 유도 단백질 10 (IP-10), 인터루킨 -8 (IL-8), 표피 성장 인자 (EGF), 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP-9) 및 인터루킨 -1 베타 (IL-1β) . 방법의 성능은 초기 분석 재조합 단백질을 구성하고 차단 완충액의 표준 용액을 사용하여 확인 하였다. 다른 만성 호흡기 질환의 환자뿐만 아니라 건강한 대조군에서 수집 된 실제 타액 샘플도 만족스러운 성능을 시험 하였다. 이 프로토콜은 다른 단백질 분석 및 기타 마이크로 스피어 기반의 분석에 적용 할 수 있어야합니다. 그것과 비교하여 넓은 동적 범위, 최소한의 비특이적 상호 작용을 감소 샘플 소모 및 저렴한 비용으로 여러 단백질의 낮은 농도의 빠르고 정확하고 재현성 동시 분석을 가능으로이 플랫폼은 분석 화학 분야에 상당한 이점을 제공한다 유사한 효소 결합 면역 분석 (ELISA).

Protocol

그림 1. . 침 프로파일에 광섬유 미세 항체 어레이를 적용하는 작업 흐름 (1) 마이크로 스피어가 내부적이 형광 염료를 사용하여 인코딩되며, (2) 상기 인코딩 된 미소 구체는 외부 단백질 특이 모노클로 날 항체로 수정되고, (3), 다중화 미소 구체를 혼합, (5) 타액 단백질은 샌드위치 면역 측정법을 통해 미소 구에 의해 캡쳐되고, (6) 형광 현미경을 이용하여 정량화하고, (4) 임의로 광섬유 다발의 기단부에 에칭 마이크로 웰에 침착.

1. 마이크로 스피어 인코딩

1. 호박 유리 병에 나트륨 유로퓸 (III) thenoyltrifluoroacetonate 삼수화물 (EU-TTA, MW = 869.54 g / 몰)을 달아 테트라 하이드로 퓨란 (THF)에 200 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 확인염료가 완전히 용해된다.
2. 호박 유리 병에 쿠마린 30 (C30, MW = 347.41 g / 몰)을 달아 THF에서 12 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 염료가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다.
3. 표 1에 기재된 최종 농도에 도달하는 스톡 용액 및 THF를 사용하여 각 미세 분류를위한 작업 용액 700 μl를 준비한다.
4. 마이크로 스피어 (10 % W / V)도 소용돌이로 교반에 의해 중단하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 60 ㎕의 현탁액을 전송되어 있는지 확인합니다.
5. 미세 현탁액에 600 ㎕의 PBS를 추가하고 20 배를 피펫으로 혼합한다. 3 분 동안 10,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 미세 세척이 프로세스 또 다른 배를 반복합니다.
6. THF 단계 1.5와 유사한 절차를 이용하여 미세 펠렛의 3 배를 씻으십시오.
7. 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 / THF 현탁액을 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 600 μL에 펠렛을 다시 일시 중지작업 용액은 표 1에 나열된. 새로운 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관에 혼합물을 전송.
8. 파라 필름으로 microcentrifuge 관을 밀봉하고 통에 놓습니다. 3,000 rpm으로 흔들어 24 시간 동안 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 설치를 덮어 빛으로부터 보호합니다.
9. 펠릿을 형성하는 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기.
10. 단계 1.5에 설명 된 상등액 염료 용액을 제거, 0.01 % 트윈 -20을 함유하는 다른 6X 600 ㎕의 PBS로 한 다음 미세 600 μL 메탄올로 씻어 6X.
11. 사용할 때까지, 빛으로부터 보호하는 4 ° C에서 0.01 % 트윈 20을 포함하는 600 ㎕의 PBS에 인코딩 미소를 저장합니다.

마이크로 스피어 유형 이름 :	1	2	3	4	5	6 강한>	7
유럽​​ 연합 (EU) - TTA (MM)	(100)	(100)	10	(100)	10
C30 (MM)		1	1	6	6	1	6

표 1. 같은 유럽 TTA와 C30의 농도는 솔루션을 작동합니다.

2. 단백질 캡처 마이크로 스피어의 제조

1. [- (N-모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES) 0.1 M, 염화나트륨 0.9 %, SDS 0.01 %, 산도 5.7 2] PBS / SDS 버퍼 (나트륨 인산염 0.01 M, 염화나트륨 0.154 M, SDS 0.01 %, pH가 MES는 버퍼 준비 7.4) 실온에서 미리.
2. 안전 잠금 1.5 ML microcentrifuge 관에 (~ 2 밀리그램의 미소를 포함) 200 ㎕의 인코딩 된 미세 현탁액을 추가합니다. 이 단계 2.6에서 배양시 누유를 방지하기 microcentrifuge 관이 유형을 사용하는 것이 중요하다.
<리> 단계 1.5에 설명 된대로 배를 버퍼 600 μL의 MES와 미소를 씻으십시오. 마이크로 스피어 펠릿에 700 μL의 MES를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다.
3. 준비 0.105 g / ml의 1 - 에​​틸 -3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카 보디이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC, MW = 191.7 g / mol) 및 0.163 g / ㎖ 술포-N-히드 록 (설포-NHS, MW = 217.13 g / mol)의 별도의 튜브에있는 MES 버퍼 솔루션을 제공합니다.
4. 갓 마이크로 스피어 현탁액에 드롭으로 EDC 솔루션 드롭을 준비 150 μl를 추가합니다. EDC 따라서 그것은 고정화 효율을 보장하기 위해 갓 만든 솔루션을 사용하는 것이 필수적입니다, 매우 빠르게 가수 분해한다. 즉시 EDC의 추가 후, 미세에 150 ㎕의 설포-NHS의 솔루션을 추가 피펫으로 잘 섞어 현탁액이 균질 확인합니다.
5. 튜브 캡을 파라 필름으로 밀봉 통에 놓습니다. 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
6. 마이크로 스피어 펜던트 핀을 원심 분리기펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm에서 이온. 단계 1.5에 설명 된대로 500 ㎕의 PBS / SDS 버퍼 배에 미소를 씻으십시오.
7. 펠릿에 200 ㎕의 PBS / SDS 버퍼를 추가 물론 미세 혼합 60 μg 캡처 항체를 포함하는 300 ㎕의 PBS / SDS 버퍼에 솔루션을 전송합니다. 먼저 미세 펠렛을 일시 중단 한 후 항체 용액에 미세 현탁액을 추가하는 것이 중요합니다.
8. , 셰이커에 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 항체 마이크로 혼합물을 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
9. 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 500 μL의 StartingBlock (TBS) 단계 1.5에 설명 된대로, 버퍼의 3 배를 차단과 미세을 씻으십시오.
10. 버퍼를 차단 TBS 1 ㎖에 미소를 혼합 상자 코브를 사용하여 빛으로부터 보호, 쉐이커에 1 시간 동안 1,500 rpm에서 미소를 품다알루미늄 호일 빨간색.
11. 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 단계 1.5에 설명 된대로 500 μL의 TBS가, 차단 버퍼와 펠렛 배를 씻으십시오.
12. 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm에서 마이크로 스피어 솔루션을 원심 분리기. 차단 버퍼 500 μL의 TBS를 추가하고 피펫으로 혼합한다.
13. 빛으로부터 보호, 사용할 때까지 4 ° C에서 수정 된 미세 현탁액을 저장합니다.
14. 해당 항체를 사용하여 마이크로의 다른 유형을 만들기 위해이 절차를 반복합니다.

3. 광섬유 마이크로 어레이 조립

1. 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 캡처 미소의 각 유형의 50 μl를 섞는다. 원심 분리기 주식 마이크로는 3 분 동안 7,000 rpm에서 풀, 나머지 볼륨이 약 100 μL가되도록 뜨는을 제거합니다.
2. 손으로 컷 광섬유 길이 약 5cm에 번들순차적 필름 랩핑 30, 15, 15, 6, 3, 1, 0.5, 및 0.05 μm의 크기의 다이아몬드를 사용한 연마 장치에 양단 닦아. 모든 입자를 제거하기 위해 2 분 동안 탈 이온수 연마 번들을 초음파 처리.
3. 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 작은 자석 교반 막대를 넣고, 단백질이없는 PBS 400 μL 버퍼와 공기 방울을 제거하기 위해 30 분 동안 자기 교반 판에 자극을 추가합니다.
4. 150 초 ^10,16 대해 0.025 N HCl 용액으로 연마 섬유 다발의 일단을 에칭. 즉시 물속에 1 분 동안 탈 이온수에서 에칭 단부 초음파 처리. 압축 공기와 섬유 다발 말린다.
5. 광섬유 홀더에 섬유 다발을 마운트하고 1 시간 동안 기포없이, 단백질이없는 PBS 버퍼에 에칭 단부 블록.
6. 광섬유 다발의 에칭 끝의 저장 미세 현탁액 예금 1 μL 나누어지는. 알루미늄 호일 상자 빛에서 설정을 보호하고, 15 분 동안 기다립니다. 현탁액의 부피 것증발에 의해 감소​​하고 에칭 된 마이크로 웰에 미소 강제. 이로드 단계를 한 번 더 반복합니다.
7. 마이크로 웰에 갇혀되지 미소를 제거하기 위해 시료 용액으로 포화 면봉을 사용합니다. 단백질 마이크로 어레이는 이제 사용할 수 있습니다. 타액 분석을 위해 4.1 단계로 바로 이동합니다.

4. 마이크로 스피어 마이크로 어레이를 사용하여 침 샘플 분석

1. 200 ㎕의 샘플 용액 (버퍼를 차단. 타액 상층의 수집 프로토콜은 이전에 ¹⁰ 게시 된 StartingBlock T20 (PBS)의 같은 부피로 희석하여 100 ㎕의 타액 상층 액)를 추가합니다. 0.5 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에. 용액에 섬유에로드 된 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 시간 동안 600 rpm으로 진탕 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
2. 10 % 트윈 20 19.6 ㎖의 PBS, 미시간에 200 ㎕의 10 % BSA 용액 200 μl를 추가하여 20 ㎖ 세척 버퍼를 준비합니다X도 부드럽게 흔들어.
3. 200 μL 세척 버퍼를 포함하는 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 분 동안 600 rpm으로 흔들. 이 세척의 배를 반복합니다.
4. 항-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9의 5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 검출 항체 칵테일의 100 ㎕의 용액에 마이크로 어레이를 품어, StartingBlock T20에서 IL-1β 바이오틴 검출 항체 (PBS) 버퍼를 차단 600 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 30 분 동안, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호한다.
5. 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 3 배를 씻으십시오.
6. 10 분 동안 진탕 600 rpm에서 PBS에서 20 ㎍ / ㎖의 스트렙 타비 딘 R-피코 에리 트린의 어원 (SAPE) 솔루션을 200 μL의 마이크로 어레이를 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
7. 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 5 배를 씻으십시오.
8. 섬유 거리 (즉, 말의 말단부를 청소미세부터) 무수 에탄올로 포화 면봉과 함께 제공.
9. 압축 공기와 함께 광섬유의 양단 말린다. 섬유의 말단부를 통해 epifluorescent 현미경 이미지 섬유를 장착합니다.
10. 같은 유럽 TTA, C30, 및 SAPE 형광 방출 강도에 해당하는 마이크로 스피어 이미지를 획득. Eu를-TTA, C30 및 SAPE의 형광 이미징을위한 광학 필터 설치 및 노출 시간은 표 2에 도시된다.

채널	유럽 ​​연합 (EU) - TTA	C30	SAPE
자극하는 사람	365/10x	350/50x	546/10x
빔 스플리터	525DCLP	400DCLP	560LP
이미 터	620/60m	460/50m	580/30m
노출 시간	1 초	0.3 초	1 초

표 2. 마이크로 어레이의 세 가지 형광 이미지의 매개 변수.

Results

광섬유 다발의 작은 단면을 나타내는 세 개의 채널로부터 형광 이미지는도 2A-C에 나타내었다. (토론 섹션에서보다 상세히 설명 됨)이 이미지는 MATLAB 작성 알고리즘을 이용하여 분석 하였다. 분석은 마이크로 스피어 디코딩을 EU의 TTA 부호화 화상 (도 2a)로부터의 정보 및 C30 부호화 화상 (도 2B) 모두를 채용하고, 신호 콘텐츠 (도 2c)의 다른 구체의 형광 강도를 계산 하였다. 상관 된 단백질로부터 얻은 표준 교정 곡선, 타액 샘플에서 단백질의 농도를 계산 하였다.

그림 2. (A)-TTA...

Discussion

연구팀은 다음 단계에 특별한주의를 지불해야한다 : 더 나은 해독 정확성을 위해, 그것은 미세 균일하게 모든 배양에 현탁 확인하고 미소 인코딩 절차에서 단계를 세척 할 필요가있다. 또, 부호화 된 미소 구체 전체 실험을하는 동안 광으로부터 보호 할 필요가있다. 적절한 인코딩 및 저장 절차에 따라, 우리는 전체 디코딩 정확도는 99 % 이상이었다 것으로 나타났습니다. 인코딩 된 마이크로 스피어 C. 동결을 피하고 빛으로부터 보호하는 4 ℃에서 보관해야합니다. 적절한 보관 조건에서 인코딩 된 마이크로 스피어가 6 개월 이상 안정적이다. 극도의주의가 미소 구체의 손실을 감소시키기 위해 인코딩 및 수정 단계에서 요구된다. 상층 액을 제거 할 때 예를 들어, 미세 펠렛을 방해하지 않습니다. 또한, 버퍼에 트윈 -20 및 SDS를 포함하여 더 미세 구 펠렛 필수적이다.

일부 oF 일반적인 해결 절차는 다음과 같다 : (1) (단...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA 염료	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
호박색 유리 바이알	Fisher Scientific	03-339-23B
Coumarin 30 염료	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Microspheres	Bangslabs	PC05N/6698
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x 농축액	Sigma-Aldrich	P5493-1L
물	Sigma-Aldrich	W4502-1L
메탄올	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES 완충 식염수	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
NaOH 솔루션	Fisher Scientific	SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Human VEGF capture antibody	R& D Systems	MAB293
Human IP-10 capture 항체	R& D Systems	MAB266
Human IL-8 포획 항체	R& D Systems	MAB208
인간 EGF 캡처 항체	R& D Systems	MAB636
Human MMP-9 capture 항체	R& D Systems	MAB936
인간 IL-1β 포획 항체	R& D Systems	MAB601
마우스 IgG1 동형 대조군 항체	R& D Systems	MAB002
StartingBlock(TBS) 완충액	Thermo Scientific	37542
HCl 표준 용액 1.0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-120
무단백질(PBS) 완충액	Thermo Scientific	37572
재조합 인간 VEGF 165	R& D 시스템	293-VE
재조합 인간 IP-10	R& D 시스템	266-IP
재조합 인간 IL-8	R& D Systems	208-IL
재조합 인간 EGF	R& D 시스템	236-EG
재조합 인간 MMP-9	R& D 시스템	911-MP
재조합 인간 IL-1&베타;	R& D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) 버퍼	Thermo Scientific	37539
Blocker BSA in PBS	Thermo Scientific	37525
Biotinylated VEGF 검출 항체	R& D Systems	BAF293
Biotinylated IP-10 검출 항체	R& D Systems	BAF266
비오틴화 IL-8 검출 항체	R& D Systems	BAF208
비오틴화 EGF 검출 항체	R& D Systems	BAF236
비오틴화 MMP-9 검출 항체	R& D Systems	BAF911
비오틴화 IL-1β 검출 항체	R& D Systems	BAF201
스트렙타비딘, R-피코에리트린	Invitrogen	S-21388
에탄올(200프루프)	시그마-알드리치	E7023-500ML