방법 논문

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

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DOI:

10.3791/50766

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2013년 12월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

이 논문에서

요약

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

초록

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV) 감염은 경미한 감염에서 생명을 위협하는 세기관지염에 이르기까지 광범위한 질병 중증도를 나타냅니다. 중증 질환의 발병 기전에서 중요한 부분은 면역 병리학을 유발하는 향상된 면역 반응입니다.

여기에서는 HRSV 감염에 대한 인간 면역 세포의 면역 반응을 조사하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 먼저 HRSV의 배양, 정제 및 정량화에 사용되는 방법을 설명합니다. 그 후, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 살아있는 HRSV로 자극되는 인간 체외 모델에 대해 설명합니다. 이 모델 시스템은 선천성 및 적응 면역 반응을 포함하여 질병 중증도에 기여할 수 있는 여러 매개변수를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 반응은 전사 및 번역 수준에서 측정할 수 있습니다. 또한 세포의 바이러스 감염은 유세포 분석을 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 종합하면, 살아있는 HRSV를 통한 PBMC의 자극은 HRSV 유발 질환과 관련된 메커니즘을 조사하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

서론

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린이의 하기도 감염의 가장 흔한 원인입니다. 매년 5세 미만 아동 3,300만 명 이상이 HRSV에 감염되어 300만 명 이상이 입원하고 약 20만 명이 사망합니다1. HRSV가 기저 만성 질환을 앓고 있는 노인과 성인에게도 상당한 위협이 된다는 증거가 점점 늘어나고 있다2.

소아에서 발생하는 대부분의 HRSV 감염은 일반 감기에 필적하는 경미한 증상을 보이며 임상적 개입이 필요하지 않습니다. 그러나 소수의 환자는 심각한 세기관지염으로 인해 입원과 기계 환기가 필요합니다.

HRSV 질병의 발병 기전 중 일부는 감염에 대한 숙주의 과잉적이고 부적절한 면역 반응입니다3,4. 이것은 몇 가지 관찰에 의해 설명됩니다. 최대 질환 기간은 바이러스 감염이 최고조에 달하기 전에 발생하는 경우가 많으며, 감염된 조직의 세포 침투 및 염증성 사이토카인(cytokine)의 방출과 더 잘 일치한다3. 또 다른 증거는 1960년대의 포르말린 불활성화 HRSV(FI-RSV) 임상시험에서 비롯되었습니다. 백신은 어린 영아에게 보호를 유도하는 대신 면역 반응을 과장하여 호흡기 질환을 강화하고 이환율과 사망률을 높였습니다.

HRSV 감염의 발병 기전을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. HEp-2 및 A549와 같은 연속 세포주는 in vitro HRSV 감염을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 상피 세포는 HRSV 감염5의 주요 표적이므로 이러한 세포 유형에 많은 초점이 맞춰져 있습니다. 그러나 in vivo 상황은 훨씬 더 복잡하며 한 가지 세포 유형에 국한되지 않습니다. 이러한 복잡한 상호 작용을 조사하기 위해 HRSV 발병 기전을 연구하기 위해 여러 동물 감염 모델이 개발되었습니다. 지금까지 두 가지 전략이 사용되었는데, 이종(비인간) 모델과 동족 숙주-뉴모바이러스 모델에 초점을 맞추고 있습니다. HRSV에 대한 이종 모델의 예로는 침팬지, 양, 목화쥐 및 생쥐가 있습니다. 자연 숙주에서의 RSV 감염은 소 RSV와 뉴모바이러스를 각각 사용하여 소와 생쥐에서 연구되었습니다.

이러한 각 모델은 질병 발병에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만, HRSV는 인간에게 매우 적합합니다. 따라서 현재 사용되는 세포주 및 동물 모델에 추가하여 HRSV를 통한 자극 모델로 인간 1차 PBMC를 사용할 것을 제안합니다. 인간 PBMC는 어린이6, 면역저하자, 건강한 성인7 또는 노인8을 포함한 특정 연구 질문을 해결하기 위해 다양한 개인으로부터 얻을 수있습니다. PBMC는 바이러스에 대한 적응 반응뿐만 아니라 감염의 선천적 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. HRSV 질환의 발병에 중요한 활성화된 염증 경로는 mRNA 및 단백질 수준에서 연구할 수 있습니다. 또한, 면역 세포의 (부분 집합) 바이러스 감염은 유세포 분석에 의해 결정될 수 있습니다. 우리는 이전에 이 모델을 사용하여 전염증성 사이토카인 유도에 대한 박테리아 리간드 무라밀 디펩티드(MDP)와 함께 HRSV 감염의 시너지 효과를 확인했습니다7. 우리는 HRSV 질환의 발병기전과 관련된 염증 경로를 연구하기 위해 인간 1차 PBMC의 HRSV 자극을 강력하고 쉽고 빠른 체외 모델로 사용할 것을 제안합니다.

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프로토콜

참고:

HRSV를 이용한 실험은 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실의 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 생물학적 위험으로 인해 바이러스성 폐기물 및 바이러스와 접촉한 모든 재료는 적절한 폐기를 위해 수거하십시오.

감염 가능성이 있는 인간 혈액을 사용할 때는 특별한 주의를 기울여야 합니다.

모든 프로토콜 전반에 걸쳐 엔도톡신이 없는 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다.

1. HRSV A2의 배양

  1. HeLa 또는 HEp-2 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FCS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM 배지에서 175 cm² 배양 접시에 배양한다.2 세포가 약 50% 정도 합쳐질 때까지 배양 플라스크에서 배양합니다.
  2. 실온의 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)로 세포를 3회 세척하십시오. (PBS).
  3. HRSV 시딩 스톡 바이러스가 들어 있는 바이알을 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C 항온수조에서 처리하십시오. MOI를 0.1 이하로 유지하도록 바이러스 스톡을 희석합니다. 이는 결함 간섭 입자(DIPs)의 생성을 방지하기 위함입니다. 바이러스 스톡을 플라스크당 4ml의 감염 배지(DMEM + 1% P/S)로 희석하여 HeLa 또는 HEp-2 세포에 첨가합니다. 세포가 마르지 않는 범위 내에서 이 부피를 가능한 한 낮게 유지하십시오. 부피가 낮을수록 감염률은 더 높아집니다.
  4. ~에서 2-4시간 동안 배양하십시오. 37 °C, 5% CO22배지를 재분배하기 위해 15분마다 플라스크를 흔들어 줍니다.
  5. 접종물을 제거하고 PBS로 1회 세척하십시오.
  6. 배양액(DMEM + 10% FCS + 1% P/S) 15 ml를 첨가하고 3~5일 동안 다음 조건에서 배양한다. 37 °C, 5% CO22일반 명시야 현미경으로 세포를 관찰하여 바이러스로 인한 세포병변 효과(cytopathological changes)가 있는지 확인하십시오. 예: 합포체 형성 및 사멸 및 부유 세포.
  7. 세포병성 효과가 나타나면, 세포를 긁어내어 HRSV를 수확하고 멸균된 50ml 튜브에 바이러스 현탁액을 수집하십시오. 세포 현탁액을 볼텍싱합니다. 세포를 긁어내고 볼텍싱하면 더 많은 바이러스 입자가 방출됩니다.
  8. 세포 잔해를 침전시키기 위해 바이러스 현탁액을 상온에서 1,800 x g로 10분간 원심분리하십시오. 상층액에 포함된 HRSV는 이 속도에서 침전되지 않으므로, 상층액을 사용하여 여러 개의 175 cm 배양 접지를 직접 감염시킬 수 있습니다.2 플라스크 또는 -에서 보관할 수 있습니다.80 °C 향후 사용을 위해 1ml씩 분주하여 시딩 스톡(seeding stock)으로 보관하십시오. 감염성 바이러스 입자의 손실을 방지하기 위해 HRSV는 항상 액체 질소에 급속 냉동하십시오.
  9. 위에서 언급한 바와 같이, 상기 프로토콜에 따라 제조된 시딩 스톡(seeding stock)은 다수의 175 cm^2 배양 용기에 감염시키는 데 사용됩니다.2 배양 플라스크. 정제를 위한 바이러스를 더 많이 생산하기 위해 동일한 프로토콜을 반복한다. 1회의 초원심분리 사이클당 최대 180ml의 바이러스 현탁액을 정제한다.
  10. 세포병변효과(cytopathology)가 나타나면, 세포를 긁어내어 HRSV를 수확하고 상층액을 수집한다. 바이러스 현탁액을 볼텍싱(vortex)한다. 세포 파편을 침전시키기 위해 실온에서 1,800 x g로 10분간 원심분리한다. 상층액 속의 HRSV는 이 속도에서 침전되지 않으며, 상층액을 50 ml 튜브당 15 ml씩 분주한다. 급속 냉동하여 -에서 보관한다.80 °C 정제 전까지.

2. HRSV의 정제

주의: 초원심분리기를 사용하기 전에, 이 장비가 잠재적으로 위험할 수 있음을 인지하십시오. 매뉴얼을 숙지하고, 첫 초원심분리 가동은 경험이 풍부한 사람의 감독 하에 수행하십시오.

  1. 초원심분리기 버킷을 70% 에탄올로 세척한 후 생물안전작업대 내에서 건조하십시오.
  2. 각 버킷에 멸균 원심분리 튜브를 넣으십시오.
  3. 30% (w/v) PBS sucrose 용액을 준비하고, 필터 멸균하십시오(0.2 μm (여과)한 후, 각 원심분리관 바닥에 5ml씩 추가합니다. 더 빠른 프로토콜을 위해, 설탕 용액(sucrose solution)이 들어있는 튜브를 냉동 보관할 수 있습니다. 이때 반드시 멸균 상태를 유지하십시오.
  4. 자당 용액이 얼지 않은 상태라면, 이 자당 용액 위에 HRSV 용액 30ml를 매우 조심스럽게 첨가하십시오. 자당 용액이 섞이지 않도록 천천히 피펫팅하십시오. 층 경계가 명확하게 유지되어야 합니다. 튜브가 얼어 있었다면, 얼어 있는 자당 용액 위에 바이러스 현탁액을 붓고 그대로 해동하십시오.
  5. 멸균된 PBS를 사용하여 6개의 초원심분리 버킷의 무게를 매우 정밀하게 맞추십시오. 모든 과정의 멸균 상태를 유지하기 위해 저울을 클린벤치(flow cabinet) 안에 넣으십시오. 튜브의 가장자리에서 3~5mm 아래까지 용액을 채우십시오. 그렇지 않으면 원심분리 튜브가 찌그러질 수 있습니다. 캡의 무게가 완전히 동일하지 않을 경우를 대비하여 스크루 캡을 포함시킨 상태로 버킷의 무게 오차가 0.1g 이내가 되도록 맞추십시오.
  6. 초원심분리기로 1.5시간 동안 원심분리하십시오. 4 °C 20,000 rcf에서.
  7. 멸균 핀셋을 사용하여 버킷에서 원심분리관을 조심스럽게 꺼냅니다. 바이러스 입자는 자당 층을 통과하여 펠릿을 형성하게 됩니다. 반대로, 세포 분비 수용성 인자들은예: 사이토카인(cytokines)은 용액 상태로 유지됩니다. 원심분리 튜브를 기울여 모든 액체를 따라냅니다. 튜브를 멸균된 표면 위에 거꾸로 세워 둡니다. 예: 배양 플레이트에 옮겨 건조시키되, 펠릿이 완전히 마르지 않도록 주의하십시오.
  8. 펠렛에 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 1ml를 조심스럽게 가한 후, 원심분리 튜브를 기울여 HBSS를 배출하십시오. 다시 튜브를 멸균된 표면 위에 거꾸로 세워 건조시킵니다. 이때 펠렛이 완전히 마르지 않도록 주의하십시오.
  9. 펠렛을 1 ml HBSS에 넣고 피펫팅을 40회 반복하여 재현탁합니다. 이때 공기 방울이 형성되면 바이러스가 파괴될 수 있으므로 주의하십시오.
  10. 바이러스를 소분하여 액체 질소에 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 보관하십시오. °추후 사용 시까지 C에 보관하십시오. 반복적인 동결-해동은 감염 역가를 감소시키므로, 각 실험마다 새로운 바이러스 분주액을 사용하십시오. 해동 시에는 항상 바이러스를 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C HRSV는 -20°C에서 보다 불안정하기 때문에 15 °C.

3. HRSV의 정량 분석

참고: 데이터의 재현성을 보장하기 위해, 정량 분석을 최소 3회 반복하여 이중 측정(duplicate)으로 수행하십시오.

3.1. A549 세포 감염

  1. A549 세포를 24-well 플레이트에서 완전히 밀집될 때까지 배양합니다.
  2. 실온에서 1 ml의 PBS로 A549 세포를 두 번 세척합니다.
  3. Reduced Serum Medium을 사용하여 HRSV의 5배 연속 희석액을 준비합니다. 희석된 바이러스 100 μl를 각 웰에 첨가합니다. 최소 4단계의 희석 농도를 설정하십시오 (예: 4배, 20배, 100배 및 500배 희석). 가장 높은 용량의 바이러스를 감염시킨 추가 웰 2개(아이소타입 대조군으로 사용)와 모의 감염(mock-infected) 웰 2개를 포함합니다.
  4. 5% CO2, 37 °C 조건에서 세포를 2시간 동안 배양합니다. 건조를 방지하기 위해 15분마다 24-well 플레이트를 흔들어 줍니다.
  5. 바이러스 현탁액을 제거하고 실온에서 1 ml의 PBS로 세포를 1회 세척합니다.
  6. Reduced Serum Medium으로 4% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 0.2 μm 필터로 여과 멸균한 후, 각 웰에 500 μl를 첨가합니다.
  7. 5% CO2, 37 °C에서 22시간 동안 배양합니다.

3.2. FACS 준비

  1. 배지를 제거하고 상온의 PBS 1 ml로 세포를 1회 세척한다.
  2. 각 웰에 미리 데운 trypsin (37 °C) 200 μl를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 10분 동안 배양한다.
  3. 현미경으로 세포의 탈착 여부를 확인한다. 세포가 탈착되었다면, trypsin을 중화시키기 위해 DMEM + 10% FCS + 1% P/S 800 μl를 첨가한다. 세포를 재부유시킨다.
  4. 세포를 원추형의 비조직 배양 처리된 96-웰 플레이트로 옮긴다. 상온에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 펠릿을 차가운 PBS 200 μl에 재부유시킨다.
  5. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS 200 μl에 재부유시킨다.
  6. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 80% 얼음냉각 아세톤 150 μl에 재부유시킨다.
  7. 상온에서 15분 동안 세포를 고정한다.
  8. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1 % BSA 200 μl에 재부유시킨다.
  9. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 anti-NP-RSV-FITC (PBS + 1% BSA에 1:50으로 희석) 50 μl 또는 IgG2 anti mouse-FITC (이소타입 대조군이므로 동일한 항체 농도를 사용한다) 50 μl에 재부유시킨다.
  10. 이후 과정 동안 튜브를 암소에 보관한다. 4 °C에서 최소 1시간 동안 배양하며, 필요시 하룻밤 동안 연장할 수 있다.
  11. 차가운 PBS + 0.1% BSA 150 μl를 첨가한다.
  12. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1% BSA 200 μl에 재부유시킨다.
  13. 4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1% BSA 200 μl에 재부유시킨다. FACS 측정 전까지 플레이트를 얼음 위에 암소 보관한다.
  14. 유세포 분석기로 감염된 세포를 측정한다.

3.3. FITC-50 계산

  1. 유세포 분석 프로그램을 사용하여 음성 대조군(동형 대조군)을 기준으로 컷오프를 설정하십시오. Pseudocolor 그래프 유형을 사용하십시오. 양성 세포가 Q3 영역에 위치하도록 쿼드런트 게이트를 그리십시오. 두 동형 대조군 모두에서 위양성 비율이 0.2% 미만이어야 합니다.
  2. 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보내고, 각 희석 배수별 FITC+ 세포의 백분율을 나타내는 표를 작성하십시오. 각 실험의 각 값에서 (동형 대조군으로 결정된) 위양성의 평균값을 빼십시오.
  3. 통계 프로그램에서 새 파일(XY 산점도, 단일 X 및 다중 Y 열)을 여십시오. 데이터를 이 프로그램으로 복사하십시오: X = 희석 배수, Y = 감염된 세포 %, n = 3이며, 각 희석 배수당 두 번 측정값의 평균을 사용하십시오. 비선형 회귀 분석인 단상 지수 감쇠(one-phase exponential decay) 통계 분석을 수행하십시오. 곡선이 데이터 포인트에 적합한지 확인하고, 그렇지 않은 경우 다른 통계 분석법을 선택하십시오.
  4. 곡선 방정식과 방정식 값을 스프레드시트 프로그램으로 복사하십시오. Y = 50%일 때의 X 값을 계산하십시오. 이에 따라, 다음 방정식을 사용하여 감염률이 50%가 되는 희석 배수에서의 FITC 검출 감염성 입자/ml (FIP/ml)를 계산하여 FITC-50 값을 결정하십시오.
    FITC50 계산 공식; 형광 강도 측정 방정식을 설명하는 도표.
    A = 웰당 A549 세포의 평균 수
    B = 감염에 사용된 웰당 바이러스 μl
    C = 감염률이 50%가 되는 희석 배수

4. 건강한 자원자의 혈액으로부터 말초혈액 단핵구(PBMC) 분리

  1. 고지된 동의를 얻은 건강한 자원봉사자로부터 10 ml EDTA 튜브에 정맥혈을 채취합니다. 혈액 10 ml당 약 107개의 PBMC가 얻어집니다.
  2. 지금부터는 클린벤치 내에서 멸균 상태로 작업하십시오.
  3. 50 ml 튜브에서 상온의 PBS를 사용하여 혈액을 2배로 희석합니다. 50 ml 튜브당 최대 35 ml의 희석된 혈액을 사용할 수 있습니다.
  4. 멸균된 50 ml 주사기에 멸균된 Luer lock 바늘을 장착합니다. 주사기로 밀도 구배 매질을 흡입합니다. 희석된 혈액이 들어있는 튜브 바닥에 바늘을 놓고, 희석된 혈액 아래로 밀도 구배 매질 15 ml를 조심스럽게 분주합니다. 밀도 구배 매질과 혈액 사이에 명확한 경계층이 유지되도록 합니다.
  5. 상온에서 800 x g로 20분 동안 원심분리하며, 가속도는 9(최대)로 설정하고 브레이크는 끕니다. 사용 후 원심분리기의 온도를 4 °C로 설정하십시오.
  6. 밀도 구배 원심분리를 하면 여러 층이 형성됩니다. 바닥에는 적혈구가 포함된 펠렛이 형성되며, 그 위로 호중구가 포함된 은색 층이 나타납니다. 이 펠렛 위의 투명한 층은 밀도 구배 매질입니다. 밀도 구배 매질과 상단의 혈장 층 사이의 얇은 층에 PBMC가 포함되어 있습니다.
  7. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC를 조심스럽게 수집하고 새로운 50 ml 튜브로 세포를 옮깁니다. 지금부터 PBMC는 얼음 위에 보관하고 ice-cold PBS를 사용하십시오. 부피가 50 ml가 되도록 ice-cold PBS를 추가하고 4 °C에서 400 x g로 10분 동안 원심분리합니다(브레이크는 9로 설정).
  8. 흡입법으로 상층액을 제거하고, 펠렛을 50 ml의 ice-cold PBS에 재현탁한 후 4 °C에서 400 x g로 10분 동안 원심분리하며, 이 과정을 2회 반복합니다.
  9. 상층액을 제거한 후, ice-cold 배지(RPMI + 1% P/S) 1 ml를 추가하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
  10. 세포 농도를 5 x 106 PBMCs/ml로 조정합니다.

5. 활성 HRSV를 이용한 PBMC 자극

  1. 실험 설정을 준비하며, 각 조건마다 실험 반복구를 포함하십시오.
  2. 필요한 모든 자극제를 배지(RPMI + 1% P/S)로 희석하십시오. 웰당 최종 부피가 200 μl가 된다는 점에 유의하십시오. 50 μl의 자극제를 첨가하므로 4배 농축된 자극제 스톡을 준비하십시오.
  3. 라운드 바텀 96-well plate의 각 웰에 앞서 언급한 세포 현탁액 100 μl를 첨가하십시오(5 x 105 PBMC/well).
  4. 희석된 자극제 50 μl를 각 웰에 첨가하십시오. 두 가지 서로 다른 자극제를 첨가하여 총 부피를 200 μl로 맞출 수 있습니다. 하나의 자극제만 필요한 경우, 배지를 사용하여 부피를 200 μl로 조정하십시오.
  5. 96-well plate를 5% CO2 인큐베이터, 37 °C에서 필요한 배양 시간 동안 배양하십시오. 대부분의 사이토카인의 경우 24시간 배양으로 충분합니다.

6. 자극 결과 측정

  1. 배양 기간이 지난 후, 96-well 플레이트를 실온에서 450 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 바닥에 모읍니다.
  2. 상층액을 수집하고(최대 180 μl 취함), 이후의 사이토카인 분석을 위해 -20 °C에 보관하거나 바이러스 생산을 위해 -80 °C에 보관합니다.
  3. 펠렛에 존재하는 자극된 PBMC는 라이시스 버퍼를 첨가하여 qPCR/Western blot으로 분석하거나, 또는 유세포 분석을 위해 염색할 수 있습니다.

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결과

여기에 기술된 HRSV A2 배양 및 정제 방법은 ml당 2 x 107에서 2 x 108의 FITC-50 정량 감염성 바이러스 입자 수율을 제공합니다. FITC로 염색된 감염 세포를 계수하여 얻은 현미경 분석 결과(결과 미제시)를 FACS 정량 결과(그림 1)와 비교하였습니다. 두 방법 모두 유사한 역가가 도출되었으나, FACS 방법이 서로 다른 실험 간의 표준 편차가 훨씬 낮았고 노동력이 덜 소모되었습니다.

PBMC 자극 실험을 수행할 때는 자극-분할법(stimuli-fraction method)을 사용하는 것을 권장합니다. 이 방법에서는 조건을 자극 조건과 분할 조건으로 나눕니다(그림 2). 자극 조건은 표준 조건(예: RPMI 및 HRSV)입니다. 분할 조건은 테스트 조건(예: RPMI, MDP 및 LPS)입니다. 각 실험에는 항상 음성 대조군...

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토론

이 연구에서 우리는 HRSV에 의한 PBMC 감염이 염증 경로를 연구할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 모델 시스템임을 보여줍니다. PBMC를 자극하려면 HRSV 스톡을 준비하고 정량화해야 합니다.

여러 세포주가 HRSV 감염에 취약합니다. HRSV 배양에 가장 많이 사용되는 세포주는 HEp-2, HeLa 및 Vero 세포입니다. 그러나 Vero 세포에서 HRSV를 배양하면 HRSV10의 G-단백질이 잘리는 것으로 나타났기 때문에 HRSV 배양에 Vero 세포의 사용을 권장하지 않습니다. 또한, 결함이 있는 간섭 입자를 생성할 위험이 있으므로 배양을 위해 세포를 감염시키기 위해 항상 적은 양의 바이러스를 사용하십시오11. 결함 간섭 입자(DIP)는 게놈의 일부 또는 전부를 놓친 바이러스 입자입니다. 따라서 DIP는 스스로 감염을 지속할 수 없으며 감염성 바이러스에 의존할 수 있습니다. 게놈이 작기 때문에 완전한 기능을 갖춘 바이러스보다 더 ...

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공개 사항

우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

RSV A2는 R. de Swart 박사(Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands)가 친절하게 제공했습니다. MV 및 GF는 네덜란드 정부 프로젝트 번호 FES0908와 네덜란드 유전체학 이니셔티브(NGI) 프로젝트 번호 050-060-452의 자금 지원을 받는 Virgo 컨소시엄의 지원을 받습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
PBSLonzaBE17-516FPBS without Ca2+ Mg2+ 또는 페놀 레드
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드
DMEM없음 Invitrogen31966-047DMEM, 고포도당, 글루타MAX, 피루베이트
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (Fetal Bovine Serum)
BSASigma AldrichA7030소 혈청
P/SInvitrogen15140-122페니실린-스트렙토마이신, 액체
트립신인비트로겐25300-0540.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드
HeLa 세포ATCCCCL-2
A549 세포ATCCCCL-185
자당시그마 알드리치S7903자당 BioXtra, ≥ 99.5%
IgG2 안티-마우스-FITCBD 파밍겐555057Ms IgG2b K FITC 이소타입 제어
안티-NP-RSV-FITCAbcamab25849안티-호흡기 세포융합 바이러스 항체 [671] (FITC)
밀도 구배 매체(림프렙)축 쉴드1114545
EDTA 튜브BD Biosciences367525
AcetoneMerck Millipore1000141000분석
Material
Centrifuge TubesBeckman Coulter326823 Thinwall, Polyallomer, 38.5 ml, 25 mm x 89 mm
SureSpin 630 Rotor with 36 ml bucketSorvall79368스윙 버킷 티타늄 로터
Sorvall WX80 UltracentrifugeSorvall46900
CB 150l CO2 인큐베이터바인더
용 아세톤

참고문헌

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