시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

요약

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

초록

T 세포 고갈은 만성 바이러스 감염 동안 실패 병원체 정리의 주요 요인이다. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로는이 지속적인 항원 노출에 상향 조절 및 확산의 손실 감소 세포 용해 기능에 기여하고, CD4와 CD8 T 세포에 의해 사이​​토 카인의 생산을 손상됩니다. LCMV 감염의 뮤린 모델에서 T 세포 반응을 증강 이러한 두 경로에 대한 항체를 블로킹 투여. 그러나, 사람의 샘플에서 세포의 사이토 카인 분비와 같은 차단의 효과를 측정하는 시험 관내 분석은 현재 존재하지 않는다. 우리의 프로토콜과 실험 방법은 정확하고 효율적으로 HIV에 감염된 과목에서 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 생산의 복원을 정량화 할 수있게.

여기, 우리는 HIV 특정 CD4 T 세포와 다른 CEL에 미치는 영향에 의해 사이토 카인의 분비를 측정 할 수있는 시험 관내 실험 설계를 묘사L의 부분 집합. CD8 T 세포는 전혈로부터 고갈시키고, 잔존 된 PBMC는 피콜 분리 방법을 통해 분리 하였다. CD8 고갈 된 PBMC는 다음 HIV-1 개그 펩타이드 수영장 자극 한 후, 세포를 37 ° C, 5 % CO _2에서 배양하고, PD-L1 및 / 또는 IL-10Rα에 대한 항체를 차단하고 함께 배양 하였다. 48 시간, 상층 액 구슬의 배열 및 세포 펠렛에 의해 사이​​토 카인 분석을 위해 수집 한 후 QRT-PCR을 이용하여 세포 계측법 또는 전사 분석 흐름을 이용하여 표현형 분석도 수집했다. 더 자세한 분석을 위해, 서로 다른 세포 집단이 된 PBMC에서 선택적 집합 고갈 또는 같은 분석에서 평가되기 전에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬을 얻을 수 있었다. 이들 방법은 항원 특이적인 T-헬퍼 세포에 의해 시토 킨 생산의 조절을 결정하고, 면역 세포의 개체군 간의 기능적 상호 작용을 결정하는 매우 민감하고 구체적인 방법을 제공한다.

서론

영구 바이러스 감염 동안 바이러스의 특정 T-세포는 T 세포의 고갈로 알려진 과정에서 기능적 결함을 취득. 초기 만성 바이러스 감염의 쥐 LCMV 모델에서 생체 내 연구에 지쳐 바이러스 특정 T 세포는 바이러스 성 감염 세포에 대한 세포 용해 기능을 감소 증식 할 수있는 능력을 잃게하고 IL-2, TNF-와 같은 사이토 카인을 생산하는 능력을 감소 한 것으로 나타났다 α ^1,2를 IFN-γ는. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로의 복잡한 네트워크는 만성 감염시 상향 조절 및 ^(3,4 검토) T 세포 기능 장애에 기여하고 있습니다.에서 LCMV 마우스에이 억제 경로에 대한 항체를 차단 생체 관리 모델은 T 세포 고갈 ⁽⁵ 검토) 부분적으로 가역적 인 현상임을 나타내는 소진 바이러스 특정 T 세포의 기능 및 향상된 바이러스 제거를 복원.

일에 발견전자 LCMV 모델은 신속하게 HBV, HCV와 HIV ^5와 같은 인간의 만성 바이러스 성 감염으로 확장되었다. 만성 HIV-1 감염, PD-1과 IL-10 경로는 감염된 과목에서 상향 조절하고 CD4와 반대로 바이러스 부하와 직접, 질병의 진행의 매개 변수와 상....

프로토콜

1. 피콜 분리를 통해 고갈 된 PBMC의 분리

1. 전체 혈액의 50 μL / ㎖에서 인간 CD8 + 공핍 칵테일을 첨가하여 CD8 + T 세포를 고갈.
2. 잘 섞어 실온 (18-25 ℃)에서 20 분 동안 품어.
3. 배양 후, ^{(칼슘 +} 마그네슘 또는 ^{2 +없이} 행크의 균형 소금 솔루션) HBSS로 전체 혈액을 혼합 Histopaque을 통해 계층. 30 분 (노 브레이크, 느린 가속) 340 RCF에 스핀.
4. PBMC를 수집하고 새로운 50 ML 원뿔로 전송할 수 있습니다. 340 RCF에서 10 분 동안 회전시켜 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 %의 HEPES와 보충 45 ML의 RPMI 1640 워시 2 배.

2. 항체 봉쇄 및 세포의 항원 특이적인 자극

1. 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 % HEPES와 보충 10 % 인간 혈청이 포함 된 RPMI 1640 상태 당 2 × ^6에서 재현 탁 세포,조건 당 500 μL를 차지한다.
2. FACS 튜브 당 세포 현탁액....

결과

이 시험 관내 시스템을 사용하여 사이토 카인을 측정 할 때, 자극 제어 명에 비해 항원 특이적인 반응을 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 일반적으로, 우리는 자극 제어하는​​ 분석의 선형 범위 내에서 있었다 없음에 비해 사이토 카인 수준의 최소 3 배 증가를 제공 항원 자극의 값으로 긍정적 인 반응을 고려했다. 우리는 약한 항원 특이 CD4 T 세포 반응을 관찰하기 위해 우리를있게, 0.16 PG / ㎖의 낮은 사이토 카인의 농도를 검출 할 수있는 고감도 비드 어레이 분석을 사용하고 있습니다. 샘플이 정확한 값을 얻을 수 있습니다 확인하기 위해 중복으로 실행됩니다. 그림 2A는 IFN-γ의 생산, 분석이 더 자극에 비해 800 배 증가의 평균을 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 이 값은없는 자극에 비해 같은 IL-13 및 IL-2로 인해 그들 중 일부에 대한 검사를 사이토 카인, 낮은 값에 따라 달라집니다관찰 될 수있다. 비슷한 접근 방식은 다양한 사이토 카인 시험의 mRNA 전사 .......

토론

뜨는 컬렉션이 실험 설계의 필수적인 부분입니다. 루미 넥스 분석을위한 상층 액을 수확하면, 분액 만들어주기 - 해동 동결에 의한 단백질 분해를 방지하기 위해 -80 ° C에 보관 하였다. 냉동과 해동 단백질 및 동결 해빙을 최소화하여 가혹한 과정이 될 수 있습니다, 신호 분석에 극대화 될 것입니다. 따라서, 동일한 횟수를 동결 - 해동 된 분액에서 작업 할 때 반복 가능하고보다 정확한 데이터를 구하는 것이 용이하다.

우리는 이전에 HIV-개그 펩티드 풀 ^(12)와 자극 후 사이토 카인의 분비와 mRNA 수준의 운동 분석을 수행했습니다. 이러한 동역학에 기초하여, 우리는 시토 킨 분비 측정을 수행하기 위해 48 시간 시점을 선택했다. mRNA와 단백질의 분비뿐만 아니라 다른 자극 사이에 관찰 된 차이를 감안할 때, 그것은 연구자들은 자극에 따라 자신의 운동 분석을 수행하는 것이 필수적입니다그들은 mRNA 발현 또는 단백질의 사이토 카인 분비를 측정되는지 여부.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ca2+ 또는 Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Human Serum AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30 001 CI
L-글루타민	Mediatech	25 005 CI
HEPES 완충액	Mediatech	25060CI
FcR 차단 시약, human	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail	Stem Cell	15663
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II 역전사 시스템	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox 마스터 믹스	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 키트	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ 프라이머	Invitrogen		용도: CGAGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH 프라이머	Invitrogen		용도: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG