방법 논문

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

DOI:

10.3791/50842

⸱

2013년 8월 26일

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

이 논문에서

요약

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우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.

초록

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뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 뼈 조직의 세포 외 매트릭스에 포함 된 성장 인자이다. 따라서 치유와 드 노보 골 형성을 자극하는 조골 세포에 중간 엽 세포 분화의 트리거로 BMP-2의 역할. 비계와 함께 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2)의 임상 프레 젠 테이션의 형태에 따라, 최근의 논쟁을 제기하고 양이 전달 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포에 대한 생체 외 연구에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 이종 링커 이루어진 자기 조립 단분자막을 형성하는 방법을 설명하고, rhBMP-2의 공유 고정화를 구하는 후속 결합 단계를 나타낸다. 이 방법으로는 단백질의 생물학적 활성을 유지하면서, BMP-2의 지속적인 프레젠테이션을 달성하는 것이 가능하다. 사실, BMP-2의 표면 고정화는 불특정 광고를 방지하여 타겟 조사를 허용orption, 성장 인자의 양을 줄임과 동시에, 특히, 표면에서 제어되지 않는 방출을 방해. 세포가 공유 고정 된 rhBMP-2를 제시 표면에 노출되었을 때 BMP-2에 의해 트리거 모두 단기 및 장기의 신호 이벤트는 BMP-2 자극에 대한 세포 반응에 체외 연구를위한이 방법이 적합하다 일어나고있다.

서론

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뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 형질 전환 성장 인자 (TGF-β) 가족과 드 노보 골 형성 유도뿐만 아니라 배아 발달과 성인 동안 여러 조직의 조절기 역할을 1-3 항상성의 구성원입니다. 생물학적 활성 homodimeric BMP-2 단백질의 각 단량체는 매우 모든 BMP에 4에 보존되어있는 "시스테인 매듭"모티브가 포함되어 있습니다. 일곱 번째 시스테인이 두 단량체 5,6 사이의 분자간 결합을 형성, 이량에 관여하는 반면, 일곱 시스테인 잔기의 여섯, 각각의 단량체를 안정 분자 내 이황화 결합을 형성한다. 이것은 고도로 보존 된 시스테인 매듭은 BMP-2 단백질의 입체 구조를 정의하고 열, 변성제 및 산성 pH 7-9 대한 저항으로서 독특한 특성을 결정한다. BMP-2함으로써 신호 전달을 유도 세린 / 트레오닌 키나아제 막 관통 수용체 바인딩 10-12. 수용체 올리고머의 모드에 따라 서로 다른 신호 전달 경로가 활성화되어 TGF 계통에 의존하는 통로가 Smad의 복잡한 핵 전좌와의 전사 활성에있는 수용체 인산화의 결과에 의해 활성화 된 반면 Smad의 독립적 인 신호 폭포는, P38 신호를 통해 알칼리 포스 파타 아제의 유도로 연결 이러한 분화의 억제 (ID) 12 ~ 14과 같은 특정 표적 유전자.

뼈, BMP-2, 따라서 치료 및 뼈의 드 노보 형성을 자극하는 골아 세포에 중간 엽 줄기 세포의 분화를 유도한다. 현재 재조합 BMP-2가 골절 사이트의 치유를 강화하기 위하여 임상 적으로 적용되는 표현. 뼈 조직 공학의 일반적인 전략은 로컬 배달 시스템에 비해 덜 침습적 주사 성장 인자의 사용이다. 그러나, 생체 내 연구 및 임상 응용 프로그램을 보여 그 짧은 생물학적 반감기, 불특정 LOCalization와 BMP-2의 빠른 현지 통관 여러 지역 자궁외 및 조직 문제 (15)가 발생할 수 있습니다. 따라서, 효과적인 프리젠 테이션, 물질 내에서 또는 상 BMP-2의 함정 수사 또는 고정을 얻으려면 대상 사이트에서 로컬 및 지속적인 전달을 위해 필요합니다. 지속 전달은 물리적 포착, 흡착 또는 이온 착물 (16)과 같은 비공유 결합 고정 방식으로 달성 될 수있다. 그러나, 그것은 알려져있다 분자 (17)의 변성의 표면에 단백질의 비특이적 흡착 할 수있다 결과. 성장 인자의 결합을 공유 결합의 경우, 지지체의 종류가 지난 십 년간 개발되어왔다. 예를 들어 단백질의 아미노 또는 카르복시기를 대상으로 관능 링킹 분자의 사용은 반드시 그 고정화를 달성하는 단백질 수정을 요구하지 않는 방식의 한 유형이다. 사실, 반면 단백질 변형 단백질 배향을 제어 이점을 제공한다인공 도메인, 펩타이드 태그 및 부위 특이 적 쇄의 도입은 성장의 생물학적 활성은 17 요인 변경할 수있다. 따라서, 인해 담체와의 상호 작용에 변성을 회피하는, 표면은 원하는 요소 (18)의 결합에 의해 다음에 링킹 분자의 자기 조립 단분자막 (SAM), 예를 들어, 미리 관능 화 될 수있다. 우리는 그것의 유리 아민의 잔류를 대상으로 공유 표면에 BMP-2를 고정시키기 SAM-기반 접근 방식을 사용하고 고정 된 단백질의 단기 및 장기 생물학적 활성 19 두를 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 세포막에서 발생하고 골 형성 신호에 대한 책임 세포 내 신호를 조절하는 메커니즘에 체외 연구를위한 세포에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

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프로토콜

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1. 11-Mercaptoundecanoyl-N-히드 록시 에스테르 (MU-NHS)의 합성

  1. 실온 (RT)에서 40 ㎖ 디클로로 메탄 (PA)에있는 10 ㎖의 아세톤 (PA)에있는 (디메틸 아미노) 피리딘 1g에 11 mercaptoundecanoic 산 - 500 mg의 N-하이드 록시의 솔루션과 30 mg의 4 적하 추가합니다.
  2. 0 ° C에 대한 반응을 냉각과 적하 1.1 g의 N (질소 분위기 하에서) 10 ㎖ 용액에 N '- 디시 클로 헥실를 추가합니다. 1 시간 동안 저온에서 반응을 계속 한 후 실온에서 밤새 교반 하였다.
  3. 침전물을 여과하고 감압 하에서 건조. 1:1 비율 석유 벤젠, 에틸 아세테이트 (PA)으로 플래쉬 크로마토 그래피에 의해 생성물을 정제 하였다.

2. 동종 골드 레이어의 준비

  1. 정밀 물티슈 및 에틸 아세테이트 (PA) 및 메탄올 (PA)의 1:1 혼합물을 함유하는 용액에 5 분 동안 초음파 처리들을 깨끗한 유리 커버 슬립. RINS전자 메탄올 기판 및 질소 흐름 하에서 건조.
  2. 스퍼터 코팅 장치의 깨끗한 기판을 놓습니다. 챔버 대피. 60 초간 스퍼터링에 의해 크롬 타겟으로부터 최상부의 크롬 산화물 층을 제거한다. 금속 빔과 40 nm의 금 층으로 코팅 한 다음에 10 nm의 크롬 층과 코트를 아래의 샘플을 놓습니다.

3. BMP-2의 표면 고정화

  1. 약 1 ㎜의 최종 농도에서 N MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF)에 용해시키고, 질소 대기 하에서 4 시간 동안 RT에서 MU-NHS 용액에 금 기판을 부화.
  2. 2 분 DMF에 초음파 처리 표면은, DMF 및 MeOH로 세척하고 질소 흐름 하에서 건조.
  3. 100 ㎍ / ㎖ (-80 ° C에서 보관 분량 씩)의 농도로 멸균 4 mM의 염산에 rhBMP-2의 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 희석액 (3.5 ㎍ / ㎖)의 경우, PBS / 염화나트륨 (PBS 1 M NaCl을 함유)과의 원액을 희석사용하기 직전에 pH를 8.5로 djust.
  4. 4 ° C 하룻밤에 rhBMP-2 작업 솔루션에 MU-NHS를 기능화 표면을 품어. 배양 상층 액을 제거합니다. 초음파 처리 2 분 동안 PBS / 염화나트륨의 표면과 멸균 PBS / NaCl로 3 배 씻는다.

4. 표면 특성

  1. 항체의 비특이적 흡착을 차단하기 위해, 5 % BSA와 표면을 품어 (w / v)의 안티 - BMP-2 항체 (1:100 1 % (W / V를 배양 한 다음 실온에서 1 시간을위한 PBS 용액 RT에서 1 시간 동안) BSA / PBS 용액). PBS와 30 초 동안 초음파 처리로 두 번 표면을 세척 할 것.
  2. 다음 PBS로 두 번 씻어 RT에서 30 분 동안 HRP - 복합 이차 항체 (1:1,000 1 % (W / V) BSA / PBS 용액)으로 기판을 품어.
  3. 플레이트 리더로 ​​570 nm에서 HRP의 효소 활성을 측정하기 위해 Ampliflu 레드 분석을 사용합니다.

5. 생물학적 활성 분석

  1. 6 자 PL 잘 당 종자 1 × 10 5 마우스 C2C12의 근육 아세포10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 37 ° C / 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양들을 보충 된 피루브산을 함유하는 하이 글루코스 DMEM 이루어진 증식 배지에서 ATES.
  2. 고정 된 BMP-2 장식 표면에 파종하기 전에 3-5 시간 동안 혈청이없는 DMEM 세포를 굶어.
  3. 단기 신호 유도의 조사를 위해, 200 ㎕의 신선한 혈청이없는 DMEM에 의해 매체를 교체하고 세포 위의 고정 된 BMP-2 표면을 배치합니다. 표면이 긁히지 않도록 좋은 팁 핀셋으로 취급되어야한다.
  4. 부드럽게 표면을 제거하고 피펫 매체를 대기음, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포 반응의 분석을 진행합니다.
  5. 장기 생물학적 활성, 플레이트 세포의 분석 상 6 일 동안 낮은 혈청 조건 (2 % FBS)에서 37 ° C / 5 % CO 2의 표면과 문화를 그들.

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결과

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그것은 생물학적으로 불특정 화학적으로 조정할 수있는 시스템을 제공하기 때문에 우리의 설정에서, 금은 부형제로 선정되었습니다. 또한, 자기 조립 단분자막의 응용 프로그램이 많은 이점을 수반한다 : 자신의 기능 최종 그룹이 추가로 수정 될 수있는 반면 SAM에 자발적으로, 금속 및 결함이 거의 형태의 단일 층에 자신의 "머리 그룹"을 통해 흡착. 따라서 그들은 통제 아직 높은 적응력 방법 (20)에 인터페이스의 속성을 조정할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

금 - 코팅 된 표면에 BMP-2의 고정화를 위해, 우리는 두 단계 접근법을 사용 : 1) 2))도 1을 참조 (단백질 링커를 반응 후 금 층으로 MU-NHS 링커를 바인딩하고. rhBMP-2의 바인딩을 증명하기 위해, 우리는 효소 면역 측정법을 사용했다. 이 분석에서, rhBMP-2는 BMP-2 특이 항체와 HRP가 결합 이차 항체와 배양 고정 제시 표면. 후자의 바인딩 ㄹ 수A...

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토론

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이 프로토콜에서 우리는 생리 활성 rhBMP-2와 기능화 표면의 준비에 대해 설명합니다. ; rhBMP-2 단백질의 2) 공유 고정화 금 표면에 관능 링커의 자기 조립 단분자막 (SAM)의 1) 초기 형성 :이 방법은 두 단계를 포함한다. 이전의 연구에서, 우리는 관능 링커 및 성장 인자의 효과적인 결합을 검증하고, 표면 고정화 rhBMP-2의 생물학적 활성 (19)를 유지 것을 보여 주었다. 고정화 된 형태로 제공 성장 인자의 생리 활성은 단백질의 방출 및 그 이후의 내재화는 세포의 자극 (24, 25)에 필수적되지 않는 것을 나타내는 다른 연구에서 밝혀졌다. 세포막 22,2로 인해 수용체의 다른 유형의 개선 된 점유율의 효과적인 투여 량을 유지하면서 실제로, 성장 인자의 공유 결합 고정화는 표적 세포의 지속적인 자극을 허용3,26-28.

고정화 rhBMP-2,주의를 제시하는 표면의 제조를위한 전체 공정에 걸쳐 표면...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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우리는 자신의 종류의 지원에 교수 JP 파츠 (생물 물리 화학과, 하이델베르크 대학교 및 새로운 재료 및 바이오 시스템학과, 지능형 시스템을위한 맥스 플랑크 연구소, 슈투트가르트) 감사합니다. 막스 플랑크 먼과 도이치 Forschungsgemeinschaft (EAC-A에 DFG SFB/TR79.)에서 재정 지원도 크게 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
N-하이드록시숙신이미드시그마-알드리치130672 
4-(디메틸아미노)피리딘시그마-알드리치522805 
아세톤AppliChemA2282 
11-메르캅툰데카노산시그마-알드리치674427 
디클로로메탄머크106050 
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide시그마-알드리치D80002 
석유 벤젠Merck 
유리 커버슬립Carl RothM 875 
에칠아세테이트AppliChemA3550 
메탄올Carl Roth4627 
N,N-디메틸포름아미드Carl RothT921 
rhBMP-2R& D Systems355-BM캐리어 프리; E.coli
PBSPAAH15-002로 표현됨 
NaCl칼 로스HN00.2 
폴리(디메틸 실록산) (PDMS)다우코닝 
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Dow Corning 
Anti-rhBMP-2시그마B9553 
염소 안티-마우스 IgG-HRP산타크루즈sc-20052차 항체
Ampliflu Red assaySigma90101 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquidGibco41966High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF7524멸균 필터링, 세포 배양 테스트
완료 Pen/StrepGibco15140 
트립신 0.05%(1x) EDTA 4NaGibco25300 
글리신 (0.1 M)Riedel-de Haë 전화33226 
IGEPAL CA-630 (1%)SigmaI8896용해 완충액 (ALP 분석)19
마그네슘 클로라이드 (MgCl2)(1 mM)Carl RothHNO3.2 
염화 아연 (ZnCl2) (1 mM)Carl Roth3533.1 
p-니트로페닐포스페이트(pNPP)시그마S0942포스파타제 기질
안티-미신 중쇄(MHC)개발 연구 하이브리도마 은행, 아이오와 대학교MF20단클론 항체
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgGInvitrogenA11001 
DAPI시그마D9542 
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), 주파수 35 kHzBANDELIN electronic GmbH Co. KG 
MED 020 스퍼터코팅 시스템BAL-TEC AG코팅 조건
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate readerTecan 

참고문헌

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BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

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