박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자연 속에서, 박테리아는 거의 독립적으로 존재하지 않으며 대신 대사 산물을 분비하여 지역 환경을 변경 다른 미생물의 다양한 배열에 의해 둘러싸여 있습니다. 이러한 대사 물질은 미생물 이웃의 생리 및 분화를 조절하는 잠재력을 가지고 스타일 복잡한 미생물 군집의 유지 가능성에 중요한 요소들이다. 우리는 화학적으로 매개 된 미생물의 상호 작용을 식별하는 형광 기반의 공동 배양 화면을 개발했다. 화면이 고체 미디어 환경 미생물과 형광 전사 기자의 변형을 결합하고 식민지가 공동 배양에서 성장 할 수 있도록 포함한다. 그것은 관심의 특정 표현형 표현하면 선택된 균주는 형광 있도록 형광 전사 기자 설계 (즉 바이오 필름 형성, 포자 형성, 독성 인자 생산, 등.) 검사는 성장 조건에서 수행 갔지이 표현형 다시 표현 (따라서 기자의 변형은 일반적으로 비 형광입니다)되지 않습니다. 환경 미생물이 표현형을 활성화 대사 산물을 분비 할 때, 한천을 통해 확산 및 형광 기자의 구조를 활성화합니다. 이 유도 - 대사 산물을 생산하는 미생물 탐지 할 수 : 그들은 형광 식민지에 가장 인접 비 형광 식민지입니다. 따라서,이 화면은 기자의 변형에서 특정 생리적 반응을 활성화 확산 대사 산물을 생산 환경 미생물의 식별을 할 수 있습니다. 이 책은 방법에 대해 설명합니다 :) 적절한 공 배양 검사 조건을 선택, b)는 기자와 검사에 대한 환경 미생물을 준비, C) 공동 배양 화면을 수행, D) 추정은 생물을 유도 분리, 전자) 보조 화면에 자신의 활동을 확인합니다. 우리는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)에있는 바이오 필름의 매트릭스 생산을 활성화 토양 생물에 대한 화면이 방법을 개발
서론
우리는 박테리아가 분비하는 대사가 이웃 미생물의 생리 및 개발에 영향을 미치는 방법에 대한 이해에 관심이 있습니다. 많은 대사 산물은 다른 미생물에 대한 자신의 생리 활성 효과를 특징으로하고 있습니다. 두 잘 설명 된 예는 다른 미생물의 해외 유전자 발현을 변경하는 다른 미생물의 성장을 억제하는 항생 물질, 및 정족수 인식 분자를 포함한다. 그러나 박테리아는 알려진 bioactivities 1이없는 다른 많은 작은 분자 천연 제품을 생산하고 있습니다. 우리는 박테리아가 진화하고 그들 대부분 세균이 존재하는 내에 복잡한 미생물 군집에서의 미생물 이웃 세포 생리학을 변조 할 수 있기 때문에 이들의 대사 산물을 생산하는 능력을 보존한다는 가설.
바실러스 서브 틸리 세포 유형
우리는 Bacil을 포함하는 화학적 매개 미생물의 상호 작용에 대한 우리의 연구 초점을 맞추고있다LU의 서브 틸리 스. 이뿐만 아니라 때문에 그람 양성 모델 박테리아와 조작에 사용할 수있는 결과 유전 도구와 같은 상태의뿐만 아니라, 때문에 특징 종류의 세포로 분화 할 수있는 능력이다. 예는 셀을 포함한다 :; 강력한 biofilm 형성에 필요한 세포 외 기질을 생산, 환경으로부....
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프로토콜
1. 리포터 유전자를 선택하고 형광 전사 리포터를 구축
B. 서브 틸리 기준 :
- 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형광 전사 기자의 구조를 설명하는 프로토콜에 대한 기준 19 조브 문서를 참조하십시오.
다른 세균 종의 경우 :
- 관심의 생리적 반응 중에 상향 조절되는 유전자를 식별합니다. 이는 기존 문헌 또는 특정 조건 하에서 미생물의 전사 분석에 기초 할 수있다.
- 표현형의 변화에 대한 프록시 역할을하는이 유전자의 전사 형광 기자를 구축합니다. 이러한 구조는 (도 1 참조) 적절한 형광 단백질의 생산을 구동이 상향 조절 유전자의 프로모터를 포함한다.
- 염색체에 중립 궤적으로이 구조를 통합 할 수 있습니다. 이렇게하면 그 고유 등록관심의 유전자의 ulation는 파쇄 및 환경 미생물의 성장을 방해 할 수있는 플라스미드를 선택 메커니즘 (예 : 항생제)에 대한 필요성을 피할 수 없습니다.
2. 공 배양 조건을....
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결과
이 화면은 B.의 생리를 변경 화합물을 분비하는 토양 미생물을 확인하는 데 사용 하였다 서브 틸리 스. 여기에 기재된 결과는 B.의 행렬 생성 세포 유형에 집중 이 박테리아의 강력한 biofilm 형성에 필요한 단백질과 엑소 폴리 사카 라이드를 생산 서브 틸리 스,. 우리는 우리의 형광 기자의 구조 (P 타파-YFP)의 타파 - sipW - TASA 오페론의 프로모터를 선정했다. 이 오페론의 매트릭스 단백질의 구조적 요소를 인코딩하고 생물막 매트릭스 (23)의 생산 중에 상향 조절된다. 우리의 매트릭스 기자 (그림 1)은 이전에 19 기술로 건설되었다.
이전 작업 결과에 따르면 B. 서브 틸리는 자체 제작 쿼럼 센싱 같은 분자 surfactin뿐만 아니라 다른 토양 박테리아 (20)에.......
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토론
이 프로토콜의 본질적인 한계 중 하나는 미생물 유기체의 cultivability에 의존하고 있다는 점이다. 도 24을 문서화 한 바와 같이, 지구상에서 가장 미생물 생명은 (아직) 날짜 탐구 배양 조건에서 재배 할 수 없습니다. 따라서, 자연 환경에서 발생하는 미생물 종 사이의 상호 작용의 거대한 숫자는이 방법을 사용하여 발견되지 않을 것입니다. 우리의 욕망은 이러한 상호 작용의 존재를 확인, 그러나 또한 그들을 중재에 관여하는 메커니즘과 분자를 연구하는 단지이기 때문에 그러나, 이러한 미생물을 배양 할 수있는 능력이 필요합니다. 심지어 경작 종 내에서,이 지역은 제대로 접근 방식은 여기에 미생물 사이의 화학적 매개 상호 작용을 식별 할 수있는 방법으로 가치있는 기여를 설명하고, 탐구하고있다. 이 프로토콜은 바실러스 서브 틸리 스의 행렬 유도 스크리닝하기 위해 최적화되어 있지만, 또한, 이론적으로 적용될 수있다다른 세균 종의 Y 전사 형광 기자.
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
저자 덕분에 자신의 귀중한 조언과이 공 배양 화면의 개발 과정에 도움 로베르토 콜터 (하버드 의과 대학). 그녀는 그림 6을 얻는에 대한 지원도 명확성을 위해 원고를 읽어 주셔서 감사합니다 마 힘, 그리고 치아 - 이순신 쳉.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 분광 광도계 | OD600 absorbance 값을 측정할 수 있는 모든 분광 광도계. | ||
| Luria broth, Lennox | VWR | 80017-484 | 대체 미디어 소스가 필요할 수 있습니다. |
| 유리 구슬, 3mm | VWR | 26396-508 | |
| 젤 로딩 팁, 원형 | VWR | 29442-666 | |
| 유리 막대 | VWR | 59060-069 | |
| 형광 해부 입체 현미경 | Zeiss | N/A | 저자는 EXFO X-cite 120 형광 광원, 장역 통과 YFP 필터 큐브, 아크로맷 0.63X 대물렌즈, 10X 접안렌즈 및 Axio HRC HR 디지털 카메라. 대부분의 스크리닝은 2.0-3.2X에서 포커싱 마운트로 수행되었습니다. 형광 기능이 있는 모든 해부 입체경은 사용 중인 FP에 대한 올바른 필터가 있는 경우 괜찮습니다. 명시야와 형광 사이를 쉽게 전환할 수 있는 셔터와 위와 아래에서 조명을 허용하는 스테이지가 있는 것이 가장 좋습니다. 이미지를 캡처하려면 부착된 카메라도 필요합니다. |
참고문헌
- Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R.
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재인쇄 및 허가
