이 프로토콜은 진핵 세포에서 전체 세포 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 대식세포의 미세환경에 대한 반응으로 대식세포의 다중 활성화 상태를 분석하여 이 기술의 정확성을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
전체 셀 MALDI-TOF 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다
이 논문에서
요약
초록
MALDI-TOF는 화학 및 생화학에서 광범위하게 사용되는 질량 분석 기술입니다. 또한 분자와 바이오마커를 식별하기 위해 의학에도 적용되었습니다. 최근에는 미생물학에서 준비 또는 분별 단계 없이 임상 샘플에서 성장한 박테리아를 일상적으로 식별하기 위해 사용되고 있습니다. 우리와 다른 연구자들은 이 전체 세포 MALDI-TOF 질량 분석 기술을 진핵 세포에 성공적으로 적용했습니다. 현재 응용 분야는 세포 유형 식별에서 세포 배양 및 진단 응용 분야의 품질 관리 평가에 이르기까지 다양합니다. 여기에서는 사이토카인 또는 열에 의해 죽은 박테리아에 반응하는 대식세포의 다양한 편광 표현형을 탐색하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 대식세포의 단백질체 반응의 다양성을 대표하는 대식세포 특이적 지문을 식별할 수 있었습니다. 이 응용 프로그램은 방법의 정확성과 단순성을 보여줍니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 병리학적 조건에서 면역 숙주 반응을 연구하는 데 유용하거나 더 넓은 진단 응용 분야로 확장될 수 있습니다.
서론
MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)는 생물학적 시료를 연구하는 데 널리 사용되는 질량 분석 기술입니다. 레이저 빔과 에너지 흡수 매트릭스를 사용하면 소프트 이온화 과정, 즉 대부분 단일 전하를 띤 대형 생체 분자의 증발 및 생성이 가능합니다. 이 과정을 탈착/이온화라고 하며 MALDI라는 약어를 정당화합니다. 그런 다음 이러한 이온은 전압의 인가에 의해 가속되고 TOF 분석기로 들어가 이러한 이온을 분리하고 각각의 질량을 정량화할 수 있습니다1.
MALDI-TOF MS는 생물학, 화학 및 의학에서 분자 및 바이오마커2-4를 식별하거나 proteins5,6에서 번역 후 변형을 모니터링하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 최근 여러 그룹에서 MALDI-TOF MS를 적용하여 임상 샘플에서 미생물을 식별했습니다7,8. 이 미생물 응용 분야는 이제 임상 환경에서....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
현재 프로토콜에서는 전체 세포 MALDI-TOF 기술을 사용하여 샘플의 지문으로 간주되는 질량 스펙트럼을 얻습니다. 생물 정보학 분석을 통해 이러한 지문을 비교하고 분류할 수 있었습니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 부분이 있습니다.
- 생물학 견본의 준비: 다른 주작동근으로 자극된 통제 대식 세포 및 대식 세포.
- 전체 세포 MALDI-TOF MS에 의한 기술적 복제로 각 유형의 시료 분석.
- 원시 데이터의 생물 정보학 분석.
세포 분리 및 배양을 위한 멸균 용액을 준비합니다. 모든 시약을 준비하고 4°C에서 보관하십시오
.1. 인간 단핵구의 준비
- 세포 배양 배지를 준비합니다. RPMI 1640 배지(500ml)에 인간 혈청 AB+ 또는 소 태아 혈청(FBS) 55ml와 항생제 용액(페니실린 10,000 UI/ml 및 스트렙토마이신 10,000 μg/ml, 최종 농도 페니실린 100 UI/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml)을 추가합니다.
- 백혈구 농축물(leukocyte concentrates)로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리합니다.
- 15ml ....
- 백혈구 농축물(leukocyte concentrates)로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
본 프로토콜의 목적은 대식세포가 주변 미세환경에 반응하는 정도를 평가함에 있어 전세포 MALDI-TOF MS의 정확성을 입증하는 것입니다.
그림 1은 혈액 샘플로부터 자극된 대식세포를 준비하는 과정을 설명합니다. 그림 2는 유세포 분석을 통한 단핵구 및 MDM의 분석 결과를 나타냅니다. 단핵구는 CD14를 발현했지만 CD68은 발현하지 않았음에 유의하십시오(그림 1A). 반대로, MDM은 CD68을 발현했지만 CD14는 발현하지 않았습니다(그림 1B).
그림 3은 전세포 MALDI-TOF MS의 원리를 설명합니다. 세포를 매트릭스와 함께 타겟 플레이트에 도포합니다. 질량 분석기 내부에서 레이저 빔이 샘플에 여러 번(240회) 조사되어 분자의 탈착과 이온화를 유도합니다. 생성된 이온.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 진핵 전체 세포에 대한 MALDI-TOF-MS의 사용을 설명합니다. 여기에서는 미세 환경에 대한 반응으로 대식세포의 다중 활성화 상태를 분석하여 방법의 정확성을 설명합니다.
프로토콜의 성공은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 용액 오염 물질은 스펙트럼을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 표적에 증착하기 전에 PBS에서 세포를 세척하여 배양 배지와 혈청 단백질을 제거하는 것이 중요합니다. 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 1 x 105 세포/μl의 세포 농도도 필요합니다. 둘째, 결정화는 프로토콜의 중요한 단계입니다. 좋은 품질의 결과를 보장하려면 타겟 플레이트를 조심스럽게 세척하고 타겟에 샘플을 증착하기 전에 매트릭스를 준비해야 합니다. 매트릭스 용액 직전에 샘플을 타겟에 증착할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다(타겟에 증착하기 전에 샘플을 매트릭스와 혼합하지 마십시오). 샘플과 매트릭스 용액 사이의 올바른 자발적 혼합을 위해서는 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다. RO, JLM 및 CC는 "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF"라는 국제 특허 WO 2011/154650의 발명가입니다.
감사의 글
Richard Ouedraogo는 산테 부처(PHRC 2010)의 보조금으로 지원됩니다. 기술 지원을 제공해 주신 Laurent Gorvel, Christophe Flaupdrops 및 Nicolas Amstrong에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
참고문헌
- Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
- Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
- D....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
