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방법 논문

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

10.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50932

⸱

2014년 2월 22일

 ,  ,  , 
1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.

초록

망막의 빛 감지 세포, 즉 광수용체의 손실로 인한 시력 장애 및 실명은 선진국에서 장애의 주된 이유를 나타냅니다. 세포 이식에 의한 퇴화 광수용체의 교체는 향후 임상 적용에서 가능한 치료 옵션을 나타낸다. 실제로, 최근 전임상 연구는 산후 4일째에 신생아 마우스 망막에서 분리된 미성숙광수용체가 침전 이식 후 성인 마우스 망막에 통합될 가능성이 있음을 입증했습니다. 기증자 세포는 내과성 양극성 세포에 근접하여 내부 및 외부 세그먼트, 외부 핵 층에 위치한 둥근 세포 체, 시냅스 말기를 포함한 성숙한 광수용체 형태를 생성하였다. 실제로, 최근 보고서는 기증자 광수용체가 기능적으로 숙주 마우스의 신경 회로에 통합한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 세포 교체 접근법의 향후 임상 적용을 위해, 선택의 세포의 정제 된 현탁액을 생성하고 눈에 적절한 통합을위한 올바른 위치에 배치해야합니다. 광수용체 전구체의 농축을 위해, 선별은 기증자 세포의 유전 기자 수정을 피하기 위하여 특정 세포 표면 항원에 기초해야 합니다. 여기서 우리는 자기 관련 세포 선별(MACS) -세포 표면 마커 CD73에 기초하여 광수용체 특이기자 마우스의 신생아 망막으로부터 분리된 이식 가능한 막대 광수용체 전구체의 농축을 보여준다. 항 CD73 항체를 함유한 배양은 마이크로 비드 컨쥬게이드 이차 항체에 이어 MACS에 의한 로드 광수용체 전구체의 농축을 약 90%까지 허용하였다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 GMP 표준에 더 쉽게 적용할 수 있으며 많은 양의 세포를 상대적인 짧은 기간에 정렬할 수 있다는 장점이 있습니다. 성인 야생형 마우스의 하수 공간에 농축된 세포 현탁액을 주입하면 분류되지 않은 세포 현탁액에 비해 3배 더 높은 통합률을 보였습니다.

서론

시력은 인간의 주요 감각 중 하나입니다. 이러한 감각과 실명의 장애는 선진국의 장애의 주된 이유 중 하나입니다. 시력 장애 또는 실명에 대한 주된 원인은 황반 변성, 망막 색소, 콘로드 이영양증 및 기타 조건에서 관찰될 수 있으므로 광수용체 세포 손실을 특징으로 하는 망막 변성입니다. 현재까지 잃어버린 시력을 복원하는 효과적인 치료법은 제공되지 않습니다. 2006년과 2008년에 는 서로 독립적으로, 영성 야생형 마우스망막1,2로막대 광수용체 전구체 세포를 성공적으로 이식하는 두 개의 상이한 실험실을 보고하였다. 따라서, 광수용체 전구체 세포 이식의 가능성을 발생시키고 또한 퇴화 된 망막으로, 퇴화 광수용체를 대체하고 시력을 회복시킨다. 실제로, 최근에는 이식된 광수용체 전구체세포가 제대로 발달된 외부 세그먼트3,시냅스 말단과 외부 핵층2-4에위치한 둥근 세포 체와 근접한 성숙한 야생형 광수용체의 형태학적 기준을 유도하고 있으며, 뿐만 아니라, 소각 회로 신경에 기능적으로 통합할 수 있는 능력도 입증되었다. 이 전략의 주요 원리 중 하나는 산후 4일 (PN 4, PN0은 출생의 날로 정의) 젊은 마우스 망막의 사용으로, 이식을위한 다른 세포 유형의 혼합물의 결과. 미래의 치료 응용 프로그램의 배경에, 이 혼합물은 광수용체 전구체 세포에 대해 정제되어야한다. CD73은 망막8-10에서젊은 광수용체에 대한 제1 세포 표면 마커로 기재되었다. 여기서, 우리는 이러한 세포 표면 마커에 기초하여 광수용체 전구체 세포 정화 방법을 시연하고 자기 관련 세포 선별(MACS) 기술을 사용한다. MACS는 빠른 정렬 시간과 GMP 조건에 대한 쉽게 조정으로 인해 형광 활성화 셀 정렬 기술에 비해 장점이 있을 수 있습니다. 우리는 성인 야생 형 망막에서 하수 공간으로 농축 된 인구를 이식 할 때 ~ 90 % 농축 및 최대 3 배 높은 통합 률을 입증 할 수 있습니다. 따라서 MACS 기반 광수용체 전구체 세포 농축 및 피망 이식은 망막 퇴성의 치료를 위한 재생 치료 전략의 개발을 위한 신뢰할 수 있고 유망한 기술이다.

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프로토콜

동물의 윤리적 사용 및 관리 성명서:

모든 동물 실험은 유럽 연합 및 독일 법률 (Tierschutzgesetz)에 따라 엄격하게 수행되었으며 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 모든 동물 실험은 TU 드레스덴과 Landesdirektion 드레스덴의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다 (승인 번호: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. 세포 절개 및 셀 정렬을 시작하기 전에

  1. 세 개의 15ml 반응 튜브라벨: 세척(W), 포지티브 분수(+) 및 음수분(-).

2. 망막 해리

  1. 가위를 사용하여 PN 4 새끼를 참수하십시오.
  2. 강아지의 머리를 70 % 에탄올로 헹구고 PBS에서 세척합니다.
  3. 머리를 차가운 HBSS로 옮기고 눈을 방출합니다 (모든 머리에 대해이 단계를 반복하십시오). 신경을 방출하려면 눈꺼풀을 열고 시신경 부위의 곡면으로 눈을 고정시합니다. 그런 다음 시야를 조심스럽게 궤도밖으로 끌어냅니다.
  4. 모든 눈을 방출 한 후 망막을 분리하십시오 : 닫힌 가위를 시신경에 도입하고 블레이드를 엽니 다. RPE /chorid 밖으로 peal. 구부러진 집게를 사용하여 렌즈와 혈관을 제거합니다.
  5. 분리된 망막을 파팡 용액을 함유하는 1.5 ml 반응 튜브로 옮김(파팡 해리 키트에 의해 제공).
  6. 37°C에서 수조 또는 셰이커(400rpm)에서 30-60분 동안 파팡 용액의 망막을 배양한다.
    1. 망막은 파팡 용액에 배양하는 동안, 15ml 반응 튜브 (라벨 "1")에 ovomucoid 용액의 파이펫 1 ml.
    2. DNase I (10 mg/ml) + ovomucoid 용액 60 μl (키트제공) + EBSS 520 μl을 15ml 반응 튜브 (라벨 "2")에 추가합니다.
  7. 파파인 인큐베이션 후, 부분적으로 소화된 망막을 포함하는 파팡 용액을 반응 튜브 "2"로 전달한다.
  8. 불을 연마한 파이펫을 사용하여 기계적 해리(10배 상하)를 수행합니다.
  9. 파이펫 반응 튜브 "1"에 단일 셀 서스펜션. 난소용액 위에 셀 서스펜션을 부드럽게 겹쳐서 2층을 생성해 보십시오.
  10. 300 x g (약 1,300 rpm)에서 5 분 동안 원심 분리기.
  11. 상체를 버리고 MACS 버퍼의 500 μl에서 셀을 다시 일시 중지합니다.

3. 자기 연관된 세포 분류(MACS)를 사용하여 셀 정렬

  1. 10 μg/ml의 최종 농도를 달성하기 위해 X μl 쥐 항 CD73 항체를 500 μl에 첨가하십시오.
  2. 얼음에 5 분 인큐베이션.
  3. MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 10ml로 채우고 원심분리기는 300 x g의 속도로 5 분 동안 작성합니다.
  4. 상부체를 제거합니다.
  5. 480 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 염소 안티 쥐 IgG 마이크로 비드의 120 μl을 추가합니다.
  6. 얼음에 15 분 인큐베이션; 동요하지 마십시오, 흔들어 또는 혼합.
  7. MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 5ml로 채우고 원심분리기는 300 x g에서 5 분 동안 작성하십시오.
  8. 반응 튜브가 원심 분리됨에 따라:
    1. LS 컬럼을 마그네틱 스탠드에 조정합니다.
    2. LS 열 위에 사전 분리 필터를 놓습니다.
    3. 3ml MACS 버퍼로 프리분리 필터와 LS 컬럼을 수분화하고 MACS 버퍼를 세척(W) 튜브로 수집합니다.
  9. 상부체를 제거합니다.
  10. 500 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.
  11. 500 μl 셀 서스펜션을 필터에 로드한 다음 필터에 1ml MACS 버퍼를 추가하고 음극분획(-) 반응 튜브에 음극기를 수집합니다.
  12. 그런 다음 컬럼에 3 x 3 ml의 MACS 버퍼를 추가하여 열에 바인딩되지 않은 셀을 씻어 내다
  13. 이 9ml가 LS 컬럼을 통과하면 자기 스탠드에서 컬럼을 제거하고 양극분수(+) 반응 튜브 위에 설치합니다.
  14. LS 열에 5 ml의 MACS 버퍼를 빠르게 로드하고 LS 열에 플런저를 넣고 전체 버퍼가 열을 통과할 때까지 아래로 누릅니다.
  15. 300 x g에서 5 분 동안 양성 분획을 포함하는 반응 튜브를 원심 분리합니다.
  16. 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 μl에서 다시 중단하고 4 °C에서 유지하십시오.
  17. 공통 셀 계수 장치를 사용하여 셀의 총 양을 계산합니다.
  18. MACS 버퍼에서 2 x 105 셀/μl을 포함하는 양극 분수에서 셀 서스펜션을 준비하고 4°C에서 보관하십시오.

4. 마우스 망막에 MAC 정렬 광수용체 전구체 세포의 이식

  1. 다음 의 모든 솔루션을 준비해야 합니다: 1ml 멸균 PBS 또는 HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml 멸균 제H2O, 4°C에서 셀 서스펜션 분획의 알리쿼트.
  2. 메데토미딘 염산염(0.01 mg/10g 체중), 케타민(0.75 mg/10g 체중)의 인트라피오네 주사로 성인마우스(즉, 2-4개월)를 마취한다. 그런 다음 통증 완화를 위해 Buprenorphine (0.05 mg/kg 체중)의 피하 주사를 수행하십시오.
  3. 페닐레프린 2.5%-트로피카미드 0.5% 하락으로 동공을 넓히게 한다.
  4. 마우스 헤드 홀더에 마우스를 고정하고 스테레오 현미경 아래에 배치합니다.
  5. 눈의 건조를 방지하기 위해 Visidic 젤 한 방울을 바르십시오.
  6. 바늘에 멸균 30 G 1/2를 사용하여 clera와 각막 (각각 오라 세라타)사이의 경계에 작은 구멍을 확인합니다.
  7. 다이아몬드 펜을 사용하여 일반적인 커버 슬라이드를 작은 (약 5mm x 5mm) 조각으로 자르고 각막 위에 이 조각 중 하나를 배치하여 망막의 직접 시각화를 허용합니다.
  8. 미리 살균 된 마이크로 리터 주사기를 탈화 된 물로 여러 번 플러시하십시오.
  9. 마이크로리터 주사기를 셀 서스펜션 1μl로 적재하고, 결막과 클era를 통해 직접 바늘을 접선으로 적재하고 망막의 비강 반의 비강에서 시각적 제어 하에 놓습니다.
  10. 망막에 구멍을 부드럽게 뚫고 침전 공간에 도달할 때까지 셀 서스펜션을 적재 공간에 주입합니다.
  11. 결막의 황소 분리를 관찰, 어떤 출혈없이 망막 공간의 약 1/4를 커버, 균일해야한다.
  12. 주사기를 부드럽게 인출하면 망막 구멍 씰이 자동으로 밀봉됩니다.
  13. 마이크로리터 주사기를 탈온화물로 여러 번 플러시합니다.
  14. 헤드 홀더에서 마우스를 놓습니다.
  15. 메데토미딘 염산염 효과의 반전을 위해 아티파노졸 염산염을 주입하여 마우스를 깨우는 다.
  16. 따뜻한 어두운 챔버 (약 25 °C)에서 일어나 시간을 위해 마우스를 놓습니다.
  17. 이식 후 다음 2일, 부프레노르핀(0.05 mg/kg의 체중)은 통증 완화를 위해 아침과 오후에 피하 주사에 의해 투여되어야 한다.

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결과

마우스 망막에 통합하는 막대 광수용체의 능력을 평가하기 위해 마우스 리포터 라인이 사용되었으며, GFP는 신경망막 류신 지퍼(Nrl, Nrl-GFP)프로모터(11)에의해 구동된다. Nrl은 항봉 광수용체세포의 특정 라벨링을 허용하는 성인기 전반에 걸쳐 E12.5에서 발현을 시작하는 로드 광수용체의 초기 마커이다.

PN 4 Nrl-GFP 새끼는 참수되었고 눈이 에클레아트되었습니다. 망막은 그 때 위에서 기술한 방법을 사용하여 격리되고 해리되었다. 결과 셀 서스펜션은 CD73 기반 MACS(그림1 및 2)를사용하여 정렬하였다. MAC 정렬 후 이 절차 에서 달성된 농축을 분석했습니다.

도 3A에도시된 바와 같이, 초기 세포 현탁액(Input)은 30.4% GFP 양성 세포를 함유하고 있다. 막대 광수용체. C...

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토론

광수용체 전구체 세포의 침전체 이식은 이러한 빛에 민감한 세포의 통합을 달성하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 나타내며, 이는상당수1,2에서숙주 망막으로 통합된다. 이것은 미래에 망막 퇴행성 질병의 처리를 위한 세포 치료의 설치를 허용할 지도 모릅니다6. 현재 PN 4 망막으로부터 분리된 세포의 기증자 인구는 다른 세포 유형의 혼합물이며, 이 세포는 감전 주사 후 광수용체 전구체 세포만 통합한다. CD73 기반 MAC 선별을 사용하여, 기증자 세포 현탁액 내의 광수용체의 비율은 분류되지 않은 세포 인구에 비해 야생형 숙주 망막에서 약 3배 더 높은 통합률을 허용하는 90%≈ 증가시킬 수있다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 빠른 선별 절차의 장점을 가지며 GMP 표준에 비교적 쉽게 적용할 수 있습니다. 이식 가능한 광수용체의 정제는 만능 줄기 세포로부터 의 체외 생성에 대한 최근의 장점에 비추어 특정 관심사이다12-14. 분화 된 만능 줄기 세포의 배양은 특정 선별 절차의 ...

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공개 사항

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 Nrl-GFP 마우스를 제공 아난드 스와롭, 기술 지원을위한 요헨 하스, 동물 축산에 대한 신디 뵈메와 에멜리 레스만을 제공 감사드립니다.

이 작품은 도이치 포충스게마인샤프트(DFG): FZT 111 - 재생 치료 드레스덴 센터, CRTD 종자 보조금 프로그램, SFB 655 및 프로레티나 e.V. 재단, DIGS-BB 대학원 프로그램 드레스덴, 그리고 Fundação 파라 시엔시아 e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150공급 DNase I은
정제 된 쥐 안티 마우스 CD73, 클론 TY / 23BD Pharmingen550738주식 농도 0.5 mg / ml
염소 안티 랫 IgG MicroBeadsMiltenyi130-048-5012 ml의 총 부피
PBSGibco10010-015총 세포 수를 계산하는 데 사용
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050망막 해리에 사용
Trypan blueSigmaFluka93595총 세포 수를 계산하는 데 사용
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
케타민 10%비율 제약7538843
안티세단화이자76590
페닐레프린 2.5%-트로피카미드 0.5%대학 클리닉 드레스덴 약국
사전 분리 필터Miltenyi130-041-407
LS 열Miltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
QuadroMACS 분리기Miltenyi130-090-976
파이어 폴리시 유리 파스퇴르 피펫브랜드74777 20피펫' 팁은 파이어 폴리싱 및 오토클레이브 처리되어야 합니다.
MACS 15 ml 튜브 랙Miltenyi130-091-052
세포 계수 챔버Carl RothT728.1
멸균 15 ml 튜브Greiner Bio-One188271
Leica M651 MSD LeicaM651 MSDOlympus SZX10 대신 사용할 수 있습니다. Olympus SZX10
Olympus SZX10Leica M651 MSD
대신 Olympus SZX10을 사용할 수 있습니다.Olympus 도립 실체 현미경 CKX41OlympusCKX41
세포 배양 후드, Thermo Scientific MSC-AdvanceThermo Scientific51025411
1.5 ml 반응관Sarstedt727706400
2 ml 반응관Sarstedt72695
Eppendorf Centrifuge 5702VWR (Eppendorf)521-0733
마우스 헤드 홀더myNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
Hamilton 마이크로리터 주사기 5 µ l, 75RN해밀턴065-7634-01바늘 없이 배달
해밀턴 RN 특수 바늘 34 G해밀턴065-207434무딘, 12mm 길이
Vannas-Tü bingen 스프링 가위 - 5mm 블레이드 스트레이트파인 사이언스 도구15003-08
Dumont #7 포셉스 - 티타늄 생물학파인 사이11272-40
다이아몬드 펜툴-테크
15mm x 15mm 커버 슬립스파크MIC3366
대신 사용할 수 있습니다. , , , 언스 도구

참고문헌

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  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

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