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방법 논문

Marble Burying 및 Nestlet Shredding as Tests of Repetitive, Comobive-like behaviors in Mice(쥐의 반복적이고 강박적인 행동 테스트로서의 Marble Burying and Nestlet shredding as Marble Burying and Nestlet shredding as testitive, compulsive-like behaviors in mice)

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DOI:

10.3791/50978

⸱

2013년 12월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Research and Development Service, John D. Dingell VA Medical Center and Department of Psychiatry & Behavioral Neurosciences, Wayne State University School of Medicine

이 논문에서

요약

질병, 머리 부상, 유전자 변형 및 약물 투여 쥐의 치료는 행동에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다. 대리석 매몰 및 둥지 파쇄와 같은 잘 특성화되고 검증된 접근 방식을 사용하여 인간 강박 장애 및 자폐 스펙트럼 장애의 모델로 생쥐에서 강박과 유사한 행동을 정확하게 문서화할 수 있습니다.

초록

강박 장애(OCD) 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 심각하고 쇠약하게 만드는 정신 질환이며 각각 특히 어린이에게 중요한 공중 보건 문제를 구성합니다. 이 두 가지 조건은 모두 무의미한 행동의 반복적인 표현에 의해 강조됩니다. 강박장애를 앓고 있는 사람들은 종종 확인, 잦은 손 씻기, 숫자 세기를 보여줍니다. ASD를 앓고 있는 아동은 또한 반복적인 두드리기, 팔이나 손 펄럭이기, 흔들기에 참여합니다. 이러한 행동은 표현의 강도와 빈도가 매우 다양할 수 있습니다. 더 강렬한 형태의 반복적인 행동은 심지어 부상(예: 과도한 그루밍, 손 씻기, 자기 자극)을 초래할 수도 있습니다. 따라서 이러한 행동은 매우 파괴적이며 정상적인 사회적 담론을 어렵게 만든다. 강박장애와 자폐장애의 반복적 행동에 대한 치료 옵션은 다소 제한적이며, 각 상태에 대해 보다 효과적인 치료법을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. 지난 30년 동안 강박적인 행동을 평가하기 위한 수많은 동물 모델이 개발되었다. 아마도 가장 타당성과 사용 편의성이 가장 높은 동물 모델은 대리석 매장 테스트와 둥지 파쇄 테스트 일 것입니다. 두 테스트 모두 대상 행동이 마우스에서 자발적으로 발생한다는 사실을 이용합니다. 대리석 매립 테스트에서는 깨끗한 침구 표면에 20 개의 대리석이 배열됩니다. 30분 동안 묻힌 구슬의 수는 피험자의 치료나 상태에 대해 알지 못하는 조사관에 의해 점수가 매겨집니다. nestlet 파쇄 테스트에서는 펄프면 섬유로 구성된 nestlet을 미리 계량하여 케이지 침구 위에 놓고 30분의 테스트 세션 후에 손상되지 않은 nestlet의 양을 측정합니다. 현재 우리는 대리석 매립 및 둥지 파쇄에 대한 프로토콜을 설명하고 영화 문서를 보여줍니다. 두 검사 모두 쉽고 정확하게 채점되며, 유전자 조작, 질병 또는 머리 부상으로 인한 강박적인 행동의 작은 변화에도 민감합니다.

서론

인간 행동, 특히 정신 질환에 대한 마우스 모델은 질병 메커니즘 연구 및 새로운 치료법 개발에 중요하고 필수적인 실험적 접근 방식을 구성합니다. 많은 정신 질환은 동물에서 모델링하기가 매우 어렵습니다 (예 : 정신 분열증). 그러나 동물은 인간의 유사한 행동과 쉽게 연결될 수 있는 자연스럽고 독특한 행동을 많이 보입니다. 움직임 또는 운동 활동은 인간과 유사한 동물의 행동의 한 예입니다. 설치류는 종종 다양한 반복적인 행동에 참여하며 예를 들어 그루밍 또는 파기가 있습니다. 인간에게 반복적이고 원치 않는 행동을 보이는 것과 관련된 한 가지 정신 질환은 강박 장애(OCD)입니다. 강박장애의 매우 특징적인 행동에는 확인, 계수, 과도한 씻기나 몸단장이 포함됩니다. 강박장애는 매우 흔하며(인구의 1-3%에 영향을 미침) 쇠약하게 하는 정신 장애1. 강박장애를 치료하기 위해 많은 약리학적 및 행동학적 접근법이 사용되었습니다. 이들 중 다수는 장기적인 완화를 제공하지 못하며, 치료 요법이 끝날 때 재발하는 경우가 흔하다2,3. 반복적 행동이라는 표현과 관련된 또 다른 정신 질환은 자폐 스펙트럼 장애(ASD)입니다. ASD는 의사소통 및 사회적 상호작용의 결핍과 빙글빙글, 흔들기, 손가락 튕기기 또는 펄럭임, 복잡한 신체 움직임을 포함하는 반복적이고 고정관념화된 행동이 특징입니다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)는 어린이 88명 중 1명이 ASD 진단을 받는 것으로 추정했습니다. 이 질환에 대한 치료 방법은 그 수와 효능이 극히 제한적이다4,5. 강박장애와 자폐증에서 반복적인 행동의 발생 강도와 빈도는 이러한 상태를 가진 환자에서 대부분의 다른 정상적인 행동과 사회적 상호 작용을 대체할 만큼 충분히 커질 수 있습니다. 반복적인 행동을 특징으로 하는 정신 질환의 유병률과 쇠약해지는 특성에 비추어 볼 때, 그리고 그 원인에 대한 이해가 부족하고 치료 옵션이 제한적이라는 점을 고려할 때, 이러한 행동을 연구하기 위해 동물 모델을 사용하는 것이 더욱 시급합니다.

지난 30년 동안 강박장애와 자폐증에서 볼 수 있는 반복적인 행동에 대한 수많은 동물 모델이 개발되었으며 이러한 모델을 설명하는 수많은 우수한 리뷰가 발표되었습니다6-14. 일반적으로 이러한 확립된 모델은 유전적, 약리학적, 신경발달적, 행동적으로 분류될 수 있으며 대부분은 좋은 얼굴, 구성 및 예측 타당성을 보여줍니다6,7. 우리는 유전적으로 세로토닌이 고갈된 쥐의 반복적인 행동을 평가하기 위해 대리석 매몰과 둥지 파쇄의 두 가지 행동 모델을 사용했습니다15,16. 이러한 방법에는 많은 장점이 있으며, 그 중 하나는 사용 편의성, 행동 점수를 매길 수 있는 정확성, 설치류에서 이러한 행동의 자발적인 전시, 비정상적인 행동 표현형에 대한 유전자 변형 마우스의 고처리량 스크리닝에 사용하는 것입니다. 또한, 각 테스트는 피험자의 가정용 케이지에 사용된 것과 동일한 침구가 포함된 표준 및 친숙한 설치류 하우징 케이지에서 수행되어 마우스가 새로운 테스트 챔버에 습관화될 필요성을 최소화합니다. 음식 및/또는 물 제한은 마우스가 수행하도록 "동기"를 부여하기 위해 필요하지 않습니다. 대리석 파쇄 테스트는 자연 환경(예: 굴, 탈출 터널)과 표준 케이지 침구에서 땅을 파는 쥐의 성향을 활용하고, nestlet shred 테스트는 쥐가 환경 조건(예:소리, 빛, 온도). 비전문화되고 일반적으로 구할 수 있는 설치류 사육 재료를 사용하는 대리석 매장 및 둥지 파쇄 작업은 생쥐의 반복적이고 강박적인 행동에 대한 간단하고 강력한 행동 분석입니다.

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프로토콜

동물을 사용한 모든 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 프로토콜은 Wayne State University의 기관 관리 및 사용 위원회(허가 번호 A3310-01)의 승인을 받았습니다.

1. 대리석 매몰 및 Nestlet 파쇄를 위한 케이지 준비

  1. 대리석 매립 테스트를 위해 필터 상단 덮개가 장착된 표준 폴리카보네이트 쥐 케이지(26cm x 48cm x 20cm)를 사용하십시오. 각 케이지에 5cm 깊이로 신선하고 향이 없는 쥐 침구 재료를 추가하고 침구 표면에 동일한 크기의 다른 케이지를 삽입하여 침구 표면을 평평하게 만듭니다. 이것은 대리석 배치에 사용할 수 있는 침구 표면에 평행선의 템플릿을 인상화하는 추가 이점이 있습니다.
  2. 표준 유리 장난감 구슬(다양한 스타일 및 색상, 직경 15mm, 무게 5.2g)을 4개의 구슬로 구성된 5줄의 침구 표면에 부드럽게 놓습니다(그림 1A 참조). 중성 실험실 세제로 구슬을 씻고 증류수 탈이온수로 완전히 헹구고 매번 사용하기 전에 말리십시오.
  3. nestlet 파쇄 테스트를 위해 필터 상단 덮개가 장착된 표준 폴리카보네이트 쥐 케이지(19cm x 29cm x 13cm)를 사용하십시오. 각 케이지에 0.5cm 깊이까지 신선하고 향이 없는 쥐 침구 재료를 추가하고 침구 표면에 동일한 크기의 다른 케이지를 삽입하여 침구를 포장합니다.
  4. 분석 저울에서 시중에서 판매되는 면 섬유 nestlet(5cm x 5cm, 5mm 두께, 각각 ~2.5g)의 무게를 측정하고 각 테스트 케이지의 침구 위에 하나의 nestlet을 놓습니다(그림 3A 참조).
  5. 타이밍 세션 길이에 대한 중지 감시 또는 타이머를 설정합니다(각 테스트당 30분).

2. 실험 전 동물 취급

  1. 생쥐를 개별적으로 또는 그룹으로 12시간의 라이트/다크 주기가 있는 방에 수용합니다. 모든 쥐에게 음식과 물을 자유자재로 제공하십시오. 테스트하기 3-5일 전에 쥐를 부드럽게 다루십시오. 두 테스트 모두에 성별 중 하나의 마우스를 사용하십시오.
  2. 오전 9:00에서 오후 4:00 사이에 행동 테스트를 수행하고 테스트 시작 60분 전에 마우스가 포함된 모든 가정용 케이지를 테스트실로 운반합니다.

3. 대리석 매몰 테스트

  1. 구슬이 들어 있는 케이지 모서리에 마우스 한 마리를 놓고 가능한 한 구슬에서 멀리 떨어진 침구 위에 마우스를 조심스럽게 놓고 케이지에 필터 상단 덮개를 놓습니다. 테스트 중에는 음식과 물을 주지 마십시오. 마우스를 30분 동안 방해받지 않고 케이지에 그대로 두십시오.
  2. 실험 완료 후 마우스를 제거하고 가정용 케이지로 되돌려 놓고, 케이지에서 피험자를 제거하는 과정에서 구슬을 움직이거나 빼내지 않도록 각별히 주의합니다.
  3. 과제 채점자(2-3)는 묻힌 구슬의 수를 세기 위해 검사 중인 마우스의 치료 조건이나 유전자형을 못합니다. 대리석 표면적의 2/3가 침구로 덮여 있는 경우 대리석이 묻힌 것으로 점수를 매깁니다. 각 마우스에 대해 묻힌 구슬의 수에 대한 평균 점수입니다.
  4. 침구에서 구슬 20개를 모두 회수합니다. 침구는 처분하십시오.

4. Nestlet 파쇄 테스트

  1. 미리 계량된 단일 nestlet이 들어 있는 케이지에 마우스 한 마리를 넣고 케이지에 필터 상단 덮개를 놓습니다. 테스트 중에는 음식과 물을 주지 마십시오. 30분 동안 둥지가 있는 케이지에 마우스를 방해받지 않고 그대로 두십시오.
  2. 마우스를 제거하고 테스트 완료 후 홈 케이지로 돌아갑니다. 집게로 케이지에서 남아 있는 손상되지 않은 nestlet 재료를 제거하고 O/N을 건조시킵니다.
  3. 파쇄되지 않은 나머지 nestlet의 무게를 측정하고 이 무게를 시작 무게로 나누어 파쇄된 nestlet의 백분율을 계산합니다. 원하는 경우, 피험자 쥐가 생성한 둥지의 형태에 대해 5점 둥지 등급 척도17을 사용하여 점수를 매기되, 이 척도는 일반적으로 집착적인 파쇄가 아닌 둥지 건설에 점수를 매기기 위한 것임을 인식합니다.
  4. 남은 파쇄된 둥지 재료와 침구는 폐기합니다.

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결과

구슬 묻기 및 네슬렛 파쇄 테스트의 주요 장점은 각각이 테스트 완료 후 정량화할 수 있는 마우스의 자연스럽고 자발적인 행동에 의존한다는 점이며, 이를 통해 단일 연구자가 실험을 설정한 후 세션이 끝날 때까지 테스트실 밖에 머물 수 있다는 것입니다. 구슬 묻기 테스트의 핵심 요소는 테스트 후 케이지에서 피험체를 조심스럽게 제거하는 것입니다. 마우스는 일반적으로 포획을 피하려고 시도하며, 이 과정에서 부분적으로 묻혀 있던 구슬을 밀어내거나 옮길 수 있고, 테스트 세션 종료 시 묻히지 않았던 구슬을 부분적으로 묻을 수 있습니다. 그림 1A는 피험체를 넣기 직전의 테스트 케이지를 위에서 본 모습입니다. 저희는 (원하는 경우) 묻기 행동 외에도 구슬의 이동을 추적하기 위해 이와 같이 구슬을 정밀하게 정렬하는 방식을 선호합니다. 예시 실험에서, 저희는 야생형(WT) 마우스와 뇌 세로토닌(5HT) 생합성의 초기 및 속도 제한 효소인 tryptophan hydroxylase 2(TPH2) 유전자가 결핍된 마우스의...

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토론

대리석 묻기 및 새끼 파쇄 테스트는 생쥐의 반복적이고 강박적인 행동을 연구하기 위한 행동 방법의 좋은 예입니다. 두 테스트 모두 모델링6-11을 모델링하는 인간 장애에 대해 우수한 얼굴, 구조 및 예측 타당성을 보여줍니다. 이러한 반복적인 행동은 설치류에서 자연스럽고 자발적이며 그 빈도와 강도는 현재 표시된 것처럼 유전자 변형 후 또는 두부 손상 및 약물 치료 후에 달라질 수 있습니다. 이 두 가지 테스트의 가치는 반복적이고 원치 않는 행동의 표현을 포함하는 OCD 및 ASD와 같은 인간 정신 장애의 검증된 모델이라는 사실에서 비롯됩니다. 두 테스트 모두 TPH2 KO 마우스에서 알 수 있듯이 마우스의 파기, 매설 및 파쇄 행동 발현의 큰 변화에 강력하고 민감합니다.

기존 방법(예: 유전적, 약리학적, 신경발달 모델)과 관련하여 대리석 매몰 및 새끼 파쇄 테스트에는 많은 장점이 있습니다. 둘 다 정교하고 값비싼 장비 없이 대부분의 실험실에서 쉽...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 재향 군인회와 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유리 장난감 구슬로컬 장난감 매장N / A다양한 스타일, 색상, 투명 및 불투명
NestletsAncareNES3600
N10 시리즈 마우스 케이지AncareN10HT표준 설치류 케이지 와이어 상단
R20 시리즈 쥐 케이지AncareR20표준 설치류 케이지 와이어 상단
침대 오 콥스앤더슨8B표준 설치류 벌크 침구, 1/8인치

참고문헌

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  21. Hayashi, E., Kuratani, K., Kinoshita, M., Hara, H. Pharmacologically distinctive behaviors other than burying marbles during the marble burying test in mice. Pharmacology. 86, 293-296 (2010).

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