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방법 논문

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

10K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51017

⸱

2013년 10월 24일

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

이 논문에서

요약

복수의 가벼운 손상 프로토콜은 손상 광수를 설명하고 결과적으로 성인 zebrafish에있는 망막 재생 반응을 유도하고 있습니다. 이 프로토콜은 안료 동물에서 사용할 수있는 개선 된 방법을 설명하고 그로드하고 전체 망막에 걸쳐 콘 광수의 대부분을 손상.

초록

빛에 의한 망막 변성 (LIRD)는 일반적으로 설치류 피해로드와 콘 광수에 제브라 피쉬 모두에 사용됩니다. 성인 제브라 피쉬에서 시세포 변성 뮐러 아교 세포를 다시 입력 세포주기에 트리거 및 과도 증폭 조상을 생산하고 있습니다. 이 조상은 그들이 궁극적으로 새로운 광 수용체를 야기 손상된 영역에 마이그레이션으로 증식을 계속합니다. 현재, 두 널리 사용되는 LIRD 패러다임, 각각의 재생 반응 광수 손실 및 해당 차이의 정도를 변화 결과.가있다 더 많은 유전자와 약물 도구를 재생하는 동안 관심의 개별 유전자의 역할을 테스트 할 수있는만큼, 강력한 LIRD 패러다임을 개발할 필요가있다. 여기에서 우리는 LIRD 프로토콜을 설명하는 우리는 두 가지 이전에 설립 LIRD 기술의 사용을 결합했다하는로드와 콘 광수 모두의 광범위하고 일관된 손실됩니다. 게다가이 프로토콜은 LIRD 연구에 대한 흰둥이 배경에 관심 유전자 변형 라인을 유지하기 위해 필요가 없습니다 색소 동물에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다.

서론

빛에 의한 망막 변성 (LIRD)는 일반적으로 설치류 피해로드와 콘 광수에 제브라 피쉬 모두에 사용됩니다. 성인 제브라 피쉬에서 시세포 변성 뮐러 아교 세포를 다시 입력 세포주기에 트리거 및 과도 증폭 조상을 생산하고 있습니다. 이 조상은 그들이 궁극적으로 새로운 광 수용체를 야기 손상된 영역에 마이그레이션으로 증식을 계속합니다. 현재, 두 널리 사용되는 LIRD 패러다임, 각각의 재생 반응 광수 손실 및 해당 차이의 정도를 변화 결과.가있다 더 많은 유전자와 약물 도구를 재생하는 동안 관심의 개별 유전자의 역할을 테스트 할 수있는만큼, 강력한 LIRD 패러다임을 개발할 필요가있다. 여기에서 우리는 LIRD 프로토콜을 설명하는 우리는 두 가지 이전에 설립 LIRD 기술의 사용을 결합했다하는로드와 콘 광수 모두의 광범위하고 일관된 손실됩니다. 게다가이 프로토콜은 LIRD 연구에 대한 흰둥이 배경에 관심 유전자 변형 라인을 유지하기 위해 필요가 없습니다 색소 동물에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 의학의 웨인 주립 대학 대학원에서 동물 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 어두운 적응

  1. 전송 어두운 인클로저에 일반 주택 시스템에서 10 성인 흰둥이 나 색소 물고기를 ~. 가능한 경우, 탱크를 통해 정상적인 물 흐름을 허용 zebrafish의 주택 모듈에 내장되어 어두운 인클로저를 사용합니다. (이러한 시스템을 사용할 수없는 경우, 산소와 생선을 공기에 쐬다을 확인하고, 완전히 어두운 인클로저에 물고기 탱크를 배치).
  2. 10 일 동안 어둠 속에서 물고기를 유지합니다. 동물을 먹이거나 어두운 상자에 새로운 물고기를 추가 할 때, 빛의 긴 기간에 물고기를 노출 피하기 위해 가능한 한 빨리 이동해야합니다.

2. 자외선 노출

  1. UV 소스의 전원이 꺼져 있는지 확인합니다. 형광 입체 현미경에서 UV 빛의 필라멘트를 제거합니다.
    1. 반전을 사용UV 필라멘트를위한 대와 같은 15cm 직경의 유리 페트리 접시 (또는 유사한 2cm 높이의 것). 실험실 벤치 페트리 접시 테이프.
    2. 테이프 UV 라이트 필라멘트 반전 페트리 접시의 상단입니다. 정렬되도록 페트리 접시 필라멘트 돌출​​의 끝 ~ 2mm.
  2. 250 ML 유리 비커를 구합니다. 바닥의​​ ½, 측면, 다시 알루미늄 호일로 비커, 호일의 "반짝"면이 비커의 내부를 직면해야하는 커버. 비커를 졸업 한 경우, 노출 된 비커의 명확한 절반을 남겨 호일로 비이커의 말로 절반을 커버.
  3. 물고기 설비 시스템 물 100 ㎖와 250 비이커를 입력합니다.
  4. 4 L 비이커에 250 ML의 비커를 놓습니다. 수위도 250 ML의 비커 100 ML 물 줄 때까지 물 4 L 비이커를 입력합니다.
  5. 250 비이커에 10 어두운 치료 동물의 최대를 추가합니다. 알루미늄 작은 조각에 250 ML의 비커 커버호일.
  6. UV 필라멘트 바로 옆에 전체 비커 장치를 놓습니다. 필라멘트 4 L 비커의 외부를 만지고 250 비이커의 노출 부분을 직면해야한다. 250 비이커는 4 L 비커의 바닥 중앙에 있는지 확인합니다.
  7. 노출되는 동물을 허용하지만, UV 필라멘트의 끝을 보는 모든 실험실 인력을 방지 4L 비커 뒤에 큰, 불투명 한 화면에 배치합니다. 경고 :이 장벽 UV 소스에 전원을 켜기 전에 위치에 있는지 확인하십시오.
  8. UV 전원을 켭니다. 30 분 타이머를 설정합니다. 어떤 필요에 경고 라벨이 의심 실험실 직원이 실수로 UV 방사선에 자신을 노출하지 않도록 배치합니다.
  9. 30 분 후, UV 전원을 차단합니다. 물고기와 250 비이커를 제거합니다. 참고 : UV 노출의 여러 라운드가 필요한 경우, 노출 프로토콜을 반복하기 전에 (~ 20 분) 아래로 전원을 식히십시오. t를 교체해야합니다그는 각각의 노출 신선한 시스템 물 물 100ml. 4 L 비이커에 물을 교체 할 필요가 없습니다.

3. 할로겐 램프 빛 노출

  1. 1.8 L 명확한 아크릴 수조로 250 비이커에서 물고기를 전송합니다. 오버 플로우 표시로 탱크를 채우십시오.
  2. 할로겐 램프 빛 치료 영역을 설정합니다. 철물점에서 네 개의 250 W의 할로겐 유틸리티 램프를 얻습니다. 같은 방향에있는 두 개의 램프를 직면하고, 중앙에 떨어져 29cm를 정렬합니다. 비슷한 방식으로 다른 두 개의 램프를 정렬합니다.
    1. 그들은 램프의 두 세트 사이에 ~ 73cm를 떠나, 램프의 첫 번째 집합을 직면되도록 램프의 두 번째 세트를 놓습니다. 이 29 X 73cm의 직사각형 모양의 조명 치료 영역을 만듭니다.
  3. 철물점에서 작은 팬을 구하십시오. 그냥 가벼운 치료 영역의 외부 램프의 두 집합 사이의 등거리 팬을 놓습니다.
  4. 의 중앙에 물이 가득 두 개의 1.8 L 탱크를 배치램프의 두 집합 사이의 등거리 빛 치료 영역. 램프와 탱크의 외부 벽 사이의 거리 ~ 29cm이어야한다. 참고 : 하나의 1.8 L의 탱크에 10 물고기를 치료하는 경우에도이 배열을 사용합니다. 두 탱크는 적절한 범위 내에서 각 탱크의 물 온도를 유지하기 위해 필요합니다.
  5. 각 탱크에 산소 통풍 장치를 놓습니다.
  6. 팬에 가장 가까운 끝 부분에 1 ~ 2 센티미터 간격을두고 명확한 아크릴 뚜껑 각 탱크를 포함한다. 는이 틈새에 공기를 불어되도록 팬을 정렬합니다. 탱크 중 하나 또는 둘 모두에 온도계를 놓습니다.
  7. 빛, 팬 및 에어 레이터의 전원을 켭니다. 최대 4 일을위한 가벼운 치료를 유지합니다. 이 동물에 더 많은 스트레스 수질과 결과에 영향을 미치기 때문에 물고기, 빛 치료 기간 동안 공급 할 수 없습니다.
  8. 매일 온도와 수위를 모니터링합니다. 30-33의 온도를 유지 ° C. 필요한 경우, 팬 속도 및 / 또는 탱크와 리 사이의 거리를 조정ghts.
    1. 필요에 따라, 일반적으로 일상적인 시스템 물 각 탱크 떨어져 꼭대기.
    2. 항상 거의 100 %의 생존율을 유지하기 위해 건강한 성인 zebrafish의를 (연령 일반적으로 6-9개월)를 사용합니다. 물고기 탱크에서 시체로 발견되는 경우, 즉시 제거하고 전체 탱크에 물을 교체합니다.

4. 조직 컬렉션

  1. 할로겐 빛 치료의 발병 후 48 시간이 치료 영역에서 물고기를 제거합니다.
    1. 신선한 에탄올 포름 알데히드 정착액 (1 일부로 37 % 포름 알데히드, 9 부품 100 % 에탄올)을 준비합니다.
    2. 2 페녹시 에탄올 (0.4 ㎎ / L)의 마취제 과다 복용으로 제브라 피쉬를 안락사.
    3. 종이 타월로 안락사 제브라 피쉬를 전송합니다. 곡선 집게를 사용하여 눈을 명백히.
    4. 4 ° C.에 정착하고 저장 O / N에 탈핵의 눈을 배치
  2. 눈을 Cryoprotect.
    1. 실온에서 30 분 동안 5 % 자당 1X PBS에 눈을 씻고, 다음으로 대체2 시간 동안 신선한 5 % 자당 1X PBS. 다음, 4 ℃에서 30 % 자당 1X PBS O / N에 눈을 씻어 4 ° C.에서 조직의 냉동 중간 30 % 자당 1X PBS O / N의 1:1 (등분)로 눈을 씻어
  3. -80에서 100 % 조직 동결 중간 저장소에 눈을 포함 ° C. 동양의 눈 있도록 조직의 cryosectioning 것은 지느러미 / 복부 축에서 수행됩니다.
  4. 유리 슬라이드에 동결 절단 (Cryosections) 조직과 장소. 55 ℃에서 2 시간 동안 따뜻한 슬라이드 -80 매장 슬라이드 ° C 또는 즉시 표준 면역을 수행합니다.
  5. 형광 현미경 40,51와 단면 조직 및 이미지의 표준 면역을 수행합니다.

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결과

지금까지 설명한 가벼운 치료 프로토콜은 LIRD의 각 방법을 비교 하​​였다. 어두운 처리 성인 흰둥이 동물 (그림 3-5)에서 개별 가벼운 치료는 크게로드의 손실 (그림 3)와 콘 (그림 4) 광수습니다. 그러나 두 개별 치료는 주로 비교적 가벼운 치료 (그림 3과 4)에서 보호 복부 망막을 떠나, 망막 등의 반 광수 손상. 또한, 할로겐 라이트 치료에 비해 자외선 치료는 망막의 지느러미 절반 (각각 C와 4B 그림을 비교) 더 콘 광수를 손상. 주로 N을 제거, 망막에 걸쳐로드와 콘 광수 모두에게 상당히 큰 손실을 초래 UV 할로겐 빛 치료를 결합망막의 복부 반 (그림 3과 4)의 europrotection. 결합 된 가벼운 치료 프로토콜을 사용했을 때 각각의 LIRD 방법과 비교하여, 확산에 상응하는 증가는 복부 망막에서 관찰...

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토론

여기에서 우리는 광범위한 광수 손실과 강력한 재생 반응의 지속적인 밝은 빛에 노출 결과로 짧은 UV 노출을 결합하는 것을 보여줍니다. 개인 LIRD 방법에 비해이 결합 된 방법은 또한 망막의 두 반쪽 막대와 원뿔 모두에 손상을 입힐 수있는 가장 효과적인 프로토콜입니다. 중요한 것은,이 치료는 색소 동물뿐만 아니라 흰둥이 동물 효과적입니다.

우리는 더 광범위하고 일관된 손상 결합 된 프로토콜 결과는 개별 LIRD 방법에 비해 증거를 제공하지만, 과학적 고려 LIRD 패러다임을 선택하기 전에 논의해야합니다. 우리의 데이터는 전체 망막 조직이 (즉, 단백질 체학, 실시간 PCR) 분석을 위해 수집 될 때 결합 방법을 이용해야하는 것이 좋습니다. 우리는 결합 방법은 할로겐 노출 뒤에 큰 병변의 크기, 그리고 마지막으로 UV 노출이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리는 제안차동 막대와 원뿔 재생에 영향을 미칠 수있는 유전자 또는 경로를 조사 할 때...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

저자는 훌륭한 물고기 사육 및 기술 지원 시샤 루오에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 R21EY019401 (RT)와 P30EY04068 (RT)의 국립 연구소에 의해 자금 지원, 그리고 웨인 주립 대학 안과학 교실에 실명을 방지하는 연구에서 제한 교부금 등, RT에 기금을 시작했습니다. JT는 웨인 주립 대학 대학원에서 제공하는 토마스 C. 럼블 원정대에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
UV 광원LeicaEL600
유리 페트리 접시 (150 x 20mm)Sigma-Aldrich/PyrexCLS3160152BO
250ml 유리 비커Sigma-Aldrich/PyrexCLS1000250
4L 유리 비커Sigma-Aldrich/PyrexCLS10004L
알루미늄 호일Fisher01-213-105
250W 할로겐 램프Workforce265-669
1.8 L 투명 아크릴 탱크AquaneeringZT180T
1.8 L 투명 아크릴 탱크 뚜껑AquaneeringZT180LCL
팬HoneywellHT-900
통풍기Tetra77853-900
온도계Cole-ParmerYO-08008-58
구부러짐 겸자(5/45)World Precision Instruments504155

참고문헌

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