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방법 논문

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

10.8K 조회수

DOI:

10.3791/51195

2014년 8월 21일

이 논문에서

요약

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

초록

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 발견 이후, 고유의 정체성과 중간 엽 줄기 세포의 현지화는 문화에서의 회고전 분리에 의해 가려하고있다. 최근, 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여, 다른 연구자들은 전향 인간 골격근의 혈관과 연관된 다 능성 전구 세포의 세 부분 집단을 식별 및 정제. 이러한 세 가지 세포 집단 : 내막, 미디어 및 외막 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈관 주위 세포 (PCS), 및 외막 세포 ACS (은), 혈관의 세 층의 구조로 각각 지역화. 이러한 인간의 혈관 유래 줄기 세포 (hBVSC)의 모든 고전 MSC 마커를 표현뿐만 아니라 일반적인 중간 엽 줄기 세포와 유사한 중배엽 발달 잠재력을 가지고 인구뿐만 아닙니다. 이전 MEC를, PC 및 AC를 별개의 프로토콜을 통해 고립되었고, 이후 별도의 연구를 특징으로한다. 현재 격리 제자ocol, 선택적 세포 표면 마커의 분리 과정에 대한 수정 및 조정을 통해, 우리가 동시에 하나의 인간의 근육 조직 검사에서 FACS 모든 세 hBVSC의 소집단을 정화 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 여러 BVSC의 부분 집단의 분리를 간소화뿐만 아니라 별개의 치료 목적을위한 hBVSCs 미래의 임상 적용을 촉진하지 않습니다.

서론

인간의 골격 근육 줄기 / 전구 세포의 임상 매력적인 소스로 간주되고있다. 골격근은 위성 세포 및 근육 유래 줄기 세포 (MDSCs) 전구 세포를 포함한 근육 조직, 골격 근육 모세포뿐만 아니라 원시 근원 성 줄기 세포를 포함 커밋되지. 재생 의료에 인간 근육 유래 줄기 / 전구 세포,자가 또는 동종의 사용은 광범위 전임상 동물 실험 및 임상 시험에서 연구되어왔다. 근육 줄기 / 전구 세포의 재생 응용 프로그램은 심장 마비 환자의 손상된 심장을 수리에 뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD) 환자에서 이영 근육을 재생 이르기까지 다양합니다.

골수 유래 다 능성 성인 전구 세포 (MAPCs) 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs), 성체 줄기 /를 포함한 중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포) 및 기타 능성 전구 세포 인구의 발견 이후전구 세포는 1-9 일에 광범위하게 연구되었다. 그럼에도 불구하고, 현장에서 그 나라의 정체성과 현지화는 회고 분리 방법에 의해 가려하고있다. 최근 정렬 형광 활성화 세포 (FACS)를 사용하여, 다른 그룹이 전향 식별 한 혈액 인간 골격근 내의 혈관 및 기타 여러 기관에서 정제 된 세 능성 전구 세포 집단 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈....

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프로토콜

1 근육 생검 처리

  1. 둘 베코 변형 이글 중 5 % 소 태아 혈청 (FBS)과 보충 된 (DMEM)에서 얼음에 인간 골격근 생검 보존 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 운송시 (P / S).
  2. 근육 조직 검사를받은 후, 운송 컨테이너에서 시편을 제거하고 멸균 조건에서 2 %의 항생제 항진균제 용액 (A / A)로 보충 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 두 번 씻는다.
  3. 2 % A / 보충 DMEM에서 멸균 가위와 집게로 첨부 된 지방과 결합 조직을 제거합니다.
  4. 해부 현미경으로 큰 혈관을 제거하고 이후 작은 ​​조각 (크기 <1cm 2)로 근육 표본을 잘라.
  5. 20 ml의 보존액으로 잘라 근육 편 (<5g) 유지 (PM을, DMEM은 10 % FBS 및 1 % P / S가 보충)까지 5 일 동안 4 ℃에서.

2 근육 Dissociat이온 전지 분리

  1. 세포 격리 당일 PM에서 근육 편을 제거하고 PBS로 두 번 씻어 2 % P / S가 보충. 소화 솔루션을 만들려면, 유형 I, 유형 II 및 유형-IV의 콜라게나 갓 오후에 (100 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
  2. 잘게 썰어 용액 더 응고와 10....

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결과

FACS 파라미터는 제 흠 제어, 음성 대조군 및 단일 컬러 양성 대조군으로부터 얻은 데이터에 기초하여 보정된다. 사균의 배제 후, 형광 표지 된 세포 현탁액은 음성 및 양성 세포 표면 마커의 시리즈 선택 받는다. 첫째, CD45 + 세포는 CD56 + 및 CD56 전에 게이트 아르 - 세포는 CD45에서 분리 - 분수. CD56 + 분획 더 CD34-CD144 선택으로 실시되는 경우에만 CD34 + / CD144 + (이중 양성) 세포 MEC를로 표시됩니다 (CD34 + / 56 + / 144 + / - 45) 그 후 수집 (그림 1). 마찬가지로, CD56 - 분수가 더 CD34-CD146 선택을받는 곳에서만 CD34 - / CD146

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토론

hBVSC의 소집단의 식별 및 정제는 MSC의 개체 발생의 이해에 큰 사전을 나타냅니다. 중간 엽 줄기 세포의 혈관 주위 기원 조직 특이 전구 세포 및 혈관 22-25 사이의 연관을 나타내는 증거가 증가하고있다. 또한, 용량은 상기 MSC 얼룩이 및 혈관 세포 생물학 (26)의 이해를 돕는다 hBVSCs 균질 부분 집단을 분리한다.

지난 몇 년 동안, MEC를, PC 및 AC를 개별적으로 확인 된 별도의 연구에서 서로 다른 프로토콜을 통해입니다. 그러나 시도는 조직 해리 절차와 완전히 MEC를, PC 및 AC를 식별 선택적 세포 계통 마커의 조합을 최적화하기 때문에 어려움 인간 골격근 동시에 세 hBVSC 서브 세트를 정화 이루어지지 않았다. 여기에서 우리는 동시 purif을 할 수있는 새로운 세포 격리 프로토콜을 설명(도 1) 티슈 해리 과정을 수정하고 선택적 세포 표면 마커의 새로운 조합을인가함으로써 하.......

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공개 사항

J.H.는 위 연구가 수행된 기간 동안 컨설팅 서비스 및 기술 라이선스에서 받은 로열티에 대해 Cook MyoSite, Inc.로부터 보수를 받았습니다. 다른 모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 유동 세포 계측법을 가진 그녀의 뛰어난 기술 지원을 앨리슨 마을 영웅을 감사드립니다. 이 작품은 국방부 (JH), 헨리 J. 맨킨 기부 의자 (JH), 교육 및 카자흐스탄 공화국의 과학 교육부 (AS)에서 보조금에 의해 지원되었다. CWC는 미국 심장 협회 (American Heart Association) predoctoral 교제 (11PRE7490001)에 의해 부분적으로 지원되었다. M.Corselli는 재생 의학 교육 교부금의 캘리포니아 공과 대학 (TG2-01169)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 유형 1SigmaC5894멸균 바이알
콜라겐 분해 효소 유형 2SigmaC1764멸균 바이알
콜라겐 분해 효소 유형 4SigmaC1889멸균 바이알
Anti-human CD34 APCBD Pharmingen555824멸균 유지
Anti-human CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833멸균 유지
반인간 CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747멸균 유지
Anti-human CD144 PEBeckman CoulterA07481멸균 유지
Anti-human CD146 FITCAbD SerotecMCA2141F멸균 유지
FACS Aria II 유세포 분석기Becton-Dickinson
EGM-2 complete mediumLonzaCC-3162PC 배양용(P0만 해당)
DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민 함유, 피루브산 나트륨 없음Invitrogen11965PC 배양용
DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민, 피루브산 나트륨포함 Invitrogen11995MEC 및 AC 배양용
소 태아 혈청Invitrogen10437-028
열 비활성화 말 혈청Invitrogen26050-088
페니실린/스트렙토마이신인비트로젠15140-122
항생제-항진균제 (100X)인비트로젠15240-062
트립신-EDTA 0.5% (10X)인비트로겐15400-054
둘베코' 칼슘과 마그네슘이 없는 PBSInvitrogen14190-250
병아리 배아 추출물정확한 화학CE650T-10사용 전 필터

참고문헌

  1. Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
  2. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat C....

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재인쇄 및 허가

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