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방법 논문

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

10.9K 조회수

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DOI:

10.3791/51195

⸱

2014년 8월 21일

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1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

이 논문에서

요약

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

초록

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 발견 이후, 고유의 정체성과 중간 엽 줄기 세포의 현지화는 문화에서의 회고전 분리에 의해 가려하고있다. 최근, 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여, 다른 연구자들은 전향 인간 골격근의 혈관과 연관된 다 능성 전구 세포의 세 부분 집단을 식별 및 정제. 이러한 세 가지 세포 집단 : 내막, 미디어 및 외막 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈관 주위 세포 (PCS), 및 외막 세포 ACS (은), 혈관의 세 층의 구조로 각각 지역화. 이러한 인간의 혈관 유래 줄기 세포 (hBVSC)의 모든 고전 MSC 마커를 표현뿐만 아니라 일반적인 중간 엽 줄기 세포와 유사한 중배엽 발달 잠재력을 가지고 인구뿐만 아닙니다. 이전 MEC를, PC 및 AC를 별개의 프로토콜을 통해 고립되었고, 이후 별도의 연구를 특징으로한다. 현재 격리 제자ocol, 선택적 세포 표면 마커의 분리 과정에 대한 수정 및 조정을 통해, 우리가 동시에 하나의 인간의 근육 조직 검사에서 FACS 모든 세 hBVSC의 소집단을 정화 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 여러 BVSC의 부분 집단의 분리를 간소화뿐만 아니라 별개의 치료 목적을위한 hBVSCs 미래의 임상 적용을 촉진하지 않습니다.

서론

인간의 골격 근육 줄기 / 전구 세포의 임상 매력적인 소스로 간주되고있다. 골격근은 위성 세포 및 근육 유래 줄기 세포 (MDSCs) 한 전구 세포를 포함한 근육 조직, 골격 근육 모세포뿐만 아니라 원시 근원 성 줄기 세포를 포함 커밋되지. 재생 의료에 인간 근육 유래 줄기 / 전구 세포,자가 또는 동종의 사용은 광범위 전임상 동물 실험 및 임상 시험에서 연구되어왔다. 근육 줄기 / 전구 세포의 재생 응용 프로그램은 심장 마비 환자의 손상된 심장을 수리에 뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD) 환자에서 이영 근육을 재생 이르기까지 다양합니다.

골수 유래 다 능성 성인 전구 세포 (MAPCs) 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs), 성체 줄기 /를 포함한 중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포) 및 기타 능성 전구 세포 인구의 발견 이후전구 세포는 1-9 일에 광범위하게 연구되었다. 그럼에도 불구하고, 현장에서 그 나라의 정체성과 현지화는 회고 분리 방법에 의해 가려하고있다. 최근 정렬 형광 활성화 세포 (FACS)를 사용하여, 다른 그룹이 전향 식별 한 혈액 인간 골격근 내의 혈관 및 기타 여러 기관에서 정제 된 세 능성 전구 세포 집단 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈관 주위 세포 (PCS), 그리고 외막 세포 ACS () 10. 내막, 중막 및 외막 외막 : 인간 혈관 유래 줄기 세포 (hBVSCs)이 세 부분 집단은 각각 혈관의 세 층의 구조에서 찾아 볼 수있다. ACS에 큰 동맥과 정맥의 외막 층 지역화하는 동안보다 구체적으로는, MEC를하고 PC는 미세 혈관과 모세 혈관에 감지됩니다. (C를 MEC를 각 전구 세포의 서브 세트는 세포 표면 항원의 고유 한 조합을 나타내고D34 + / 56 + / 144 + / 45 -)의 PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) 및 AC를 (CD34 + / - 31 / 45 - / 56 - / 146 -).

이 hBVSC 부분 집합의 또 다른 특성은 세 개의 전구 세포의 인구가 골격 근육 생성, 골 형성, 연골 및 지방 생성을 포함하여 일반적인 중간 엽 줄기 세포와 유사한 중배엽 발달 잠재력을 가지고 것으로 나타났습니다. 모든 hBVSC 서브 세트는 CD44, CD73, CD90 및 CD105, 갓와 문화를 포함하여 고전 MSC 마커를 나타낸다. 집합 적 증거의이 조각은 중간 엽 줄기 세포의 혈관 기원을 지원했다. 또한, MEC를, PC 및 ACS에의 치료 용량은 최근 별도의 연구에서 입증되었다. 성인의 근육 조직 검사에서 분류 MEC를가 부상과 이영 골격근 및 수리 부상 심근보다 효율적으로보다 골격 근육 아세포 및 혈관의 엔도를 다시 생성 나타났다상피 세포 (내피). 다른 사람의 장기에서 정제 PC는 또한 / 수리 부상과 이영 골격 근육을 재생하고 위성 세포 풀 13-16에 기여하는 것으로 나타났다. 아주 최근에, 우리는 인간의 골격 근육에서 파생 된 PC를 효율적으로 간접 주변 분비 효과와 직접적인 세포 상호 작용 (17)를 통해 경색 심근를 복구하는 것을 증명하고있다. ACS에, 다른 한편으로는, 하나왔다 직접 외식 혈관으로부터 분리 또는 인간 지방 조직 및 골격근 FACS에 의해 정제 하였다. ACS에의 주목할만한 프로 혈관 신생 효과는 마우스 뒷다리 - 사지 허혈 모델 19에서 입증되었다. 또한, AC를 또한 허혈성 조직 복구 (20)의 ACS 강력한 치료 가능성을 나타내는, 종래보다 효율적으로 중간 엽 줄기 세포보다 심근 경색을 복구하는 것으로 나타났다.

동시에 현재의 정화 프로토콜 보조금, MEC를, PC에 미래의 정화 및하나의 인간의 골격 근육 조직 검사의 혈관에서 AC들. 이것은 우리가 연구 및 / 또는 별개의 치료 목적을위한 최적의 hBVSC의 하위 집단을 선택할 수 있습니다. 또한,이 새로운 기술은 더 나아가 재생 의료를위한 다 능성 전구 세포의 이상적인 소스 만드는 인간 골격근으로부터 유도 될 수 줄기 / 선조 세포의 레퍼토리를 확장한다.

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프로토콜

1 근육 생검 처리

  1. 둘 베코 변형 이글 중 5 % 소 태아 혈청 (FBS)과 보충 된 (DMEM)에서 얼음에 인간 골격근 생검 보존 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 운송시 (P / S).
  2. 근육 조직 검사를받은 후, 운송 컨테이너에서 시편을 제거하고 멸균 조건에서 2 %의 항생제 항진균제 용액 (A / A)로 보충 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 두 번 씻는다.
  3. 2 % A / 보충 DMEM에서 멸균 가위와 집게로 첨부 된 지방과 결합 조직을 제거합니다.
  4. 해부 현미경으로 큰 혈관을 제거하고 이후 작은 ​​조각 (크기 <1cm 2)로 근육 표본을 잘라.
  5. 20 ml의 보존액으로 잘라 근육 편 (<5g) 유지 (PM을, DMEM은 10 % FBS 및 1 % P / S가 보충)까지 5 일 동안 4 ℃에서.

2 근육 Dissociat이온 전지 분리

  1. 세포 격리 당일 PM에서 근육 편을 제거하고 PBS로 두 번 씻어 2 % P / S가 보충. 소화 솔루션을 만들려면, 유형 I, 유형 II 및 유형-IV의 콜라게나 갓 오후에 (100 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
  2. 잘게 썰어 용액 더 응고와 10 ㎖ 피펫을 통과 혈청까지 기계적 PM 소량의 페트리 접시에 멸균 가위 집게 근육 편 말하다. 이 과정에서 잔류 지방과 결합 조직을 제거합니다. 성인 근육의 이상 8-10그램 각 세포 분리를위한 태아 근육의 2g을 사용합니다.
  3. 20 ㎖ (또는 10 ㎖의에 다진 태아 근육의 2g) 10 ㎖의 혈청 학적 피펫 소화 솔루션 적힌에 다진 성인 근육의 4~5그램을 전송합니다. 80 RPM - 70 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 - 50 다이제스트. 따라서 양에 따라 소화 시간 및 / 또는 교반 속도를 조정함으로써 세포 수율 및 표면 항원 보존 최적화조직. 탁도가 거의 빠져 나올 때까지 소화 상태마다 15 ~ 20 분을 준수하십시오.
  4. 적극적으로 소화 조직에게 10 ㎖의 혈청 학적 피펫 3-5 시간을 피펫. 반응을 정지 한 후 4 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 PM의 동일한 금액을 추가합니다.
  5. 조심스럽게 뜨는을 제거; 워시 10 ㎖의 PM으로 펠렛을 재현 탁하고 100 μm의 세포 여과기를 통해 여과 하였다.
  6. 4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 제거합니다. 적혈구 용해 완충액 (155 mM의 NH 4 염소, 10mM을 KHCO 3 0,1mM EDTA)는, 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 한 후 RT에서 10 분 동안 배양에서 재현 탁 펠렛. 침전이 관찰되는 경우 다시 70 m 셀 스트레이너를 통해 필터.
  7. 4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 및 0.5 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포의 수를 계산. 셀 정렬에 대해 최소한 5,000,000 세포의 총을 얻습니다. 자장을 희석염색 용 PBS​​와 ML 미만 5,000,000 세포 전자 세포 현탁액. 제어의 염색에 대한 11 튜브 (흠 제어, 음성 제어, 단일 색상 양성 대조군)에 세포 현탁액 및 분할의 50 ~ 100 μl를 꺼냅니다.

3 셀 라벨 및 정렬

  1. 필요한 경우 목적을 블로킹 (PBS에서 1:10 희석) 마우스 혈청에서 4 ℃에서 10 분 동안 단일 세포 현탁액을 배양한다.
  2. 단일 세포 현탁액에 (100 모두 1) 및 4 ℃에서 20 분 동안 품어 CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE 및 CD146-FITC를 추가합니다. 음성 대조군의 경우, APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE- 및 FITC - 복합 이소 타입의 IgG 항체의 등가 농도를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다. 단일 색상 양성 대조군의 경우, 개별적으로 각각의 튜브에 CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE 및 CD146-FITC의 등가 농도를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
  3. 배양 후4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 세척한다. 5 % FBS 및 1 % P / S가 보충 된 DMEM ml의 2 - (1)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액의 최종 농도는 ml의 미만 5,000,000 셀이어야한다. 7-AAD (1 : 100)을 추가하고 죽은 세포 제외 실온에서 15 분 동안 배양한다. 음성 대조군 및 단일 컬러 양성 대조군, 5 % FBS 및 1 % P / S가 보충 0.5 ml의 DMEM에 재현 탁 된 세포 펠릿.
  4. 튜브 세포 계측법 둥근 바닥 폴리스티렌 흐름에 모든 세포 현탁액을 전송합니다. (각 튜브 프리 필드입니다 적절한 배지 500 μL로 : MEC를 위해 MPM, EGM-2를 PC 용, AC를위한 AC 매체) 세포 수집 튜브를 준비합니다. 셀 소터에 얼음에 전송 세포 현탁액.
  5. 흠 제어, 음성 대조군, 단일 컬러 양성 대조군, 및 주요 세포 현탁액의 순서로 셀 소터에 실행 세포 현탁액 셀 (P)을 최대화하기 위해 엄격 게이팅 레이저 강도, 채널 보상 및 세포 집단을 조정하면서urity는 (조브 및 흐름의 자세한 내용은 다른 저널 세포 계측법에 의해 발표 된 논문을 참조하시기 바랍니다).
  6. 적절한 수집 튜브에서 원하는 세포 인구를 수집합니다. 4 ℃에서 보관 수집 된 세포는 즉시 파종하지 않을 경우.

(4) 세포 배양을 후 정렬

  1. 사전 코팅 된 플레이트에 MPM의 <10,000 세포 / cm 2에서 갓 분류 MEC를 (P0)을 시드 타입 I 콜라겐. MEC를 이후의 계대를 들어, 3500 씨앗 - 사전 코팅 플레이트 / 플라스크에 MPM에 4,000 세포 / cm 2 타입 I 콜라겐.
  2. 갓 0.2 % 젤라틴으로 코팅 된 플레이트 상 EGM-2 <20,000 세포 / cm 2에서 갓 정렬 개 세트 (P0)를 시드. PC 배지에서 3까지 일정한 비율 P2 폴리스티렌 배양 플레이트 상에 (20 % FBS 및 1 % P / S가 보충 DMEM) : PC 중 후속 계대를 들어, 1에서 셀을 분할. P3에서 이후, 씨앗 세포 6500에서 - 일반 폴리스티렌 배양 플레이트 / 플라스크 상에 PC 매체에서 7,000 세포 / cm 2.
  3. 일반적인 폴리스티렌 배양 접시 상에 (20 % FBS, 1 % P / S가 보충 DMEM) 배지에서 AC <20,000 세포 / cm 2로 갓 정렬 AC들 (P0)을 시드. 일반 폴리스티렌 배양 플레이트 / 플라스크 상 AC 매체에서 7,000 세포 / cm 2 - 6500에서 이후의 ACS 계대, 씨앗 세포하십시오.

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결과

FACS 파라미터는 제 흠 제어, 음성 대조군 및 단일 컬러 양성 대조군으로부터 얻은 데이터에 기초하여 보정된다. 사균의 배제 후, 형광 표지 된 세포 현탁액은 음성 및 양성 세포 표면 마커의 시리즈 선택 받는다. 첫째, CD45 + 세포는 CD56 + 및 CD56 전에 게이트 아르 - 세포는 CD45에서 분리 - 분수. CD56 + 분획 더 CD34-CD144 선택으로 실시되는 경우에만 CD34 + / CD144 + (이중 양성) 세포 MEC를로 표시됩니다 (CD34 + / 56 + / 144 + / - 45) 그 후 수집 (그림 1). 마찬가지로, CD56 - 분수가 더 CD34-CD146 선택을받는 곳에서만 CD34 - / CD146

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토론

hBVSC의 소집단의 식별 및 정제는 MSC의 개체 발생의 이해에 큰 사전을 나타냅니다. 중간 엽 줄기 세포의 혈관 주위 기원 조직 특이 전구 세포 및 혈관 22-25 사이의 연관을 나타내는 증거가 증가하고있다. 또한, 용량은 상기 MSC 얼룩이 및 혈관 세포 생물학 (26)의 이해를 돕는다 hBVSCs 균질 부분 집단을 분리한다.

지난 몇 년 동안, MEC를, PC 및 AC를 개별적으로 확인 된 별도의 연구에서 서로 다른 프로토콜을 통해입니다. 그러나 시도는 조직 해리 절차와 완전히 MEC를, PC 및 AC를 식별 선택적 세포 계통 마커의 조합을 최적화하기 때문에 어려움 인간 골격근 동시에 세 hBVSC 서브 세트를 정화 이루어지지 않았다. 여기에서 우리는 동시 purif을 할 수있는 새로운 세포 격리 프로토콜을 설명(도 1) 티슈 해리 과정을 수정하고 선택적 세포 표면 마커의 새로운 조합을인가함으로써 하...

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공개 사항

J.H.는 위 연구가 수행된 기간 동안 컨설팅 서비스 및 기술 라이선스에서 받은 로열티에 대해 Cook MyoSite, Inc.로부터 보수를 받았습니다. 다른 모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 유동 세포 계측법을 가진 그녀의 뛰어난 기술 지원을 앨리슨 마을 영웅을 감사드립니다. 이 작품은 국방부 (JH), 헨리 J. 맨킨 기부 의자 (JH), 교육 및 카자흐스탄 공화국의 과학 교육부 (AS)에서 보조금에 의해 지원되었다. CWC는 미국 심장 협회 (American Heart Association) predoctoral 교제 (11PRE7490001)에 의해 부분적으로 지원되었다. M.Corselli는 재생 의학 교육 교부금의 캘리포니아 공과 대학 (TG2-01169)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 유형 1SigmaC5894멸균 바이알
콜라겐 분해 효소 유형 2SigmaC1764멸균 바이알
콜라겐 분해 효소 유형 4SigmaC1889멸균 바이알
Anti-human CD34 APCBD Pharmingen555824멸균 유지
Anti-human CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833멸균 유지
반인간 CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747멸균 유지
Anti-human CD144 PEBeckman CoulterA07481멸균 유지
Anti-human CD146 FITCAbD SerotecMCA2141F멸균 유지
FACS Aria II 유세포 분석기Becton-Dickinson
EGM-2 complete mediumLonzaCC-3162PC 배양용(P0만 해당)
DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민 함유, 피루브산 나트륨 없음Invitrogen11965PC 배양용
DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민, 피루브산 나트륨포함 Invitrogen11995MEC 및 AC 배양용
소 태아 혈청Invitrogen10437-028
열 비활성화 말 혈청Invitrogen26050-088
페니실린/스트렙토마이신인비트로젠15140-122
항생제-항진균제 (100X)인비트로젠15240-062
트립신-EDTA 0.5% (10X)인비트로겐15400-054
둘베코' 칼슘과 마그네슘이 없는 PBSInvitrogen14190-250
병아리 배아 추출물정확한 화학CE650T-10사용 전 필터

참고문헌

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