방법 논문

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

DOI:

10.3791/51215

⸱

2014년 6월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1The BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Medical School, 3Shriners Burns Hospital, 4Harvard University School of Engineering and Applied Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

초록

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호중구가 혈액 감염과 그들의 숫자에 대한 보호에 필수적인 역할을 자주 병원에서 측정됩니다. 낮은 호중구 카운트 감염에 대한 높은 위험에 대한 경고 표시하는 동안 혈액에있는 높은 호중구의 수는 일반적으로 지속적인 감염의 지표입니다. 자신의 기능을 수행하기 위해, 호중구는 감염이 발생 조직으로, 그들의 생활의 대부분을 보내는 혈액에서 효율적으로 움직일 수있다. 따라서, 마이그레이션하는 호중구의 기능에 결함이 호중구가 혈액에 해당 번호에 존재하는 경우에도, 감염에 대한 위험을 증가시킬 수있다. 그러나, 병원에서 호중구의 이동 능력을 측정하는 것은, 시간이 소요되는 어려운 작업이며 많은 혈액의 양 및 전문 지식이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 circum, 처리되지 않은 혈액 한 방울을 요구하는 호중구의 이동에 대한 강력한 마이크로 유체 분석 설계호중구의 분리의 필요성을 통풍구 및 간단한 현미경 정량화하기 쉽다. 이 분석에서, 호중구 화학 주성의 소스를 향해 작은 경로를 통하여 혈액 방울에서 직접 이동한다. 같은 채널을 통해 적혈구의 세부적인 흐름을 방지하기 위해, 우리는 선택적으로 적혈구의 진행을 차단하는 것이집니다 직각으로 기계적인 필터를 구현했습니다. 우리는 손가락 찌르기와 정맥 혈액에서 수집 된 혈액 방울에서 호중구의 이동을 비교하여 분석을 확인. 우리는 또한 정제 된 호중구의 샘플에서 호중구의 마이그레이션이 전혈 (WB) 소스를 비교 세 가지 소스에 일관된 속도와 방향성을 발견했다. 이 미세 유체 플랫폼은 건강과 질병에서 호중구의 기능에 대한 우리의 이해를 발전에 도움이되는 병원과 연구 환경에서 인간의 호중구 이주의 연구를 가능하게 할 것이다.

서론

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호중구의 인신 매매는 죽상 경화증 1, 세균 감염이나 패혈증 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환의 진행과 해상도를 결정하는 중요한 역할을하고, 부상 3을 구울 수 있습니다. 건강과 질병 상태에 대한 그들의 큰 기여를 들어, 호중구는 종종 임상과 연구 실험실에서 고려 된 표준 혈액 분석의 일부입니다. 그러나, 대부분의 유비쿼터스 테스트 중 하나, 감염과 패혈증의 진단에 호중구의 가치에도 불구하고 자주 4 의문을 제기하고있다. 예를 들어, 화상 환자의 호중구의 한 연구는 호중구 수와 호중구 마이그레이션 기능은 상관 관계가없는 것으로 나타났습니다; 그 호중구 혼자 계산 의미하는 것은 면역 상태 3의 정확한 표시되지 않습니다. 측정하기 더 어렵게되지만, 호중구 기능적 능력 조건의 넓은 범위에서보다 가치로서 제안되었다.

t는 "> 중요한 것은, 호중구 결함의 대부분은 일시적이며 영구적 인 유전 적 결함, 대부분 최근까지 병원에서 간과 된 차이에 의해 실행되지 않습니다. 화상 부상의 맥락에서, 호중구 이주의 과정을 모니터링 할 수 염증 상태 또는 감염 3의 지표로서 환자의 치료는 혈액의 대용량을 필요로하기 때문이다. 현재 실험실 (보이 덴 챔버 던 챔버, 마이크로....

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프로토콜

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1. 미세 유체 디바이스 제조

  1. 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여, 클래스 1000 청정실 마스터 몰드 웨이퍼를 제조. 본 제조자의 지시에 따른 이동 채널을 정의하는 제 3 μm의 얇은 에폭시 계 네거티브 포토 레지스트 층. 패턴 셀 로딩 및 케모카인 챔버를 정의하는 두 번째 50 μm의 두꺼운 층.
  2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치를 캐스팅 패턴 웨이퍼를 사용합니다. 적극적 큰 플라스틱 무게 트레이에 플라스틱 포크를 사용하여 5 분 동안 개시 (2g)와 PDMS (19 g)을 혼합.
  3. 조심스럽게 금형에 PDMS를 붓는다.
  4. 1 시간 동안 진공 데시 케이 부어 PDMS와 금형을 배치하여 PDMS를 탈기.
  5. 빵을 65 ° C로 설정 오븐에서 적어도 3 시간 동안 PDMS 마이크로 유체 장치 치료
  6. 1.5 mm의 선단 직경 펀칭기를 사용하여 중앙 WBLCs 펀치 아웃.
  7. punc를 사용하여 전체 도넛 모양의 장치를 펀치5.0 mm의 팁 직경을 가진 그녀.
  8. 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다.
  9. 탈 물과 질소로 다음 건조로 12 - 웰 플레이트를 씻어. 5 분 60 ° C 오븐에서 접시를 놓습니다.
  10. 산소....

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결과

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전혈 (WB) 호중구 주 화성 분석은 fMLP 구배 (동영상 S1)쪽으로 호중구의 축적을 측정함으로써 입증 하였다. 결과는 호중구 (파란색)이 적극적으로 전혈 (그림 3a 및 영화 S1) 중 마이그레이션 할 수있는 동안 적혈구가 여과 빗에 의해 갇혀 있는지 확인합니다. 전혈 미세 유동 장치에 의해 형성된 안정 화학 유인 물질 선형 구배 (그린)를 FITC-표지 된 덱스 트란 (도 3a의 삽입)을 이용하여 확인하고 시간에 따른 형광 수준을 측정 하였다. 이러한 장치에서 생성 된 그라데이션 큰 분자량 작은 분자에 대한 24 시간까지 일주일까지 안정. 세척 프로토콜의 효율은 WBLC의 신호가 없으면 FCC에서 지역화 된 형광 신호를 영상화하거나 장치 주변에 의해 확인되었다. 장치는 다음에 다른 BL로부터 호중구 이동의 차이를 평가하기 위해 사용되었다짐 우드 소스.

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토론

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이 작품에서 우리는 혈액의 액체 방울 (2 μL)에서 호중구의 화학 주성을 측정 할 수있는 미세 유체 플랫폼을 개발했다. 적극적으로 호중구를 마이그레이션에서 적혈구의 온 - 칩 기계적 여과는 호중구를 활성화하여 유물을 소개하는 경향이 이러한 밀도가 10 그라디언트 등의 번거로운 세포 분리 방법, 긍정적 인 선택 (11), 또는 음의 선택 (12)에 대한 필요성을 우회. 적혈구의 기계적 여과는 호중구의 이동을 프로빙 다른 미세 유체 칩에서 우리의 기술을 구분합니다. 예를 들어, 우리가 실험실 13에서 이전 작품 비비 등. 전에 화성 분석에 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하는 칩 8 이용 셀렉틴. 셀렉틴 표면에서 분리 한 후, 호중구의 이동은 완충 용액에서 발생했습니다. 이러한 조건에서, 호중구의 화학 주성에 혈청의 효과가 제거되었습니다. 더욱이, 셀렉틴이 알려져있다특정 수용체와 결합하여 세포를 활성화하기 때문에 <.......

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공개 사항

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공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

감사의 글

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건강의 국립 연구소에서 지원하고 이너스 화상 병원 (GM092804, DE019938을 부여합니다.)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Device Fabrication
SU-8MicrochemY131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth AdhesivesSylgard 184 1.1 lb. Kit
표준 유리 슬라이드Fisher Scientific125495 1 X 3 인치
유리 바닥 판MatTekP12G-1.5-14-F
해리스 유니 코어, 팁 직경 5.0 mmTed Pella, Inc.15081
해리스 유니 코어, 팁 직경 1.5 mmTed Pella, Inc.15072
Microfluidic Assay 준비 및 분석
젤 로딩 피펫 팁Fisher Scientific02-707-139
주사기Fisher Scientfic309602
블런트 팁 바늘, 30 G ½ in.Brico Medical SupplyBN3005
Vacutainer, HeparinBecton Dickinson
HBSS시그마-알드리치
인간 혈청 알부민시그마-알드리치A5843-5G의 0.2% 최종 농도
시그마-알드리치F0895-1MG
fMLP시그마-알드리치F3506-10MG
SurgiLance 안전 란셋, 2.2-mm 깊이, 22 GSLN240
Hoescht stainLife TechnologiesH3570
Positive Control
HetaSepSTEMCELL Technologies Inc.7906
EasySep 인간 호중구 농축 키트STEMCELL Technologies Inc.19257
플라즈마 AsherMarch InstrumentsP-250
Lindberg/Blue M 오븐Thermo Scientific13-258-30C
스테인리스 스틸 정밀 핀셋Techni Tool758TW458
Bel-Art Scienceware 내화학성 진공 탈착기Fisher Scientific08-594-15A
데이터플레이트 디지털 핫 플레이트알파 멀티 서비스PMC 720
니콘 TiE 도립 현미경니콘 - Micro Video Instruments Inc.
MEA53100 CFI 계획 Fluor DL 10X NA 15.2 wd 객관적인Nikon - 마이크로 비디오 악기 Inc.
MRH20101 Nikon Nikon용 2미터 라이트 가이드가 있는 Lumen 200- Micro Video Instruments Inc.500-L200NI2
DAPI / Hoechst / AMCA 협대역 32mm 여자-25mm 이미 터크로마 - Micro Video Instruments Inc.31013v2
Retiga R 2000 냉각 CCD 카메라 1,600 x 1,200 픽셀Qimaging - Micro Video Instruments Inc.레트-2000R-F-M-12-C
HBSS 피브로넥틴

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al.

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