재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.
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정오 공지
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요약
초록
재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 또는 디자인 1,2를 제공 할 수 있습니다. 여기, 펩타이드 MHC II 결합 분석은 384도 형식으로 조정됩니다. 축소 프로토콜 75 %의 시약 비용을 절감하고 이전에 96 - 웰 프로토콜 1,3-5 기술보다 더 높은 처리량입니다. 특히, 실험 설계는 384도 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자에 대해 최대 15 펩티드의 강력하고 재현성있는 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 하나의 연구자 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization 또는 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 다른 프로토콜이 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다. 특히, 단계별 지침과 시각적 형식주피터의 다른 사용자가 빠르고 쉽게 자신의 실험실에서이 방법을 확립 할 수 있도록해야한다.
서론
단백질 치료제 6의 가장 빠르게 성장하고있는 클래스이며, biotherapeutic 파이프 라인의 급속한 확장은 단백질 의약품의 개발 및 사용과 관련된 문제에 대한 증가하는 관심을 집중하고있다. 하나의 고유 한 고려 사항은 건강 기능 면역 시스템의 모든 세포 단백질이 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 샘플링되고 있다는 사실에서 유래한다. 일단 장갑차에 의해 내면화, 단백질은 작은 펩타이드 조각으로 절단하고, 추정 면역 원성 세그먼트 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체 단백질 (MHC II)의 홈에로드됩니다. 펩티드-MHC II 복합체 후 APC 표면 상에 표시하고, 진정한 면역 원성 펩티드는, 동족 CD4 T 세포 표면 수용체 7과의 삼원 MHC II-펩티드-T 세포 수용체 복합체를 형성하고, T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 중요한 분자 인식 이벤트는 T 세포 활성화에 결과 복잡한 신호 폭포, 사이토 카인의 방출을 시작합니다의, CD4 T 세포 매개 성 B 세포의 성숙, 그리고 바인딩과 잘못된 외래 단백질을 취소의 IgG 항체를 순환 궁극적으로 생산. 따라서, 면역 원성 단백질을 구성하는 T 세포의 항원을 확인하고 MHC II 복합체 형성에 대한 책임이 키 잔류 돌연변이에 의해 deimmunized 될 수 있습니다. 이는 T 세포 에피토프가 많고....
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프로토콜
네 개의 주요 활동은 펩티드-MHC II 결합 분석을 포함한다 : 1 바인딩 : 시험 펩티드 용액 상 용해 MHC II 단백질의 결합을 표지 제어 펩티드와 경쟁. 바인딩은 테스트 펩티드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 측정된다. 2 - 화면 캡쳐 : 바인딩 반응이 평형에 도달 한 후, 펩타이드 MHC II 단지가 캡처 및 고정 된 항체와 형태에 의존하는 인식하여 결합되지 않은 펩타이드와 단백질에서 분리된다. 3 탐지 : 캡처 제어 펩타이드 정량적 시간 분해 형광을 이용하여 검출한다. 4 - 분석 : 분광 데이터를 처리 플롯 및 테스트 펩타이드와 MHC II 단백질의 농도 의존적 결합 특성을 확인하기 위해 분석된다.
가능한 경우 다음 절차의 여러 단계에서, 액체 처리 로봇의 사용을 권장합니다. 특히 384도 형식으로 자동 분배 및 액체의 희석 더에 사용자 오류, 결과를 최소화일관된 잘 행 웰 볼륨 및 수동 96 - 웰 분석 (데이터 미도시)에 비해 IC 50 값 좁아 95 % 신뢰 구간을 산출한다. 액체 처리 로봇을 사용할 수없는 경우, "(액체 처리 로봇)"주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가능하면 마찬가지로, 384 - 웰 형식과 호환되는 자동화 된 와셔를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 효과적으로 플레이트 ....
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결과
엔테로 박터 클로 아카 P99 베타 - 락타 마제 (BLA) (Genbank에 ID 번호의 X07274.1)의 성숙 펩타이드 서열은 MHC II 대립 유전자 DRB1 * 1501 (표 4)으로 추정 펩타이드 바인더 ProPred (16)를 분석 하였다. ProPred은 필수 P1 앵커 잔류 물 117 nonamer 펩티드를 확인 (즉, M, L, I, V, F, Y, 31 바인딩 MHC II에 필요한 위치 1에서 W). 5 %의 임계 값으로 만보다 큰 득점 2.6 같은지 가능성 바인더와 펩티드이다. 따라서, 5 %의 문턱에서, 상위 11 펩티드 * 1501 MHC II의 DRB1을 결합 할 것으로 예상된다.
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토론
Biotherapeutics에 2012 년 32에서 상위 5 개 판매 약의 네를 대표하는 현대 의학의 초석로 자신을 설립했다. 바이오 의약 부문은 몇 년 6 지속 성장을 보여 왔으며, 새로운 에이전트의 지속적인 발전뿐만 아니라 바이오시 밀러의 등장은 바이오 의약품 파이프 라인을 확장했다. , 미래를 찾고 평가하고 단백질 치료제의 면역 원성을 완화하는 것은 초기 단계의 biotherapeutic 개발의 중요한 부분이 될 것입니다. 이 과정을 용이하게하기 위해, 생물 공학자는 에피토프 예측 16-22에 대한 계산 방법 중 자신뿐만 아니라 기능 3,23-26을 유지하면서 면역 원성을 줄이기 위해 노력 통합 단백질 설계 알고리즘을 도와 줄 수 있습니다. 마찬가지로, 백신 설계와 개발은 예측 알고리즘 4의 전원을 활용할 수 있으며, 역 신학의 지속적인 성숙을 보호 얻을 것으로 예상된다이전의 노력 33 회피 한 감염원의 .......
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공개 사항
레너드 모이는에 의해 고용 및 EpiVax, 주식, 프로비던스,로드 아일랜드에있는 개인 소유의 생명 공학 회사의 스톡 옵션을 보유하고 있습니다. 이 연구 보고서에 포함 된 작품은 회사의 상업적인 목표와 연관 될 수있는 편견이다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R01-GM-098977 및 CBK와 KEG에 R21-AI-098122에 의해 지원되었다. RSS는 공학 이어 학교에서 이어 혁신 프로그램 원정대에 의해 루스 재단 원정대에 의해 부분적으로 부분적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소듐 테트라보레이트 데카하이드레이트 | 시그마 | 221732 | |
| 시트르산 | 시그마 | C1901 | |
| 이염기성 소듐 포스페이 | 시그마 | S7907 | |
| 트리즈마 HCl | 옴니푸르 | 9310 | |
| 트윈-20 | 시그마 | P7949 | |
| 100% DMSO | 시그마 | D8418 | |
| 옥틸-& 베타, -D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa 블록 SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco' s 10x 인산염 완충 식염수 | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA 분석 완충액 | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA 강화 완충액 | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR 항체 | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated 추적 펩타이드 | 21세기 생화학 | 맞춤 주문 | |
| 테스트 펩타이드(1-4mg, 순도 85%) | Genscript | 맞춤 주문 | |
| 정제 HLA-DRB1 단량체(비오틴화) | Benaroya Research Institute* | 맞춤 주문 | |
| 384웰 백색 EIA/RIA 플레이트 | Thermo | 460372 | |
| 폴리프로필렌 384웰 플레이트 | Costar | 3656 | |
| 필름, AxySeal, 80 & 마이크로; m, ELISA 어플리케이터 | Axygen Ascientific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | 해당 없음 | 해당 없음 Epimotion | |
| Liquid Handler (또는 유사) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (또는 유사) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (또는 유사) | Molecular Devices | N/A | |
| *재조합 인간 MHC II 분자는 Benaroya Tetramer Core Laboratory에서 얻을 수 있습니다. 참조: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory |
참고문헌
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2 in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (mM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (ml) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (ml): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
to:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (μM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (μl) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (μl): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
