신생아 Pial 표면 에레

요약

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

초록

지난 몇 년 동안 pial 표면은 손상 후를 포함하여, 배아 산기 및 성인 신경과 gliogenesis 동안 중요성을 싹 틈새로 확인되었습니다. 그러나 유전이 전구 인구를 심문하고 그들의 계보를 추적하는 방법은 특이 또는 시간 바이러스의 생산을 소비의 부족으로 제한했다. 따라서,이 지역의 발전은이 지역의 연구 단지 소수의 상대적으로 느리다. 일렉트로은 배아의 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 년 넘게 사용하고, 최근에는 출생 후 뇌의되었습니다. 여기에 우리가 적응 일렉트로 방식에 따라 pial 표면 조상의 유전자 조작에 대한 효율적이고 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. Pial 표면 일렉트로 따라서 이러한 세포 연구를위한 시간 절약과 경제적 인 접근 방식을 나타내는 이러한 조상의 손쉬운 유전자 표시 및 조작 할 수 있습니다.

서론

신경 줄기 및 전구 세포는 포유 동물 CNS ^{1, 2에} 걸쳐 존재한다. 자신의 성격과 뇌와 척수의 심실 지역 주변 배아와 성인 새싹 영역의 속성을 광범위하게 지난 십 ^1-3에 설명되어있다. 많은 부분에서, 이는 같은 floxed 대립 유전자 또는 ^4를 추적 레트로 바이러스 계통의 신경계 특정 크레 재결합으로 더욱 정확한 유전 도구의 개발에있다. 그러나 한 전구 지역 - pial 표면 전구 최근에 어떤 세부 ^5-7에 설명 된 영역 - 가지고 기다리고 종합 시험.

뇌 pial 표면은 뇌의 표면 및 주변 수막 ⁸ 간의 인터페이스로 정의된다. 나중에 개발, neuroepithelial하고, 동안, 반경 폐해 최종 피트는이 표면 ^{9, 10에} 연결합니다. 전나무의 일부인간의 두뇌와 신경 세포의 유사 분열의 많은 성 신경 세포는이 지역 ^11에서 관찰된다. 나중에 배아 신경 동안, 대뇌 피질의 interneurons는 중간 영역과 subventricular 영역 ^{12 ~ 14에서의} 이주 경로에 추가하여 pial 지역을 통과하는 것으로 알려져있다. 이 기간 동안, 줄기 세포는이 영역에서 배양 될 수 ....

프로토콜

이 절차는 삼목 시나이 IACUC의 요구 사항에 따라입니다. 조사자는 이전 절차에 기관 IACUC 준수를 확인해야합니다. 모든 도구와 시약은 사용하기 전에 소독해야한다.

1. 도구의 제조, 솔루션 및 DNA 혼합물

1. 마이크로 피펫 풀러에 100-mm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브를 삽입합니다. 약 17.5 mm의 피펫 팁을 형성하는 표준 가중치를 풀 수 있도록 열을 설정합니다. 약 100 μm의 직경의 구멍을 만들 수있는 팁의 시작 부분까지의 거리 약 8~9밀리미터에서 날카로운 수술 가위로 끝을 잘라.
2. 주식에게 1 % w / 건조 빠른 그린으로 (20 μm의 주사기 필터를 사용) 필터링 핵산 분해 효소가없는 물을 혼합하여 빠른 그린 솔루션 V를 확인합니다.
3. 트리스-EDTA (TE) 버퍼에 희석 고도로 집중되어 정제 된 독소가없는 플라스미드 DNA (예> 3 ㎍ / μL)를 분리합니다. 플라스미드의 추가 원하는 양혼합물에 TE 버퍼에 희석 (w / 빠른 그린의 최종 농도 V 0.1 %를 만드는) 1 % 빠른 녹색 솔루션을 1:10의 비율을 추가합니다. 도입 유전자의 강력한 발현 플라스미드의 0.5 ~ 2.0 ㎍ / ㎕의 최종 농도를 사용합니다.

결과

세포 - 주로 조상 -이나 pial 표면 ⁶ 근처에있는 플라스미드 DNA의 발현에 Pial 표면 일렉트로 결과. 보다 구체적으로, 전극의 배향이 플라스미드 움직임과 후속 식의 방향을 지시하는 중요하다. 따라서, 이중 전극 구성에서, 플라스미드는 부정과 양극 사이에 거의 직선 벡터에 관한 것이다. 음극은 주사 부위 위에 배치되고 양극이 음극에 복부 롭다 따라서, 플라스미드 pial 표면으로 강제한다. 이것은 표면에 수직 인 전류 벡터를 생성하는 전극을 배향하는 것이 가장 이상적 일 것이라고 가정한다. 적절한 전극 방향과 더 작고 focally 타겟 전극의 사용으로, 생존율은 100 %입니다. 그러나, 중뇌 등 일부 지역에서, 치료는 심장을 중지 할 수 있습니다 현재 배달을하지 않도록주의해야한다, 따라서 caus전자 일렉트로 마우스 새끼의 생존 능력을 감소시켰다. 새로 한 트라이 전극 구성 또는 다른 수정은 심장 박동 ^28과 같은 중요한 기능에 관여 구조를 피함으로써 더 어려운 지역을 대상으.......

토론

pial 표면 조상의 성공적인 일렉트로의 가장 중요한 측면은 다음과 같습니다 : 1) pial 표면에 플라스미드 믹스의 대상; 2) 주사 부위 혈종의 발생을 회피; 및 3) 중뇌 전기 천공과 연관된 사망률을 회피.

적절하게 pial 표면을 대상으로하는 pial 표면의 침투를 방지하기 위해 두개골의 측정 및주의 천공에 의해 달성된다. 부드럽게 조직 (즉, 빠른 그린이 피부와 결합 조직의 두개골 위에 지역화를) 마찰시 피부에 빠른 녹색 염료의 1) 변위 : 덮고있는 피부 또는 기본 뇌실, 뇌 실질 조직을 대상으로 부적절한가 입증 될 것 또는 2) 플라스미드 믹스 뇌실 및 / 또는 실질 들어갔을 나타내는 뇌에 빠른 녹색 염료의 소실. 플라스미드 믹스의 적절한 pial 표면 현지화 두개골 일에서 염료의 축적에 의해 입증됩니다상냥한 피부 변위에 의해 방해 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 연습과 손재주이 성공적으로 타겟팅이 필요합니다. 혈종의 형성 가능성이 플라스미.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화재 광택 붕규산 튜빙	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
마이크로피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니 컴퍼니	P-30
패스트 그린 FCF	시그마 알드리치, Inc.	F7528
XenoWorks 디지털 마이크로인젝터	Sutter Instruments Company
ECM 830 발전기	하버드 장치, BTX 기기 사업부	45-0052
3mm 플래티넘 핀셋	하버드 기기, BTX 기기 Div	45-0487
SignaGel 전극 젤	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA 버퍼, pH 8.0	통합 DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
적외선 열 램프	VWR	36547-009
고급 가위 날카로운	미세 과학 도구	14060-09