제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

산화 스트레스는 특별히 불평형 세포 산화 환원 상태로부터 발생 조건으로 정의된다. 일상적으로 세포 내부에서 발생하는 복잡한 산화 환원 반응은 세포의 산화 환원 상태를 결정합니다. 산화 환원 반응 감소와 분자 (즉, 산화 환원 반응)의 산화를 생산하는 생체 분자의 원자 사이의 전자의 이동에 구성되어있는 모든 화학 반응으로 구성되어 있습니다. 이러한 반응은 극단적 인 구조 불안정과 이웃 생체 분자와 교환 불균형 전자의 자발적인 활성화를 특징으로 전자 활성 종 (즉, 프로 산화 종)에 의해 촉매된다. 이러한 불규칙한 반응은 DNA 손상, 단백질의 카르 복 실화, 지질의 산화로 발생, 결국 세포의 죽음 ^1로 이어집니다. 산화 스트레스의 증가 수준은 노화와 다른 병적 인 상태 ^2의 진행과 관련이있다. 산화 스트레스가당뇨병과 심혈관 질환 ^3,4 혈관 변경에 대한 책임을 져야하는 것으로보고되었습니다. 또한 알츠하이머 병에서 신경 변성에 중요한 역할을하고 파킨슨 병 ^5. 또한, 산화 스트레스는 암 진행 및 전이성 이벤트 ^6,7 지배하는 중요한 인자로 입증되었다. 또한, 염증과 면역 반응이 유도 및 추가 지원의 산화 스트레스 ^8있다.

또는 질소 (RNS, 반응성 질소 종), 살아있는 세포에서 프로 산화 종은 산소 (활성 산소 종 ROS)에서 파생됩니다. (H ₂ O _2), 및 과산화수소 ^- (O ₂₎ ROS는 수퍼 옥사이드 음이온, ^(. OH) 히드 록실 라디칼을 포함한다. 기본 RNS는 아산화 질소 ^{(NO.)입니다.} 이차 반응 종의 일련 betwee 자발적인 상호 작용에 의해 발생 될 수있다N ROS와 RNS 또는 무료 금속은 ⁹ 이온. H ₂ O _2가 철 ^{2 +} 하이드 록실 라디칼을 발생과 반응하면서, ^- 예를 들면, 수퍼 옥사이드 음이온 peroxynitrate (ONOO)을 형성하는 질소 산화물과 반응한다. ROS와 RNS 인해 여러 가지 생체 분자와 반응 할 수있는 능력으로, 생리적 인 산화 환원 상태 ^(10)의 유지 보수를 위해 위험한 위협으로 간주됩니다. 유지하기 위해 산화 환원 상태의 세포는 산화를 억제하는 분자와 효소를 해독하는 일련의를 갖추고 있습니다. ^{. 11 -} 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD)는, 카탈라제, 글루타티온 과산화 효소 및 Peroxiredoxins는 기본적으로 H ₂ O _2, OH와 오노 등의 프로 산화 종의 세포 보호 기능을 제공하는 항산화 효소 - 아스날을 구성한다. 또한 비타민 C와 E, 폴리 페놀 및 보효소 Q10 (코큐텐)과 같은 항산화 분자는 ROS와 그 위험한 데를 해소하기 위해 매우 중요합니다^{12, 13} rivatives. 그러나, ROS 및 RNS 또는 항산화 제 시스템 장애의 과잉 생산은 산화 적 스트레스 ^(14)를 향해 세포 산화 환원 상태를 시프트.

부정적인 의미 외에, ROS는 서로 다른 기원의 세포에서 다양한 생리 학적 역할을 할 수있다. 세포는 일반적으로 같은 숙주 방어와 상처 수리 ^15-17 정상적인 생물학적 이벤트를 중재하는 분자 신호로 ROS를 생산하고 있습니다. 반응 종은 일반적으로 신호 인자, 성장 인자, 칼슘 레벨 ^{(18, 19)의} 세포 내 변동에 대한 응답 등의 NOX (NADPH 산화 효소)와 XO (Xantine 산화 효소)와 같은 세포 내 효소에 의해 세포에서 생성된다. 이것은 ROS가 p53의 그러한 차별적 또는 ATM-키나아제, DNA 손상 반응 ^(20)의 마스터 레귤레이터 같은 세포 성분으로서 중요한 핵 인자의 활성을 조절 할 수 있다고보고되었다. 유사하게 ROS는 강력하게 일을 매개로 세포 신호 전달에 영향을 미치는전자의 산화 및 신호 전달 ^(21)의 중요 규제로 설립되는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPS)의 불 활성화. 또한, 단백질 체학 기반 방법론은 RNS는 특정 단백질의 수정 및 분자 신호의 변경에 대한 책임이 있음을 보여줍니다. RNS는 S-nitrothiols (SNO)에이를 수정하고 염증 및자가 면역 질환 ^{(22, 23)} 등의 병적 상태와 수반하는 분자 경로를 트리거 시스테인 티올 그룹과 반응한다.

세포 배양 실험은 단지 부분적으로 생체 내에서 작용하는 요인 중 다수를 재현하기 때문에, 동물 모델 ^{(24, 25)에} 산화 환원 연구를 수행하기 위해 큰 관심이다. 이를 위해 제브라 피쉬는 산화 스트레스 역학 ²⁶ 공부 적합한 척추 동물 모델로 간주되었다. 제브라 피쉬는 여러 가지 장점이 척추 데브 동안 세포 및 유전 이벤트를 연구하기 위해 부여하는 새 모델 시스템입니다elopment과 질병. 배아의 큰 클러스터는 실험의 요구에 매주 생성 및 사용할 수 있습니다. 또한 제브라 피쉬 배아의 특별한 광학 선명도뿐만 아니라 작은 크기는 전체 생물 ²⁷ 단일 세포 이미징 및 동적 추적을 할 수 있습니다. 지난 10 년, 제브라 피쉬 돌연변이의 상당수는 암과 유전 질환 ^{28 ~ 31으로} 인간의 병적 인 조건을 모델로 생성 된. 가장 중요한 것은, 유전자 변형 라인의 다수는 유전과 생물학적 조작 ^(32)의 폭 넓은 기회를 제공 할 수 있도록 제작되었습니다. 예를 들어, 유전자 조직 특정 제브라 피쉬 라인은 정기적으로 생체 내 연구에 이용된다. 이 라인은 생체 내에서 단일 세포를 식별 할 수있는 능력뿐만 아니라, 그들이 포함 해부 구조를 제공 선택된 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현.

여러 독성 연구는 이미 T를 사용했습니다그는 약물 발견 및 산화 스트레스 ^33-35의 분야에 대한 동물 모델 등이 척추의 적합성을 제안, 산화 환원 항상성에 화학 물질의 생체 내 효과를 평가하기 위해 제브라 피쉬. 약간의 형광 프로브는 제브라 피쉬의 유충 ^{(36, 37)에} 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 테스트되었습니다 경우에도, 제브라 피쉬의 조직에서 산화 스트레스의 수준과 살아있는 세포를 감지하고 측정 할 수있는 확립 된 시험 법이 없습니다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬 배아의 살아있는 세포에 산화 스트레스의 생체 정량화하기위한 절차를 설명합니다. 이미징 도구, FACS 정렬, 형광 프로브 및 프로 산화 조건은 모든 제브라 피쉬 배아 조직에서 검출 및 산화 종의 정량화에 대한 간단한 분석을 생성하기 위해 결합됩니다.

인스 트루먼 트와 일 솔루션 1. 준비

1. 물고기 물 솔루션을 준비합니다. 증류수 50ml에 바다 염 인스턴트 오션 '2g을 용해시켜 스톡 용액을 만든다. 물고기 물 (60 ㎍ / ㎖의 바다 소금 최종 농도)를 사용할 준비가 준비하는 1 L의 증류수에 주식 물고기 물 1.5 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 물고기의 물을 사용할 준비를 압력솥. 이 용액을 제브라 피쉬 배아 매체로서 사용된다.
2. 배아 설치에 대한 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 멸균 물고기 물 50 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹여. 저어 접시에 자석을 사용하여 용해를 촉진한다. 분말의 완전 용해 몇 시간이 필요할 수 있습니다. 작은 튜브에 선명도와 나누어지는에 대한 솔루션을 확인합니다. 개월 -20 ° C에서 보관 및 사용에 분주을 해동. 사용하기 전에 5 분 950 XG에 메틸 셀룰로오스를 원심 분리기. 분취 량의 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
3. tricaine / 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 (M)의 50 ㎖를 준비100 ml의 물에 tricaine 200mg을 용해 및 트리스 - 염산 1 M (pH가 15)를 사용하여 7.0의 pH를 조정 순서 ethanesulphonate 염 (원액). 더 이상 30 일 이상 4 ° C에서 콘텐츠를 저장합니다. 주의 : tricaine는 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다.
4. 제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스를 유도
   1. 일반적인 산화 스트레스 유도를위한 산화제 용액을 제조 : H ₂ O ₂ 원액 (과산화수소, 100 ㎜)에 추가하여 산화성 용액 50 ㎖를 확인 물고기의 물을. 2 ㎜, 100 μM 사이의 최종 농도의 H ₂ O _2를 사용합니다. 곧 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 이 솔루션을 저장하지 마십시오. 주의 : H ₂ O _2는 위험 및 흡입 유해 삼키면. 가연성 물질과 접촉하면 화재를 일으킬 수 있습니다. 흄 후드를 처리하고 적절한 그럴를 착용ONAL 보호 장비.
   2. 미토콘드리아 유래 산화 스트레스 유도위한 산화제 용액을 준비한다 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 중에서 2 ㎖에 로테 논 3.9 밀리그램을 용해한 산화제 스톡 용액 (5 mm)를 확인. 어두운 용액을 실온에서 보관.
      1. 솔루션을 사용하기 준비하기 위해 물고기의 물 10 ㎖에 로테 논 원액을 녹인다. 5-50 μM 사이의 농도에서 로테 논을 사용합니다. 100 μM보다 더 높은 농도에서 로테 논을 사용하지 마십시오. 적절한 농도에서,이 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 주의 : 로테 논은 독성 및 위험합니다. 적절한 예방 조치 문구에 따라 처리합니다.
   3. 유전자에 의해 산화 스트레스를 유도 노크 다운 : 노크 다운 nrf2a 유전자 발현을 제브라 피쉬 배아의 모르 폴리 노의 미세 주입에 의해 이전에 TIMME-Laragy A. 등 2012 년 ^(38)에 의해보고..
   4. OXID를 유도조직 손상 후 스트레스는 ative :. 이전 Niethammer 등 2009 년 ^(39)에 의해 설명 된대로 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처 마진을 생성합니다.
5. 단일 셀 ROS-검출 방법에 대한 ROS 감지 솔루션의 5 ML을 준비
   1. 작업 솔루션 (: 2.5-10 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에서 일반 ROS에 민감한 분자 프로브를 용해 : 일반 ROS의 탐지를위한 솔루션을 제공합니다. 이 솔루션은 바로 사용하기 전에 준비를해야합니다.
   2. 미토콘드리아에 의해 유도 된 특정 감지 ROS의 해결 방법 : 사용 직전에, DMSO는 5 mM의 원액을 만들고있는 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브를 녹입니다. 작동 용액 (: 2.5-10 μM 농도 범위)을 제조하기 위해 HBSS에 원액을 용해.
      참고 : ROS 탐지 작업 솔루션의 빛과 산소에 노출과 각각의 원액을 피하십시오. 사용하여 빛으로부터 튜브를 보호알루미늄 호일. 저장 또는 HBSS에 용해 재사용 프로브하지 마십시오. 한 달 동안 -20 ° C에서 주식 솔루션을 저장합니다.
      주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브 및 DMSO를 처리합니다.
6. 전체 마운트 ROS-검출 방법에 대한 ROS 검출 용액 5 ㎖를 준비 작업 솔루션 (: 2.5-5 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS에 (DMSO에서 안정화) 일반 ROS 민감한 프로브 원액을 녹인다. 빛과 산소에 노출을 피하십시오. 빛으로부터 튜브를 보호합니다. 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 저장하거나 다시 사용하지 마십시오. 주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브를 처리합니다.
7. PBS 1X 15 ㎖에 소 태아 혈청 10 ㎖를 추가하여 정지 용액 25 ㎖를 확인합니다. 멸균 솔루션을 유지합니다. 4 ° C에서이 솔루션을 저장 ROS 검출 방법 -이 솔루션은 하나의 세포가 필요합니다.
8. 28 &에 제브라 피쉬 공기 배양기를 설정# 176; C.
9. 단일 세포 ROS-검출 방법에 대해 4 ° C에서 원심 분리기를 설정합니다.

2. 성인 물고기의 결합 및 제브라 피쉬 배아의 선택

1. 셋업 성인 zebrafish의 쌍은 표준 프로토콜 ^(40)에 따라 교차합니다. 특정 실험의 요구에 따라 해당 유전자 변형 라인을 선택합니다.
2. 계란을 수집하고 물 물고기 / 배아 매체와 90 mm 접시에 배치합니다. 태아가 개발하고 원하는 발달 단계에 성장할 때까지 28 ° C에서 알을 유지 (예를 들어, 48 HPF, 72 HPF, HPF : 시간 게시물 수정).
3. 배아를 개발하기위한 화면입니다. 모든 미 수정 알이나 낙후 된 배아를 제외합니다.
4. 50 ㎖ 물고기 물에 tricaine (원액) 1 ㎖를 추가하여 태아를 마취.
5. 실체 현미경의 Tg 형광 배아를 선택합니다.

산화제 에이전트와 태아의 3. 치료

1. 48 시간 사이에 최소 30 배아를 사용PF (72)가 다른 조건 당 HPF. tricaine을 제거하기 위해 신선한 생선의 물로 2 회 배아를 씻으십시오.
2. 세 가지 요리에 형광 배아를 분할합니다. 더 이상 30 이상의 태아 / 접시를 넣어.
3. 세척 용액을 제거하고, 산화제 용액 10 ㎖ 또는 제어 솔루션으로 물고기의 물 10 ㎖를 추가합니다.
4. 28 ℃에서 1 시간 10 분 동안 태아를 품어 잠복기는 특정 조직에 유도되는 산화 스트레스의 수준에 따라 달라집니다. 산화 스트레스에 의해 영향을받는 세포가 점진적으로 세포의 죽음을 받다 짧은 기간은 최고입니다.
5. 소용돌이 치는 HBSS 및 세척 배아를 포함하는 새 접시에 배아를 전송. 28 ° C에서 사전 따뜻한 HBSS

4. 전체 마운트 ROS 감지 방법

1. 산화 처리 후 배아를 수집하고 작은 관에 10 개 이상 배아를 넣어. HBSS에 가능한 한 많이 씻어. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다.
2. 에 대한 ROS 감지 솔루션 1 ML을 추가합니다각 관.
3. 빛의 노출을 피하기 위해 28 ° C에서 15 분 동안 어둠 속에서 배아를 품어.
4. 배양 시간 동안 완전히 배아 분석을 위해 유리 슬라이드를 준비한다. "우울증"유리 슬라이드에 메틸 셀룰로오스의 300 μl를 넣고 피펫 팁으로 유리 표면에 확산. 메틸 셀룰로오스를 해제하는 동안 거품을 피하십시오.
5. 배양 시간의 끝에서, 즉 ROS 검출 용액을 제거하고 HBSS 2 ㎖로 두 번 세척 하였다. 튜브를 여러 번 반전 배아를 씻으십시오. 피펫 또는 소용돌이하지 마십시오.
6. 최대 유리 파스퇴르 피펫으로 기음 배아. 피펫의 개통 근처 부드럽게 위치 배아는 메틸로를 꺼냅니다. 좋은 나일론 줄을 적절하게 배아를 동쪽을 향하게.
7. 처리 된 배아와 제어 배아의 형광을 비교. 모든 배아이를 이용한 영상화되도록 대안 적으로, 형광 실체 현미경 또는 공 초점 현미경의 파라미터를 정돈영상 설정.

5. 하나의 세포 ROS 감지 방법

1. 3.5 단계에서 시작합니다. 각 조건에 대해 적어도 35 배아를 가지고 있는지 확인합니다.
2. 새 접시에 배아를 전송합니다. 물고기 물에게 가능한 한 많이 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 1X 10 ㎖ 및 프로테아제 억제제 칵테일의 400 μl를 추가합니다. 수동 집게와 배아를 d​​echorionate 및 미세 바늘 노른자 자루를 제거합니다. 참고 : 노른자의 자루를 제거하면 다음 FACS 분석을위한 깨끗한 샘플을 보장합니다. 이 단계는 FACS 악기에있어서 피할 수있다.
3. 전송 드 노른자위 24 웰 멀티 웰 플레이트에 배아 (15 배아 / 웰)과 모든 물고기의 물을 제거합니다.
4. HBSS 300 μL, 30 μL의 콜라게나 제 P, 각 웰에 50 ㎕의 트립신-EDTA를 추가합니다.
5. 꽉 피펫 팁 (1,000 μL)으로 부드럽게 피펫 팅에 의해 아래로 배아를 균질화.
6. 20 분 동안 28 ° C에서 품어 5 분마다 피펫으로 시료를 균질화.
7. 조직 DISR 확인복합 현미경에서 균질의 분취 량을 관찰하여 uption. 피펫 팅하여 단일 세포 현탁액을 용이하게한다. 30 분 동안 배아를 배양하지 마십시오.
8. 정지 솔루션 200 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 부드럽게 피펫으로 섞는다.
9. 단단한 바닥에 미리 냉각 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 빛의 노출을 피하십시오.
10. 4 ° C에서 250 XG에 5 분 동안 원심 분리
11. 부드럽게 피펫 팅에 의해 얼음 차가운 HBSS와 상부 상하고 다시 중단 세포를 제거합니다.
12. 세포를 계산하고 당신의 모든 샘플에 동일한 수의 셀이 있는지 확인하십시오. 이하 2 × 10 ⁶ 세포를 사용하지 마십시오.
13. 4 ° C에서 250 XG에서 5 분 원심 분리기 세포
14. 상층 액을 제거하고 활성 산소에 민감한 프로브를 포함하는 얼음 냉각 HBSS 1 ㎖로 펠렛을 일시 중지합니다.
15. 어둠 속에서 3 분간 실온에서 튜브를 배양한다. 산화 스트레스의 레벨에 따라 배양 시간이 다를 t하도록프로브의 고 감도.
16. FACS 튜브에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 FACS 분석하기 전에 빛의 노출을 피하십시오.
17. 형광 활성 세포 분류기 (FACS)으로 세포를 정렬합니다. Tg는 조직의 형광 (예를 들면, GFP) 및 ROS 감지 (예를 들어, 특정 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브, 일반 ROS 민감한 프로브)에 사용되는 분자 프로브의 여기 / 발광 스펙트럼에 따라 설정 파장.
18. 각 조건을 위해, 동일한 FACS 설정을 적용하여 동일한 실험 세션 내에서 모든 샘플을 측정한다. 다른 생물은 복제의 수단으로 형광 세포의 비율을 계산합니다. 각 조건에 대해 적어도 두 개의 반복을 분석합니다.

여기에 기재된 방법을 적용하여, 우리는 쉽게 측정 할 수 있고, 제브라 피쉬 배아 조직에서 산화 스트레스 (ROS 및 레벨)을 검출한다. 성인 제브라 피쉬를 횡단 한 후, 달걀을 수집하고 72 시간 게시물 수정 (HPF)로 28 ° C에서 개발하기 위해 사용할 수 있습니다. 강한 친 산화제 시약 배아 1) 치료 또는 조직 상해 후에 2) 촉진 ROS 형성 : 산화 스트레스를 유도하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 제안한다.

과산화수소 (H 2 O 2), 일반 휴대 ROS 형성 제로서, 그리고 로테 논, 특정 미토콘드리아 ROS 드라이버로 : 첫 번째 방법은 특정 필요에 따라 서로 다른 두 가지 시약을 사용. 로테 논은 규제 완화는 산화 스트레스 (41)의 원인이되는 등, 복잡한 I의 억제제이다.

두 번째 방법에서, 우리는 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처를 작성하여 ROS의 축적을 유도39. 또한, 산화 스트레스 조건은 모르 폴리 노 주입과 산화 스트레스 (38)의 세포 독성 효과에 대한 기본 세포 방어입니다 NRF2 산화 반응 경로를 노크하여 제브라 피쉬의 조직에서 승진 할 수있다.

산화 스트레스는 제브라 피쉬 배아에서 유도되면, 반응성 산소 종 (ROS)의 축적은 활성화시 형광등 (즉 산화)되어 일반 또는 특정 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브를 사용하여 측정 할 수있다.

처리 된 배아는 전체 마운트 ROS 검출 방법을 사용하거나,도 1에 요약 된 바와 같이 단일 셀-ROS 검출 방법을 적용하여 분석 할 수있다. 방법 간의 선택은 산화 스트레스의 질적 또는 양적 측정을 수행해야 할 필요성에 의존한다. 두 방법의 대표 결과는 그림 2에 표시됩니다 그림 3.

전체 마운트 ROS 감지 방법

도 2는 산화 스트레스의 생체 내 이미징을위한 전체 마운트 ROS 검출 방법의 애플리케이션을 보여준다. 특히,이 방법은 외인성 프로 산화제 치료뿐만 아니라 상처를 입거나 유전자 삭제로 더 생리적 조건에 의해 생성 된 "낮은"산화 스트레스에 의해 생성 된 "강력한"산화 스트레스를 모두 따라 적용되었습니다.

산화 종의 생리 학적 수준은 72 HPF에서 라이브 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에서 마이크로 부상이나 넓은 상처를 생성에 의해 유발된다. 그것은 부상 후, H 2 O 2가 상처 39 후 상처 이익률 20 분에 축적 것을 증명하고있다. 상처 마진에서 산화 스트레스의 축적을 시각화하기 위해서, 배아는 일반 함께 배양 하였다ROS에 민감한 프로브, 39 명이 부상 한 후 20 분에서 몇 군데. 부상 꼬리와 그대로 꼬리 지느러미를 비교함으로써, 상처 마진 (도 2A)에서 형광 프로브의 축적을 구별하는 것이 가능하다. 비 특정 약한 형광 신호는 모두 두 조건의 꼬리 지느러미 조직 주위에 감지됩니다.

상처 마진에서 ROS에 민감한 프로브의 특정 축적, H 2 상처에서 O 2 수준을 확인하기 위해 약물 학적 접근 방법에 의해 감소되었다. 그것은 상처 마진 H 2 O 2가 축적 DUOX-억제제 VAS2870 39에 매우 민감하다는 것을 입증 되었기 때문에, 배아는 상처를 입기 전에이 억제제로 미리 처리 하였다. ROS에 민감한 프로브의 형광의 비교, VAS 사전 처리 된 배아와 각각의 컨트롤에서 신호가 ROS의 축적 (즉, H 2 O 2에 종속되어 있음을 나타냅니다) (그림 2B).

또한, 우리는 로테 논에 제브라 피쉬 배아를 처리하여 제브라 피쉬의 조직에서 산화 종의 높은 수준을 생성합니다. 로테 논 처리 된 배아와 컨트롤은 특히 활성 산소 종을 감지하는 일반적인 ROS 민감한 프로브를 배양 하였다. 그 후, 프로브는 세척하고, 배아는 형광 입체 현미경으로 이미지화 하였다. 산화 스트레스는 태아 (그림 2C)의 몸 전체에서 발견되었다. 고배율 이미지는 프로브가 성공적으로 (그림 2D)를 대사 해부학 적 영역을 보여줍니다. 형광 이미지 (아래 패널) ROS-양성 세포를 표시하는 동안 시야 이미지 (상단 패널), 해부학 적 구조를 구분합니다. 형광 이미지로 나타낸 바와 같이 결과는 주로 취급 배아로 제어를 비교함으로써 달성되는 산화 스트레스 탐지의 질적보고있다.

하나의 셀- ROS 감지 방법

도 3 리포트 대표 FACS 플롯 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 적용하여 산화 스트레스를 정량화. 이 방법은 프로토콜에보고 된 프로 산화제 조건을 실시하고도 전설에 대한 자세한 된 제브라 피쉬의 세포에 산화 스트레스 수준을 측정하도록 구성되어 있습니다. 한 바와 같이, 산화 스트레스는 활성 산소에 민감한 분자 프로브 단일 세포로 해리 제브라 피쉬의 조직을 배양하여 측정되었습니다. 해리 과정 및 FACS 자체가 세포 손상을 일으킬 수 있기 때문에, 시료의 분석은 단지 "생균"이 산화 스트레스 정량을 위해 고려되는 것을 요구한다. 따라서, 해리 된 세포를 "생균"물리 파라미터 (도 3a)을 나타내는 세포의 비율을 선택하고 (도 3b) 죽은 세포를 배제함으로써 분석된다. 따라서, 샘플에 대해 정량화산화 스트레스 수준 ROS 민감한 프로브의 형광과 같은 GFP (그림 3C)에 대한 양성으로 내생 형광을 보여주는 따라. ROS 민감한 프로브 음성 대조군 샘플은 처리 절차 및 기술에 의해 유도 된 산화 적 스트레스를 평가하기 위해 포함되어야한다 (도 3c를; 패널 : 제어 -). 상대 FACS의 플롯 정량화 다른 생물은 복제 (그림 3D-E)의 측정 값을 표시하는 막대 그래프로 보여 주었다.

과산화수소 처리시 산화 스트레스 수준 정량 게다가,이 방법은 nrf2a의 morphants 및 각각의 컨트롤 (그림 3 층)에서 우리와 같은 생리 학적 조건에서 산화 스트레스의 수준을 정량에 적용되었습니다.

또한, 미토콘드리아 RO 저희 같은 특정 ROS 민감한 프로브 단세포 ROS 검출 방법을 조합함으로써S 민감한 프로브는 특정 미토콘드리아 타겟팅 계 산화제먼트 (도 3G)의 컨텍스트에서 산화 스트레스를 측정하는 것도 가능하다.

그림 1. 제브라 피쉬 배아에서 ROS의 수준을 측정하기위한 방법의 개략도. Zebrafish의 성인은 적절한 사육 탱크에서 교차된다. 수정란은 다음 요리에 수집 및 배아가 완전히 산화 스트레스의. 유도 제약 치료 나 유전자 또는 물리적 모욕으로 하나, 다른 방법으로 달성 할 수있는 개발을 할 수 있도록 28 ° C에 저장됩니다. 다르게는, 유전자 돌연변이 분석되는 경우,이 인큐베이션을 이동하고 전방으로 이동하는 것이 가능하다. 이 시점부터, 두 가지 방법 다음 진행하는 것이 가능하다. "전체 m에 따르면ount ROS 감지 "방법은 (왼쪽), 제브라 피쉬 배아는 즉시 형광 ROS 민감한 프로브 (1) 다음 형광 또는 공 초점 현미경 (2)로 분석으로 배양된다. "단일 셀 ROS 검출"방법 (오른쪽)에서, 제브라 피쉬 배아는 (1), 형광 ROS 민감한 프로브 (2)와 함께 배양하고 형광 검출 및 정량 (3)에 대한 FACS 분석 단일 세포로 해리된다. "전체 마운트 ROS 감지"방법은 주로 정성 분석, 질적 및 산화 스트레스 수준의 정량적 측정 모두 "단일 셀 기반의"방법 보조금으로 생활 배아에 산화 스트레스를 검출 할 수있다.

72 HPF에서 그림 2. 전체 마운트 ROS-검출 방법의 대표 결과.) 제브라 피쉬 배아 하였다이전 등 Niethammer에 의해 기술로 부상합니다. 일 39. 대표 공 촛점 이미지는 부상 꼬리 지느러미의 상처 여백 프로 산화 종 (ROS)의 축적 (화살촉)를 보여줍니다. 산화 종 일반 ROS 프로브로 검출되었다 (CellROX, 2.5 μM) 20 분 부상 후이 이루어졌습니다. 스케일 바 20 μm의. B) 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아의 상처 마진을 보여주는 대표 공 초점 이미지. 상처가 만들어지기 전에 태아는 90 분 동안 VAS2870 (20 μM) 또는 DMSO로 전처리 하였다. 상처 후 20 분, ROS는 일반 ROS 민감한 프로브 (2.5 μM C​​ellROX)로 검출되었다. 제브라 피쉬 배아에 로테 논에 의한 산화 스트레스를 보여주는 스케일 바 20 μm의. C) 몸 전체의 이미지. 산화 스트레스는 강하게으로 패널 D에 도시 된 배아)의 꼬리 부분에서 발견된다. 로테 논은 주로 skel이 영향을 미치는 미토콘드리아 등의 강력한 억제제이다제브라 피쉬의 문헌 근육 세포. 스케일 바, 180 μm의.

그림 3. 단일 세포 ROS-검출 방법의 대표 결과.) 제브라 피쉬 배아의 전형적인 샘플을 보여주는 대표 FACS의 플롯은 하나의 세포 해리. 살아있는 세포는 FSC-H와 SSC-H 매개 변수에 따라 R1 영역에서 게이트된다. SSC-H : 539 (전압), 1.0 (AmpGain), 모드 : 선형; FSC-H :. 제브라 피쉬 배아의 전형적인 샘플을 보여주는 E00 (전압), 2.1 (AmpGain) B) 대표 FACS의 플롯은 하나의 세포 해리. FACS 분석하기 전에 샘플의 propidium 요오드와 함께 배양 된 (PI, 1 ㎍ / ㎖)을 5 분. 죽은 세포는 PI 형광 (FL2-H 채널)에 따라 R2 지역에 문이있다. FSC-H : E00 (전압), 2.1 (AmpGain), 모드 : 선형, SSC-H : 539 (전압), 1.0 (AmpGain), 모드 : 리근처. 전압 채널 : FL-2 :. 보여주는 613 로그 C) 대표 FACS의 플롯 프로 산화 처리 (H 2 O 2)와 각각의 컨트롤을 실시 제브라 피쉬 배아를 해리. 내피 세포는 GFP 채널에 의해 시각입니다. FACS의 플롯은 UL 및 UR에 산화 스트레스 (ROS)에 의해 영향을받는 모든 셀을 나타냅니다. 부정적인 세포는 낮은 사분면 (LL 및 LR)에 그려집니다. TG (Kdrl : GFP) 48hpf에서 S843 제브라 피쉬 배아는 10 분 동안 제어와 같은 H 2 O 2 (2 ㎜) 또는 H 2 O와 함께 배양 하였다. 프로토콜에 설명 된대로 FACS 분석하기 전에 배아가 처리됩니다. 산화 스트레스에 의해 영향을받는 세포는 일반적인 ROS에 민감한 형광 프로브 (; 2.5 μM C​​ellROX)를 사용하여 감지됩니다. ROS에 민감한 프로브를 배양하지 샘플은 음성 대조군으로 포함되어 있습니다. 각각의 제어와 계 산화 처리를 행한 시료를 비교하면, 셀의 개수가 상부 사분면 (UL + UR)에 그려지는 높다. FACS의 acquis다음과 같이 ition 설정했다 : 전압 채널 : FL-1 : 582 로그; FL-4 :. H 2 O 2 처리 된 배아 및 각각의 제어에 산화 적 스트레스에 의해 영향을받는 셀의 비율 (UL + UR)를 보여주는 410 로그 D) 히스토그램. 측정은 C에 표시된 샘플과 관련이 있습니다. 산화 스트레스에 의해 영향을받는 세포는 일반적인 ROS에 민감한 형광 프로브 (; 2.5 μM C​​ellROX)를 사용하여 감지됩니다. 결과는 H 2 O 2 처리 된 배아와 각각의 제어에 산화 스트레스 (ROS +)의 영향을받는 혈관 내피 세포의 비율 (GFP의 +)를 표시하는 SD. E) 히스토그램 ± N = 2 개의 다른 생물은 복제의 평균이다. 측정은 C에 표시된 샘플과 관련이 있습니다. 결과는 N = 2 nrf2a의 morphants에 산화 스트레스 (ROS +)의 영향을 세포의 비율 (nrf2a MO)를 표시하는 SD. F) 히스토그램 ± 다른 생물 복제하고 각각의 컨트롤의 평균이다24 HPF에서 (CTRL MO). 72 HPF에서 DMSO), 10 μM) 및 각각의 컨트롤 (Ctrl 키;. 결과 처리 된 배아에서 미토콘드리아 산화 스트레스에 의해 영향을 세포의 비율 (로테 논을 보여주는 SD G) 히스토그램 ± N = 2 개의 다른 생물은 복제의 평균이다. 단일 세포로 배아의 해리 후에, 미토콘드리아의 산화 적 스트레스 (ROS 미토콘드리아 +)는 특정의 미토콘드리아 프로브 (; 5 μM MitoSOX)로 측정 하였다. 결과는 SD ± N = 3 다른 생물은 복제의 평균이다.

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