여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.
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이 논문에서
요약
초록
반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준은 산화 적 스트레스 조건을 향한 세포의 산화 환원 상태의 변화를 유발할 수있다. 이 상황은 분자 (지질, DNA, 단백질)의 산화를 일으키는 원인이되고 세포 죽음에 이르게한다. 산화 스트레스도 영향 당뇨병, 망막 병증, 신경 변성, 암 등 여러 가지 병적 인 상태의 진행. 따라서, 단일 세포 수준에서뿐만 아니라 전체 유기체의 맥락에서뿐만 아니라, 산화 적 스트레스 조건을 조사 할 수있는 도구를 정의하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 연구를 수행하고 생체 내 산화 스트레스를 측정 할 수있는 프로토콜을 제공하는 생체 시스템의 유용한 제브라 피쉬 배아를 고려합니다. "나는) 산화 스트레스의 질적 측정을 위해"전체 배아 ROS-검출 방법 "및 II) : 형광 ROS 프로브 및 제브라 피쉬의 형질 전환 형광 라인을 활용, 우리는 생체 내에서 산화 스트레스를 측정하는 두 가지 방법을 개발산화 스트레스의 정량적 측정을위한 단일 셀 ROS 검출 방법 ". 여기서, 우리는 산화제 에이전트 및 생리 학적 또는 유전 적 방법으로 조직의 산화 스트레스를 증가시켜 이러한 절차의 효과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 앞으로 유전자 스크린에 대한 의무이며 이러한 신경 장애 및 암과 같은 산화 스트레스 관련 병리의 동물 모델에서 ROS의 주소 원인 - 결과 관계를하는 데 도움이됩니다.
서론
산화 스트레스는 특별히 불평형 세포 산화 환원 상태로부터 발생 조건으로 정의된다. 일상적으로 세포 내부에서 발생하는 복잡한 산화 환원 반응은 세포의 산화 환원 상태를 결정합니다. 산화 환원 반응 감소와 분자 (즉, 산화 환원 반응)의 산화를 생산하는 생체 분자의 원자 사이의 전자의 이동에 구성되어있는 모든 화학 반응으로 구성되어 있습니다. 이러한 반응은 극단적 인 구조 불안정과 이웃 생체 분자와 교환 불균형 전자의 자발적인 활성화를 특징으로 전자 활성 종 (즉, 프로 산화 종)에 의해 촉매된다. 이러한 불규칙한 반응은 DNA 손상, 단백질의 카르 복 실화, 지질의 산화로 발생, 결국 세포의 죽음 1로 이어집니다. 산화 스트레스의 증가 수준은 노화와 다른 병적 인 상태 2의 진행과 관련이있다. 산화 스트레스가당뇨병과 심혈관 질환 3,4 혈관 변경에 대한 책임을 져야하는 것으로보고되었습니다. 또한 알츠하이머 병에서 신경 변성에 중요한 역할을하고 파킨슨 병 5. 또한, 산화 스트레스는 암 진행 및 전이성 이벤트 6,7 지배하는 중요한 인자로 입증되었다. 또한, 염증과 면역 반응이 유도 및 추가 지원의 산화 스트레스 8있다.
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프로토콜
인스 트루먼 트와 일 솔루션 1. 준비
- 물고기 물 솔루션을 준비합니다. 증류수 50ml에 바다 염 인스턴트 오션 '2g을 용해시켜 스톡 용액을 만든다. 물고기 물 (60 ㎍ / ㎖의 바다 소금 최종 농도)를 사용할 준비가 준비하는 1 L의 증류수에 주식 물고기 물 1.5 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 물고기의 물을 사용할 준비를 압력솥. 이 용액을 제브라 피쉬 배아 매체로서 사용된다.
- 배아 설치에 대한 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 멸균 물고기 물 50 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹여. 저어 접시에 자석을 사용하여 용해를 촉진한다. 분말의 완전 용해 몇 시간이 필요할 수 있습니다. 작은 튜브에 선명도와 나누어지는에 대한 솔루션을 확인합니다. 개월 -20 ° C에서 보관 및 사용에 분주을 해동. 사용하기 전에 5 분 950 XG에 메틸 셀룰로오스를 원심 분리기. 분취 량의 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
- tricaine / 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 (M)의 50 ㎖를 준비100 ml의 물에 tricaine 200mg을 용해 및 트리스 - 염산 1 M (pH가 15)를 사용하여 7.0의 pH를 조정 순서 ethanesulphonate 염 (원액). 더 이상 30 일 이상 4 ° C에서 콘텐츠를 저장합니다. 주의 : tri....
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결과
여기에 기재된 방법을 적용하여, 우리는 쉽게 측정 할 수 있고, 제브라 피쉬 배아 조직에서 산화 스트레스 (ROS 및 레벨)을 검출한다. 성인 제브라 피쉬를 횡단 한 후, 달걀을 수집하고 72 시간 게시물 수정 (HPF)로 28 ° C에서 개발하기 위해 사용할 수 있습니다. 강한 친 산화제 시약 배아 1) 치료 또는 조직 상해 후에 2) 촉진 ROS 형성 : 산화 스트레스를 유도하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 제안한다.
과산화수소 (H 2 O 2), 일반 휴대 ROS 형성 제로서, 그리고 로테 논, 특정 미토콘드리아 ROS 드라이버로 : 첫 번째 방법은 특정 필요에 따라 서로 다른 두 가지 시약을 사용. 로테 논은 규제 완화는 산화 스트레스 (41)의 원인이되는 등, 복잡한 I의 억제제이다.
두 번째 방법에서, 우리는 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처를 작.......
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토론
중요한 단계
본원에 기재된 제브라 피쉬 배아 산화 스트레스 탐지하는 절차는 두 가지 다른 방법을 포함한다. 단일 셀 ROS 검출 방법 (도 1)보다 구체적인 정량적 측정을 허용하는 동안 전체 마운트 ROS 검출 방법은 주로 ROS 검출을위한 정성 분석이다. 두 가지 방법은 제브라 피쉬 배아에 생체 활성 산소 검출을 평가하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 그러나, 그들은 모두 몇 가지 중요한 단계를 제시한다.
방법 I에 관련된 중요한 단계
전체 마운트 ROS-검출을위한 첫 번째 방법은 쉽게 생활 배아 (그림 2)의 모든 조직에 산화 스트레스를 감지하는 큰 장점이 있습니다. 배아 조직에 프로브 1) 투과성 2) 프로브 독성 및 3) 번째 : 그러나 고려되어야하고 상기 분석의 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 세.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Massimo Santoro 연구실의 지원은 HFSP, Marie Curie Action, Telethon 및 AIRC에서 제공합니다. 원고를 비판적으로 읽어준 다프네 게이스(Dafne Gays)와 에밀리아노 파니에리(Emiliano Panieri)에게 감사한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 과산화수소 용액 | SIGMA | 516813 | 희석액을 보관하지 마십시오 |
| Hank's Balanced Salt Solution 1x | GIBCO | 14025 | |
| 메틸 셀룰로오스 | SIGMA | M0387 | |
| Instant Ocean 수족관 바다 소금 혼합물 | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
| Tricaine | SIGMA | A5040 | |
| Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
| Mitochondria 특정 ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | 13 μ DMSO |
| Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | DMSO에서 5mM 재고 용액을 준비합니다. |
| 디메틸 설폭사이드 | SIGMA | D2650 | |
| VAS2870; 3-벤질-7-(2-벤조옥사졸릴)티오-1,2,3-트리아졸로(4,5-d)피리미딘 | EnzoLifeScience | BML-EI395 | 는 DMSO에 분말을 용해시킵니다; 물고기 물에 희석석 |
| Propidium 요오드 | 분자 프로브 (Life Technologies) | P3566 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | 분자 프로브 (Life Technologies) | A1310 | |
| Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref | : Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); 고바야시 et al.; 2002 (PMID:12167159) |
| 콜라겐 분해 효소 P | ROCHE | 11213857001 | 분말을 100mg/ml로 멸균 HBSS에 용해시킵니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
| 태아 소 혈청 | GIBCO | 10082-147 | |
| 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | ROCHE | 1ml의 물에 한 정제를 녹여라 | |
| 0.5% 트립신-EDTA (10배), 페놀 레드 없음 | GIBCO | 15400-054 | 사용 전에 1x 작업 용액을 준비하십시오 |
| . 복합 현미경 | |||
| 실체 현미경 | Nikon | AZ100 | |
| 카메라 | ZEISS | AxioCamMRm | |
| 형광 이미지 획득을 위한 | ZEISS | ZEN 2011 | |
| 형광 활성화 세포 분류기 | BD FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| FACS 튜브 | BD | 342065 | |
| 멀티웰 플레이트 | BD Falcon | 353047 | |
| 멸균, 비 처리 페트리 접시 90 mm | VWR | 391-1915 | |
| 컨 포칼 현미경 | Leica | Leica SP5 |
참고문헌
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
- Chen, A. F., et al.
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재인쇄 및 허가
