재생 연구를위한 고조파 나노 입자

요약

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

초록

이 시각 실험에서, 프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자 (HNPs)와 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 후자는 최근 다중 광자 이미징을위한 생체 시료 라벨 도입 프로브의 새로운 가족입니다. HNPs는 여기 파장에 아무런 제한이 제 고조파 발생의 비선형 광학적 프로세스에 의해 여기 광의 주파수를 두배로 할 수있다.

다 광자 (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터로 hESC의 차별화를위한 방법론을 기반으로 상세하게 제공됩니다. 특히, 3D로 심장 조직을 구타의 3D 모니터링 동안 고립 HNPs의 강렬한 두 번째 고조파 (SH) 배출을 극대화하는 방법에 대한 증거가 표시됩니다. 3D 변위 패턴을 검색 결과 이​​미지의 분석은 또한 상술된다.

서론

비선형 현미경 시스템은 고유의 입체 단면 처리 능력 덕분에, 점점 근적외선의 이광자 흡수 밴드를 가진 광 안정 형광체에 대한 수요를 유발 하였다. 단지 지난 몇 년에, 형광 기반의 라벨 (염료, 양자 점, 최대 변환 나노 입자), 다른 이미징 방법은 레이블과 같은 본질적으로 비선형 나노 입자의 새로운 가족의 사용을 악용 한, 즉 개발을 보완하는 특히 다 광자 현미경을 위해 개발 된 고조파 나노 입자 (HNPs). 무기 noncentrosymmetric 결정에 따라 이러한 레이블은 여기 주파수의 SH를 생성 광학 대비를 발휘 : 근적외선 펄스 여기 빛의 일부를 변환하여 예를 볼 푸른 빛으로 (λ = 800 nm의) (λ / 2 = 400 nm의) . 최근 과거에 여러 저자는 철 요오드 철 (IO를 포함하여, 다른 재료를 테스트 한 _{3) 3 ^일, 칼륨 니오 베이트 (KNbO ^3)이, 니오브 산 리튬 (의 LiNbO3) ^3, 티탄산 바륨 (BaTiO3를) ^4,5, 칼륨 티 타닐 포스페이트 (KTiOPO4, KTP) ^6-8, 및 산화 아연 (ZnO의 ) ^5,9,10. 형광 프로....}

프로토콜

1. 문화와 인간 ESC의 확장

1. 준비 녹아웃 DMEM을 함유하는 (PM이라고 함) 세포 증식 배지는 20 % 녹아웃 혈청, 1 % MEM 비 필수 아미노산, 1 % L-글루타민 200 mM의 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올이 보충.
2. 8 ML의 PM 매체에서 인간의 ESC (hESC의)를 해동 및 DMSO 첨가 된 동결 매체를 폐기 115 XG에서 그들에게 5 분 원심 분리기.
3. (만 24 시간 배양)를 해동시 세포 사멸을 방지하고 세포 생존을 개선하기 위해 10 mM의 바위 억제제를 포함하는 PM 매체의 1 ML을 추가합니다.
4. 능성의 유지에 필요한 농도 (4-10 NG / ㎖)에서 PM에 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)를 추가한다.
5. 이전 / ^㎠ 2 × 10 ⁴ 세포의 농도로 도금 피더 세포 포피 조사 인간의 hESC의 (γHFF) (그림 1A)를, 플레이트.
6. 필요한 경우 C의 일부를 제거, 중간 매일 변경olonies는 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인 차별화하기 시작했다.
7. 효소 주 통로 식민지 번 :
   1. 매체를 제거하고 2....

결과

이전 촛점 촬상함에 고해 활성을 평가하기에, PTFE 필터의 비선형 광학 응답의 신중한 특성화 고농도 (1 ㎎ / ㎖)에서 단독으로 또는 HNPs의 존재 하에서도 수행 하였다. ⅰ) 상기 베어 기판 이광자 여기 형광이 미약하며 관련 생물학적 시료 측정을 방지 할 수 있고, ⅱ) 절연 HNPs로부터 SH 방출 쉽게 에피 검출 모드에서 상기 기판을 촬상하여 취득 할 수있다 : 그것은 것이 보장되었다 (그림 2). 목표는 3 차원 변위의 정량화에 대한 참조 컨트롤을하는 것이 었습니다.

그림 3에서, HNP-표지 심장 구조와 교환 사채가 표시됩니다. 강렬한 푸른 SH 명소 격리 HNP에서 줄기 동안 빨강 (그림 3A), 노란색 (그림 3B 및 3C) 및 녹색 (그림 3D) 색상, NADH의 형광도에 해당합니다. 그것은 포.......

토론

줄기 세포 연구에 나노 기술의 응용 프로그램은 비교적 새로운하지만 빠르게 확장 필드입니다. 주제에 대한 다양한 리뷰 기사에서 지적한 바와 같이, 나노 입자의 사용은 적어도 창조의 단백질 및 유전자의 세포 내 전달에, (시험 관내 및 생체 내에서 모두) 추적 세포에 이르기까지 다양한 연구 작업을 수행하기 위해 적용 할 수있는 특정 분화 우선 자극 / 억제를위한 생체 모방 세포 환경은 ^{19, 20를} 경로. 적외선 음원의 사용 가능성을, 형광 기반 기술에 대하여 증가 된 투과 깊이에 이르게되지만이 프로토콜에서 설명한 방법은, 광 추적 및 제한된다; 광학 영상은 몸 전체로 확장 될 수 없으므로 자기 검출부 ^(21)에 의해 보완 될 것이다. 이전 출판 작업은 몇 가지 방법이있는, 심장 세포 클러스터의 구조와 움직임을 평가했다형광 염료 ^(22), 양자 점 ^{(23, 24)에} 의해 cluding에 라벨은 슈퍼 성체의 산화철 ^나노.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
현미경 인큐베이터	OKO LAB	UNO 패키지(상단 스테이지)	37 ° C, 5% CO2, 보습
다광자 현미경	Nikon	AR1-MP
빠른 스캐닝, 네 개의 비광증전자 디스캔 검출기
필터 SHG 및 자가형광	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
현미경 대물렌즈	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λ S, 나노 크리스탈 코트
Rhock 억제제	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout 세럼	Invitrogen	10828
MEM 비필수 아미노산	Invitrogen	1140
L-글루타민 200 mM	인비트로젠	25030
페니실린-스트렙토마이신	인비트로젠	15140
&베타;-메르캅토에탄올	시그마	M7522
콜라겐분해효소 IV	Gibco	17104-019
롤러 스크레이퍼 도구	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell 시스템	StemCell Technologies	27845
Hyclone 세럼	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-웰 플레이트	Falcon	353046
24웰 플레이트	Nunclon	142475
폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터	Millipore	NA76/25
인서트	Millipore	PICM03050