우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 - 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.
서론
이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 4,5 개발되어 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 준비
동물 절차
동물 윤리위원회의 승인을 받아야하고 바이러스에 작업에 대한 제도적 지침을 따르 HuESC 및 / 또는 IPSC (해당되는 경우)뿐만 아니라, 마우스 처리, 마우스 배아를 획득, 마우스 수술을 수행. 시간 제한 교배를 들어, 플러그의 날 배아 일 (E) 0.5 / 0.5 일 후 교미 간주됩니다.
- 미세 주사 바늘 :
전 자궁 미세 주입 들어, 1 또는 10 μm의 내부 팁 직경이 각각 DNA 나 세포를 주입하는 날카로운과 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝 모양을 얻을 수있는 피펫 풀러 / beveller를 사용하여 유리 피펫 (1.2 mm 외부 직경 붕규산 모세관)을 당깁니다. 초음파 매개 주사의 경우, 사용 35분의 50 μm의 외경 / ID의 팁 1.14 mm/0.53 mm의 내부 / 외부 직경 (OD / ID)를 가지고 멸균 바늘을 사용자 정의. - 실리콘 가득 배양 접시 :
사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 실리콘을 준비합니다. 기입~ 1cm의 탄성 중합체 층을 깨끗한 유리 60mm 직경 페트리 접시. 공기 방울을 피하십시오. - 상품 :
절차를 수행하는 동안 사전에....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
상기 주입 프로토콜을 사용하여, 세포를 표지 및 / 또는 마우스 배아 심장에 주입 될 수있다. 개념의 증거로 몇 가지 예는 주입 프로토콜과 생체 AVC 이식편, 고립 된 심장, 또는 전체 배아 문화 (그림 1) 결합 된 표시됩니다.
도 1은 세포 주입 전의 배아의 제조를 나타낸다. 난황 (그림 1A)의 무결성을 유지하면서 E9.5의 배아의 탈락에서 제거됩니다. 난황은 바로 마음 (그림 1B) 위에 열립니다. 피펫은 (도 1C)에 접근하고 세포가 주입된다. 마음은 그것의 모양 (그림 1D)를 유지하고 구타 남아있다.
이러한 전이 (EMT)를 중간 엽하는 상피 세포로 발달 생물학에서 더 구체적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 E9.5.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 - E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커니즘에 윤곽을위한 개념 증명을 제공합니다. 가장 중요한 것은, 이러한 프로토콜은 적절한 배아 환경, 지금까지 충족되지 않은 문제에서 인간의 배아 세포 또는 huESC 유도체 주입 세포의 이동과 운명을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다.에서 포화와 (그림 3의 심 외막 세포 등) 생체 표지 또는 염료 또는 바이러스의 희석을 제한하는 것은 단기뿐만 아니라 장기적 B의 셀 (하위) 인구의 혈통 추적 가능.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 재단 Leducq (승모판)과 직원은 국립가이 연구에 자금을 지원을 위해 라 공들인 (ANR Specistem을 부여)을 부어 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Setups/하드웨어 | |||
| 40 MHz 변환기 | VisualSonics | MS550S | |
| 마이크로인젝터 | VisualSonics | ||
| 마이크로인젝터 | Eppendorf | 5242 | |
| 마이크로매니퓰레이터 | Eppendorf | 5171 | |
| 시스템 | VisualSonics | ||
| 로테이터 | |||
| 인큐베이터 | 5% CO2, 37 ° C | ||
| 실체현미경 | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | 세계 정밀 기기 | KTW-120-6 | 1.2-μ m 외경 |
| 피펫 풀러 | Sutter | 모델 P87 | |
| Microinjection 바늘 | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, 50/35 μ m OD/ID 팁 |
| 해밀턴 주사기 | |||
| 페트리 접시 | 10cm 지름 | ||
| 미네랄 오일 | Sigma | M8410 | |
| 실리콘 막 | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| 제모제 | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| 전극 젤 (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| 초음파 젤 | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 식염수 0.05-0.1 mg / kg |
| < 강> / 강>< | |||
| 실리콘 엘라스토머 | 다우 코닝 | 실가드 184 | |
| 유리 페트리쉬 | 정밀 과학 도구 | 직경 60mm | |
| 곤충 핀 | 정밀 과학 도구 | 26002-20 | |
| < 강>미디어 및 배양 시약< / 강> | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 미디엄 | 시그마 | M7167 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | 고포도당 및 50% 쥐 혈청 |
| M16 매체 | Sigma | M7292 | |
| 쥐 혈청 | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| 산소 40% | 아 배양 배지에 산소를 공급하는 데 필요한 | 공기 액체 | |
| 태아 송아지 혈청 | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| 콜라겐 유형 I | BD | 354236 | 외식 배양 배 |
| Dutcher /Orange | 131020 | ||
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. -20 °C에 보관하십시오. 사용하기 전에 식염수에 1:100-200을 희석하십시오. |
| PGK-GFP 발현 렌티바이러스 | ~8E9 형질전환 단위/ml DMEM | ||
| 리포펙타민 2000 | Life Technologies | 11668019 |
참고문헌
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
