방법 논문

쥐에서 심장 마비에 대한 세포 기반 치료 : 심근 경색에 대한 두 개흉술 및 세포 및 Biomatrix의 심 외막 이식

DOI:

10.3791/51390

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2014년 9월 22일

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1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

이 논문에서

요약

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설치류 모델에서 LAD 결찰에 의한 심근 경색을 치료하는 biograft의 주입은 통상적으로 두 개의 심장 절개 수술을 요구하고있다. 사망률 감소 및 세포와 연관된 고체 및 젤라틴 biomatrices의 정착을위한 최적의 조건을 제공하기 위해, 최소 침습 절차가 개발되었다.

초록

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심장 세포 치료는 세포와 관련된 바이오 물질의 관심과 주입을 증가 얻고있다 심근 세포의 전달을 최적화하는 중요한 문제가되고있다. 심근 경색의 설치류 모델 (MI) 동맥 (LAD) 결찰은 일반적으로 개흉술을 통해 수행 된 내림차순 좌전 구성된; 흉골 절개를 통해 초 오픈 심장 수술은 전통적 치료의 심 외막 응용 프로그램에 대한 수행되었습니다. LAD 결찰 모델의 설명 때문에, 수술 후 사망률은 그러나 두 번째 수술이 중요한 남아있다, 35~13% 떨어졌다. 통증과 감염을 수술 후 회복을 개선하고 줄이기 위해 최소 침습 수술이되게됩니다. 두 thoracotomies는, LAD 결찰에 대한 초기 치료 한 외막 투여 제를 실시 하였다. 고체 또는 젤 타입의 행렬과 관련된 세포로 구성된 Biografts는 경색 아칸소에 적용되었다개. 이 6 주 후에 실시 심 초음파 검사에 의해 확인으로 LAD 결찰은 심장 기능의 손실이 발생했습니다. Goldner 심장 섹션에서 수행 트리 크롬 염색 전층 흉터 형성을 확인했다. 제 1 및 제 2 수술은 덜이 10 %, 수술 후 사망률되었습니다.

서론

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19 세기 말부터, 심혈관 질환은 선진국에서 번호를 하나의 연쇄 살인범을 유지하고있다. 그 중에서도, 관상 동맥 질환은 주요 원인을 나타낸다. 심근 경색 (MI)과의 급성기 결과는 점진적으로 만성 위상 및 중증 심부전으로 개발 부적응 리모델링옵니다. 최근 상당한 기술과 치료의 발전에도 불구하고, 때문에 심장 마비의 진행에 이환율과 사망률은 여전히 하나를 성장하고있다. 이러한 맥락에서, 세포 요법은 심부전 향해 질병의 진행을 정지하고 심근 최근에 식별 된 재생 능력을 자극하는 새로운 치료 옵션으로 증가 관심을 얻고있다. 실험 및 임상 연구는 다양한 세포 유형의 심장 이식 후 얻은 유익한 효과의 강력한 증거를 제공하고 있습니다. 주요 결과는 개선 cardi 포함교류 수축 기능, 좌심실 재 형성을 감소 경색 크기를 감소하고, 경색 지역에 혈관 밀도를 증가했다. 그러나, 세포 주입 후 세포 수가 낮은 유지율은 중요한 단점이 남아 있었다. 셀 전달이의 향상을 biomatrix와 세포의 협회는 최근 연구자 및 임상 이익을 육성했다.

관상 동맥 (LAD)를 좌전 하행의 결찰 전층 경색과 성숙한 흉터 결과 작은 동물 모델에서 MI에 대한 기준 방법입니다. MI의 만성 단계에 적용 세포 치료는 두번째 수술 적 치료가 필요합니다. 중간 흉골 보통 세포 또는 biografts의 외막 주입 심근 내 주입을 허용하도록 수행된다. 이러한 침습적 수술은 사망률, 수술 후 회복 시간, 통증, 감염의 위험을 증가시킨다. 여기에 제시된 최소 침습 접근 방식뿐만 아니라 그러한 편견을 방지 할뿐만 아니라 O를 제공합니다치료 응용 프로그램에 대한 마음의 ptimal 접근성. MI 및 젤 타입 biomatrix과 관련된 세포의 심 외막 이식 왼쪽 늑간 thoracotomies를 통해 심장 박동 상태에서 수행됩니다.

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프로토콜

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참고 : 루이스 남성과 여성 쥐, 200~220그램이 표준 실험실 조건 (12 시간 빛과 어둠 사이클, 광고 무제한으로 물과 음식, IVC 케이지)에서 보관 하였다. 모든 동물은 동물 보호에 FELASA와 스위스 법의 권고 사항을 준수하여 처리 하였다.

1 셀 준비 : 골수에서 중간 엽 줄기 세포 분리

  1. 5 분 동안 유도 챔버 내에 5 % 이소 플루 란 및 2 O 5 L / 분으로 래트를 마취. 마취 시스템에 연결 코 콘으로 동물의 주둥이를 놓습니다. 진정 작용을 확인하기 위해 발가락이나 꼬리 핀치를 수행합니다.
  2. 엉덩이에 발목으로부터 피부를 절단하여 가위로 다리에서 피부를 제거합니다. 근육을 제거하고 동물 일어난 과다 출혈에 대한 대퇴 동맥을 잘라. 고관절을 노출하고, 대퇴골의 머리를 탈구. 또한 대퇴골 머리를 손상하지 않는 것이 중요하다. 50 ML 플라스틱 튜브에 멸균 PBS에서 뼈를 놓습니다.
  3. 모든 뮤 제거을 깨지 않고 뼈 scles과 인대. 참고 : 뼈가 에탄올로 세척 용액 또는 오염의 결합을 피하기 위해 그대로 유지하는 것이 중요합니다. 5 분 동안 70 % 에탄올에서 박리 뼈를 헹군다.
  4. 멸균 층류 후드에서 가위로 뼈의 양쪽 끝을 잘라. 뼈 말단에서 멸균 PBS를 주입하여 골수 플러시. 15 ML 튜브에 골수를 수집합니다. 300 × g으로 원심 분리기 7 분.
  5. 상층 액을 제거합니다. 적혈구 용해 버퍼의 3 ML에서 펠렛을 일시 중단합니다. 300의 X g에서 7 분 동안 다시 회전하기 전에 실온에서 1 분간 정지를 품어. 150ml의 배양 플라스크에서, 무균 세포 배양 배지 (395 ml의 IMDM 배지, 5 ㎖ 펜 / 패 혈성, 100 ㎖의 FBS)를 추가하고 세포를 시드.
  6. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 두번째 일 매체 변경합니다.
    1. 에 원하는 수량이 얻어 질 때까지 2~3주마다 초 일 매체 변경을 수행합니다.
    2. 또한, 씨앗에 의해 biograft 준비필요한 3 곳 바와 같은 고체 기질 상에 세포를 보내고.
  7. 심장 이식의 날, 세포를 준비하거나 심 외막 응용 프로그램 전에 biograft을 수확.
    1. Accutase 세포 분리 용액을 사용하여 세포를 수집한다. 세포를 계산합니다. 원하는 세포 량을 얻기 위해 계산 된 세포 현탁액의 부피가 1.5 ml의 원심 분리 관을 채운다. 300 XG에 7 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 제거합니다.
    2. 또한, 멸균 PBS 린스, 세포 배양 매체로부터 biograft을 수확, 혈청없이 신선한 문화 매체에 보관하십시오.

2 첫 번째 개흉술 및 LAD 내고

  1. 쥐의 무게를 측정. 37 ° C에서 가열 패드의 전원을 켭니다. 5-7 분 동안 유도 챔버 내에 5 % 이소 플루 란과 5 L / 분으로 100 % O 2를 가진 쥐를 마취. 진정 작용을 확인하기 위해 발가락이나 꼬리 핀치를 수행합니다. 가열 패드에 쥐를 놓습니다.
  2. 14 동물 삽관G 정맥 카테터. 2.5 L / 분의 산소, 2.5 %의 이소 플루 란, 2 ML의 호흡량, / 분 90 호흡 호흡 주파수에 대해 프로그래밍 설치류 인공 호흡기에 관을 삽입 카테터를 연결합니다.
  3. 0.1 ㎎ / ㎏에서 부 프레 노르 핀 용액을 준비합니다. 피하보기 용액의 3 분의 1을 주입. 가슴의 왼쪽 부분을 면도. 1 % Betadine 용액으로 소독.
  4. 네 번째 늑간에서 흉골에 수직으로 피부를 절개. 3 흉부 근육의 레이어 (pectoralis 주요 오름차순 pectoralis 및 외부 경사의 pectoralis)를 분리합니다. (갈비뼈 4와 5 사이) 네 번째 늑간 공간을 엽니 다.
  5. 갈비뼈를 확산하고 마음을 노출하는 작은 트랙터를 사용합니다. 조심스럽게 심낭을 엽니 다. 찾아 아트리움 아래 7.0 봉합 4mm와 관상 동맥 (LAD)를 좌전 하행를 결찰.
  6. 3.0 봉합사를 사용하여 두 개의 바늘로 늑간 공간을 닫습니다. 흉골에서 근위 및 원위이 봉합을 배치합니다. 첫째, t말단 봉합을 ighten. 가슴을 부풀게하고 기흉을 피하기 위해 2 초 동안 호흡기 배기 호스 클램프. 두번째 봉합사를 조입니다. (더 봉합이 필요하지 않습니다) 다시 제자리에 근육 층을 배치합니다. 5.0 봉합과 피부를 닫습니다.
  7. 1 % Betadine 용액으로 소독 봉합사. 부 프레 노르 핀 용액을 나머지 주입. 마취 시스템의 전원을 끄십시오. 삽관 카테터를 제거합니다.
  8. 1-2 시간 동안 따뜻한 램프 아래에있는 케이지의 쥐를 유지합니다. 케이지 온도계를 유지하고, 가열을 통해 피하기 위하여 따뜻한 램프와 케이지 사이의 거리를 제어한다. IVC 단위로 쥐를 돌려줍니다. 피하 프레 놀핀 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 포스트에게 주사 -operatively 48 시간마다 6-12 시간.

두 번째 개흉술 치료 비아의 3 심 외막 관리

  1. 반복 2.1-2.3 단계를 반복합니다.
  2. 다섯 번째 늑간에서 흉골에 수직으로 피부를 절개. 3 층을 분리흉부 근육의 (pectoralis 주요 오름차순 pectoralis 및 외부 경사의 pectoralis). (갈비뼈 5와 6 사이) 다섯 번째 늑간을 엽니 다.
  3. 갈비뼈를 확산하고 마음을 노출하는 작은 트랙터를 사용합니다. 일부 고수가 있다면, 신중하게 미세 집게로 제거합니다.
  4. 합자 아래 창백한 영역으로 나타납니다 경색 영역을 찾습니다. 참고 : 필요한 경우, 더 나은 좌심실를 시각화 정점에 삽입 봉합 10cm 조각 (7.0)를 사용합니다. 마음을 노출 클램프에 의해 느슨하게 유지 봉합에 부드럽게 잡아 당깁니다.
  5. 다음 처리 중 하나를 적용 :
    1. 심장의 표면에 biograft를 놓습니다. 10 분 동안 실온에서 데워진 미리 채워진 피브린 실란트 주사기를 사용한다. 25 G 루어 바늘을 사용하여 biograft에서 피브린 실란트의 드롭 (50 ~ 100 μL)를 적용합니다. biograft가 완벽하게 밀봉되어 있는지 확인합니다.
    2. 대안 적으로, 표면에 O 피펫 팁과 수집 된 세포 펠렛을 적용합자 아래 창백한 영역으로 마음을 바. 세포 펠렛에 피브린 실란트의 드롭 (50 ~ 100 μL)를 적용합니다.
  6. 정점에서 봉합의 조각을 제거합니다.
  7. 반복 2.6-2.8 단계를 반복합니다.

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결과

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모든 동물은 thoracotomies 후 1 시간 이내에 회복되었다. 상처 치유가 빠른이었다. 어떤 감염이나 부종은 관찰되지 않았다.

이중 좌측 개흉술은 심장에 최적의 액세스에게 (그림 1)을 허용했다. 통증 및 수술 후 사망률이 낮았다. 동물은 수술에서 빠르게 회복하고 (그림 2) 체중이 증가. 카플란 마이어 생존 %가 첫번째 개흉술에 대한 96 %이었다. (104) 위에 4 개의 쥐 초 개흉술을 통해 24 시간 다음과 같은 치료 응용 프로그램 내에서 사망했다. 동물 제 개흉술하지만 치료 (가짜)을 수신 100 %, MSC에 대한 96 %와 피브린 실란트 기, 또는 동물이 MSC를받은 86 %까지 변화 카플란 - 마이어 생존 %는 직접 심근 (도 3) 내에 주입.

M-모드 심 초음파 평가는 2 주 LAD 결찰은 44 ...

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토론

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LAD의 영구 결찰은 돌이킬 수없는 심근 손상이 발생합니다. 먼저 동물 모델은 그 이후 만성 MI에 대한 표준과 적합한 모델로 간주되어왔다. 1960 4에 기재 하였다. 그 안정성과 재현성 MI 5에 대한 치료의 실험 평가를 허용했다. 초기 설명을 다음과 같은 개선 된 절차는 35-13% 6의 수술 사망률을보고 하였다.

예상대로, LAD 결찰은 이주 내에 관찰 장애인 심장 기능을 유도. 심장 기능의 추가 감소는 육주를 기록 전층 섬유 성 반흔과 연관이 있었다. 또한, LV의 팽창을 포함 LV 리모델링 명확 육주은 결찰을 게시 관찰되었다.

제 1 및 제 2 수술 이주 사이의 간격이 선택되었다. 그들은 일주는 perfor 할 후도 풍부했다로이 상태에서, 둘째 개흉술은 adherences의 부재에 의해 촉진되었다최적의 조건에서 mA 두번째 수술. 또한, 이주 치료 응용을위...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 교수 헨드릭 Tevaearai 및 연구의 초기 부분에 대한 재정 지원에 대한 외과학 교실을 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Polysorb 3-0 봉합사CovidienUL 204
Polysorb 5-0 봉합사CovidienUL 202
Surgipro II 7-0 봉합사CovidienVP904X
카테터 Insyte 14 GBD381267
Inspira Advanced Volume Controlled VentilatorHarvard Apparatus557058
Dumont #7 ForcepsFST Germany11274-20
Fibrin SealantBaxter1501441TISSEEL 접착제, 냉동 -20 ° C
Castroviejo Eye SpeculaHarvard Apparatus72-8925립용 리트랙터로 사용
IMDM GlutaMAXGibco31980
Pen/StrepGibco15140
FBSPAA 클론          A15-101
뼈 가위미세 과학 도구16044-10
적혈구 용해 용액Gentra SystemsD-50K1
Accutase 세포 분리 용액줄기 세포 기술7920

참고문헌

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