센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

요약

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

초록

몇 년 전, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)의 설립은 생물 의학의 새로운 시대를 열었다. 인간 유도 만능의 잠재적 인 사용은 인간의 유전 질환의 모델링 발병 유전자 보정 후자가 세포 치료, 환자 별 증상과 관련된 세포의 소스를 제공함으로써 맞춤 약물 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 인간 유도 만능 생산 후 남은 프로그래밍 인자 유전자의 발현을 제거하는 등의 극복하는 여러 장애물이있다. 더 중요한 것은, 미분화 된 인간 유도 만능 잔류 유전자 발현 적절한 분화를 방해하고 질병 관련 체외 표현형에서의 해석을 잘못지도 할 수 있습니다. 이러한 이유와 함께, 통합 - 무료 및 / 또는 유전자가없는 인간 유도 만능는 아데노 바이러스, 피기 백 (PiggyBac) 시스템, minicircle 벡터, 에피 솜 벡터, 직접 단백질 전달과 같은 몇 가지 방법을 사용하여 개발 및 mRNA의 합성되었다. 그러나 reprogra의 효율성통합없는 방법을 사용하여 mming하는 것은 대부분의 경우 매우 낮습니다.

여기서, 우리는 센다이 바이러스 (RNA 바이러스) 기반 프로그래밍 시스템을 사용하여 인간 유도 만능을 분리하는 방법을 제시한다. 이 프로그래밍 방법은 일관된 결과 및 비용 효율적인 방식으로 고성능을 나타낸다.

서론

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 약물 검사에 대한 질병 모델링을위한 잠재적으로 유용 할 수 있고, 질병 및 조직 손상을 치료하는 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 자기 갱신 시험 관내 및가 능성에 대한 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 인간 배아 줄기 세포 때문에, 면역 학적 종양학과 윤리적 장벽의 세포 대체 요법에 대한 제한이 있고, 질병 관련 유전자를 연구, 질병 특정 인간 배아 줄기 세포는 착상 전 유전자 진단 (PGD) 방식을 통해 분리 할 수​​ 있지만, 여전히 기술적으로 도전 및 배아 기증은 매우 드물다. 이러한 문제는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 개발을 주도하고있다 줄기 세포 생물학의 진행과 관련이 있습니다.

인간 유도 만능은 유 전적으로 인간의 성인 체세포에서 프로그램이 다시 그들에게 예 : D 재생 의학을위한 유용한 소스를 만드는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 만능 줄기 세포와 같은 기능을 품고있다양탄자 발견, 질병 모델링 및 환자 특정 방식으로 ^1,2의 세포 치료.

지금까지 바이러스 매개 (레트로 바이러스 및 아데노 바이러스)를 포함하여 인간 유도 만능를 생성하는 여러 가지 방법, ^3, 비 바이러스 매개 (BAC 시스템과 벡터의 형질) ⁴ 유전자 transductions 및 단백질 전달 시스템 ^5-7이 있습니다.

바이러스 매개 유전자 전달 효율의 특정 수준을 보장 할 수 있지만 그들이 통제 할 수없는 방식으로 프로그램을 다시 만들 유전자를 표현하는 호스트의 염색체에 통합하기 때문에, 바이러스 성 벡터는 유전자 발자국을 떠날 수 있습니다. 전사 인자의 바이러스 통합을 활성화하거나 호스트 ^{8 유전자를} 불 활성화 할 수 있더라도, 이는 예기치 유전 수차 및 종양의 ^5,9의 위험을 일으킬 수있다. 한편, 체성 세포로 단백질 또는 RNA의 직접적인 도입은보고 있지만, 이러한 노동 집약적 반복 TRANSF 등의 몇 가지 단점을 가지고 있었다ection 및 ^{7,10 재} 프로그램의 낮은 수준입니다. 심지어 에피 솜 및 비 통합 아데노 바이러스, 아데노 - 관련 바이러스, 플라스미드 벡터는 여전히 ¹¹ 비교적 덜 효율적이다. 이러한 이유로, 그것은 IPSC 세대의 높은 효능과 적은 유전자 이상과 비 통합 프로그램을 다시 만들 방법을 선택하는 그럴듯​​. 이 연구에서, 우리는 센다이 바이러스 기반 프로그래밍을 사용합니다. 이 방법은 호스트 게놈에 비 통합과 지속적으로 유전자 통합하지 않고 인간 유도 만능를 생산하는 것으로 알려져있다.

프로토콜

1. 셀의 제조 및 미디어 (주 1)

1. 문화 DMEM 매체는 10 % FBS가 포함 된 인간의 섬유 아세포를 확장합니다.
2. 플레이트 인간의 섬유 아 세포 전달 전날에 잘 당 적절한 밀도로 24 웰 플레이트 상에 (그림 1).
   참고 : 다른 종류의 세포가 다른 첨부 파일 기능을 가지고 있기 때문에 다음과 같은 일련의 희석액 (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K 및 6.25K)을 권장합니다.
3. 세포가 완전히 준수 및 확장이 보장, 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 하루 더의 세포를 품어.

2. 형질을 수행합니다 (2 일)

1. 형질 도입의 날에, 세포 밀도를 확인하고 가장 효율적인 밀도 웰 (도 2)을 선택했다. 높은 (80 ~ 90 %), 중 (50 ~ 70 %)과 낮은 (20 ~ 40 %)의 세 가지 다른 밀도를 선택하는 것이 좋습니다.
2. 1 시간 이상 전달하기 전에, fibrobl를 대기음AST의 세포에서 미디어와 섬유 아세포 매체의 새로운 300 μl를 변경합니다.
3. -80 ° C 저장에서 4 개의 다른 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거합니다. 몇 초 동안 37 ° C의 물 배스 동시에 각 튜브를 해동하고 수욕으로부터 튜브를 가지고. 그 후, 실온까지 이들을 해동; 원심 분리기 10 초 동안 6,000 XG에 튜브 및 사용까지 얼음에 배치합니다. 동결을 다시 및 역가가 유지되지 않으므로 바이러스를 해동하지 마십시오.
4. 마이크로 원심 분리기 튜브에 네 센다이 바이러스 튜브 (10 월 - 4, KLF-4, C-Myc와와 삭스-2)의 각각의 지정된 볼륨을 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫 팅하여 잘 혼합되어 있는지 확인합니다.
   예를 들어, 전달 24 - 웰 플레이트 lookwell의 50K 세포 / 잘 하나 :
   (생활 기술에서 분석의 인증서를 기반으로 역가가 배치에서 배치에 차이가있을 수 있습니다)
   튜브 hOct-4 = 6.0 × 10 ⁷ CIU, 3 MOI 5 μl를 =
   튜브 hSox-2 = 6.5 × 10 ⁷ CIU, 3 MOI는 = 4.6 μ; L
   튜브 hKlf-4 = 6.3 × 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4.8 μL
   튜브 HC-Myc와 = 7.8 × 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 3.8 μL
   총 = 24 - 웰 플레이트의 네 가지 바이러스 요인 혼합물 / 잘 하나 (50K 세포)의 18.2 μL
5. 세포 밀도에 따라; 2X, 1X, 그리고 잘에 바이러스 혼합물의 0.5X 볼륨을 추가합니다. 부드럽게, 플레이트 앞뒤 흔들어 좌우 (2X : 바이러스 혼합물, 1X의 36.4 μL : 18.2 μL와 0.5X : 9.1 μL).
6. 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어.

3. 문화 매체의 교체 (3 일 · 5 일)

1. 24 시간 전달 후, 500 ㎕의 신선한 섬유 아세포 매체와 매체를 교체하십시오.
2. 5 일에, 신선한 섬유 아세포 미디어와 중간 변경합니다.

4. 공동 문화 MEF 요리를 준비 (8 일)

1. 10 % 60mm 배양 접시에 MEF 세포를 준비 FBS는 DMEM 매체 하나 다 포함MEF 피더 세포에 형질 도입 된 섬유 아 세포를 계대 전에 Y.
   참고 : 우리는 각 60mm 접시에 MEF의 5 × ^5를 사용하고 있습니다.

5. 시작 공동 문화 MEF 피더 세포 (9 일)으로 세포를 형질 도입

1. 형질 세포를 도금하기 전에 대기음 10 % FBS는 MEF 피더 요리에서 DMEM 매체를 포함하고 FBS는 DMEM 매체를 포함 신선한 10 %를 추가합니다.
2. 24 - 웰 플레이트에 있고 D-PBS로 한 번 세포를 씻어 형질 섬유 아 세포에서 매체를 제거합니다. 24 - 웰 플레이트 기계가 섬유 아세포의 세포에 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리하기 시작할 때 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 미만 5 분 배양 후, 15 ML 원뿔 튜브에 성장 매체와 세포를 수집합니다. 그런 다음 4 분 6,000 XG에서 그들을 원심 분리기.
   참고 : 2X, 1X, 0.5X 및 바이러스를 풀링은 형질 섬유 아세포를 권장합니다.
3. 뜨는 매체를 제거하고 다시 중단에 씻어트립신의 중화를위한 신선한 섬유 아세포 배지 중에서 4-5 ㎖를 가진 세포 펠렛. 그런 다음 4 분 동안 135 XG에이를 원심 분리.
4. 예 : 1 / 2, 1 / 4, 1 / 8, 1 / 16, 1 / 32, 1 / 64, 및 백이십팔분의 일 60 당 : 시리얼 희석 밀도 및 MEF 상에 섬유 아세포 미디어와 공동 문화에 시작 플레이트 세포 mm 접시. 전달의 첫 주 동안 세포 사멸 속도에 따라, 하나는 1 / 2 또는 128분의 1 밀도에 희석 할 필요가 있습니다. 형질 전환 유전자 RT-PCR에 대한 긍정적 인 제어로 총 RNA를 추출하기 위해 옆에 남아있는 세포를 넣어.
5. 5 % CO ₂ 배양기 하룻밤, 37 ° C에서 60mm 요리를 놓습니다.

6. 인간 배아 줄기 세포의 중간 피드와 셀 (주 10) 모니터

1. 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES 미디어에 섬유 아세포 미디어를 변경합니다. 그 후, 인간 ES 매체 매일 매체 변경 : 800 ml의 DMEM/F12 + 200 ㎖의 녹아웃 혈청 교체 + 10 ml의 L-글루타민 + 10 10 mM의 MEM 최소 비 필수 아미노산의 ML기본적인 섬유 아세포 성장 인자의 2 - 머 캅토 에탄올 + 10 겨 / ㎖의 + 1 ㎖.
2. 신선한 인간의 ES의 미디어와 매일 미디어 변경 작업을 수행합니다. 일주일 후, ES 식민지와 같은 세포 덩어리의 형성을 현미경으로 한 번에 2 ~ 3 일이다 요리를 확인합니다. 콜로니가 발견되기 전에 세포의 종류에 따라, 배양은 더 많거나 적은 시간이 걸릴 것이다.

7. 유도 다 능성이 세포 식민지 줄기 및 셀 확장 따기 (일 20 ~)

1. 3 주 전달 후, 식민지 따기 제대로 성장 나타납니다.
2. 식민지를 따기 전날 24 - 웰 플레이트에 MEF 공급 장치를 준비합니다.
   참고 : 우리는 하나 24 - 웰 플레이트에 MEF 12.5 × 10 ^5를 사용하고 있습니다.
3. 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES의 미디어에 섬유 아세포 미디어에서 MEF 요리의 매체를 변경합니다. 수동 따기 후드에서 현미경으로 각각 한 번에 하나의 식민지를 선택하고 피펫으로 작은 덩어​​리를 만들어 전송할새로 개의 클론을 선택하는 MEF dishes.Try 준비에.
4. 통로 처음 6 웰 플레이트에 24 웰 플레이트에서 각 웰 확장합니다. 그런 다음 6 잘 플레이트에서 더 전파하기 전에 60mm 요리에.

(10 구절 후) 인간 유도 만능의 8. 특성

1. 면역 형광
   1. 매일 미디어 변화 4-5 일 도중 24 웰 플레이트와 문화 플레이트 인간 유도 만능.
   2. 면역 형광 분석을 시작, 한 번 D-PBS로 접시를 씻으십시오. 그런 다음 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 즉시 세포를 고정합니다. 그 후 5 분 동안 D-PBS로 세 번 씻어.
   3. 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액으로 고정 된 세포를 치료.
   4. permeablization 용액 (0.1 % 트리톤 X-100 용액) 대기음 다음, 상온에서 1 시간 동안 0.5 % BSA 블로킹 용액을 추가한다.
   5. Nanog를, 10 월 - 4, SSEA (무대 특정 배아 antig의 검출을 수행EN) 및 TRA-1-81 0.5 % BSA 용액에 항 인간 항체를 사용하여 (종양 제거 항원) (항체의 희석 비율에 대한 자료 표를 확인하시기 바랍니다.) 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. 그런 다음 5 분마다 D-PBS로 세 번 씻어.
   6. 실온에서 0.5 % BSA 용액에 1:2,000 희석하는 2 ^{차 항체와} 같은 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 항체와 배양 1 시간 후 형광 현미경을 사용하여 확인합니다. DAPI 각 MEF 피더 세포와 hiPSCs의 모든 핵을 얼룩.
2. 형질 전환 유전자 확인의 RT-PCR
   1. RNA 추출 시약을 사용하여 세포 펠렛에서 총 mRNA의 압축을 풉니 다.
   2. 역전사하여 PCR 증폭을위한 총 RNA와 그 결과의 cDNA의 분취에 역전사 (1 μg)을 수행합니다.
   3. cDNA를 템플릿의 2 μL, 2X PCR 마스터 믹스 10 μL, 프라이머 2 pmol의 2 μl를 포함하는 PCR 혼합물을 준비합니다(앞으로 1 μL 및 역방향 : 1 μl를) 및 DW 6 μL. 표 1에 기재된 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 유전자 발현을 검출한다.
   4. 증폭 반응의 효율을위한 제어로 GAPDH 유전자와 RT-PCR을 수행합니다. 시각화하고 1 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다.

결과

보통 감염 섬유 아 세포는 센다이 바이러스 전달 후 몇 일에 한 어떤 형태의 변화를 보여주지 않지만, 5 일 후, 그들은 다른 모양 (그림 1)를 가지고 시작합니다. 도 1의 오른쪽 패널에서 설명한 바와 같이, 세포는 전형적인 섬유 아세포의 형태를 가지고 있지 않는다. 그들은 세포질보다 둥근 모양과 더 큰 핵이있다. 전달이 80 %의 세포 포화 상태에서 수행되는 경우에도 그들이 다시 프로그램 시작 후가 아니라 덜 합류처럼, 그것은 보인다. 형태 이러한 종류의 변경이 아니라 가장에서 볼 수 시작하면, 형질 섬유 아세포 MEF 피더 배양 접시에 도금 할 준비가 된 것입니다.

우리의 프로토콜에서는, 세포 배양 규모를 최소화하고 또한 hiPSCs 발전 효율을 증가 같은 다른 섬유 아세포 세포 밀도 및 바이러스 역가를 이용한 다양한 프로그래밍 가능성, 및 후속 몇개 재 도금 비율 MEF를 (준

토론

hiPSCs에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 것은 기본 생물학, 개인 의학 및 이식 ¹² 전례없는 약속을 보유하고 있습니다. 이전에, 인간의 IPSC 세대는 의약품 개발과 이식 치료 ^13으로 추가 임상 응용 프로그램을 제한하는 바람직하지 않은 유전자 변이를 만들 수 있습니다 호스트 게놈으로 통합 위험이 DNA 바이러스를 요구했다. 이러한 이유로, 많은 연구는 여러 다른 방법으로 벡터 및 유전자없는 시스템 인간 유도 만능를 생성하는 것으로보고되었지만, 동시에, '무료 풋 프린트'분리의 효율은 인간 유도 만능은 고려되어야한다. 아직 센다이 바이러스 매개 IPSC 세대의 '게놈 안전'을 보여주기 위해 전체 게놈 시퀀싱에 대한 게시는 없지만 예를 들어, RNA 바이러스는 다른 방법 ^(14)에 비교 유전자 수차의 최소 수준이 있어야합니다. 여기서, 우리는와 hiPSCs를 생성하기위한 방법을 제시비용 효율적인 방식으로 높은 프로그래밍 효율이 센다이 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CytoTune-iPS 재프로그래밍 키트	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, 네오마이신 저항성, 미토마이신 C 처리	글로벌 스템	GSC-6105M	5 x 105/6 cm 또는 12.5 x 105/24웰 플레이트
트립신 EDTA 0.25% 트립신(EDTA 포함) 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 배지	Invitrogen	11330-032
24웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑이 있는 평평한 바닥	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (재고: 10 mM)
기본 섬유아세포 성장 인자	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (재고 : 100 ug)
녹아웃 세럼 교체	Gibco	10828028
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), 액상 (고포도당)	Invitrogen	11965118
Fetal bovine serum	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), 액상	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		11140050 1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), 액체	GIBCO	21985023	1/1,000
Hausser 위상차 혈	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% 젤라틴 용액	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Cell Signaling	4745S	1/200
마우스 단클론 Oct4 항체	산타	SC-5279	1/1,000
나노	R& D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 염소 안티-마우스	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS (Dulbecco' s 인산염 완충 식염수), 칼슘 및 칼슘 없이 1X 마그네슘	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect 역전사 키트	QIAGEN	205313
PCR 마스터 믹스 [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
따기 후드	NuAire	NU-301
해부 스코프	니콘	SMZ745