Method Article

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

DOI:

10.3791/51501

⸱

May 8th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지질 이중층 막은 세포의 원형질막을 형성 및 세포 내 소기관의 경계를 정의한다. 자연 속에서, 이러한 세포막은 지질의 많은 종류의 이종 혼합물이다 막 결합 단백질을 포함하고 탄수화물로 장식되어 있습니다. 일부 실험에서, 천연 막과는 지질 이중층의 생물 리 학적 또는 생화학 적 성질을 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에는 거 소포, 리포좀 또는지지 지질 이중층 (SLB 수)와 같은 모델 시스템의 사용을 요구한다. SLB 수의 배열은 응용 프로그램을 감지하고 세포 - 세포 상호 작용을 모방 특히 매력적이다. 여기에서 우리는 SLB 배열을 형성하는 새로운 방법을 설명합니다. 서브 마이크론 직경의 SiO2 구슬 먼저 구형 SLB 수 (SSLBs)를 형성하는 지질 이중 막으로 코팅되어 있습니다. 비즈는 다음의 마이크로 제조 서브 마이크론 직경의 마이크로 웰의 배열로 입금됩니다. 갈려하면서 제조 기술은, 기판 표면을 청소하기 위해 "스퀴즈"를 사용마이크로 웰에 정착 SSLBs 뒤에 g. 이 방법은 마이크로 웰 기판의 화학적 인 수정이나 SSLB에 특정 표적 리간드가 필요하지 않습니다. 잘 직경이 비드 직경보다 그냥 크게 조정되어 있기 때문에 마이크로 웰은 작은 구슬에 의해 점유되어 있습니다. 나머지는 비어있을 동안 일반적으로 우물의 더 많은 최대 75 %를 점유하고 있습니다. 버퍼 SSLB 어레이보다 일주의 장기 안정성을 표시. 우리는 강글 리오 시드 GM1와 콜레라 독소의 상호 작용을 특성화하여 보여 이는 SSLBs 여러 종류의 시리얼 증착에 의해 하나의 어레이에 배치 될 수 있으며, 어레이는 감지를 위해 사용될 수있다. 우리는 또한 셀룰러 소스로부터 비드 지지체 및 생체막없이 인지질 소체는 동일한 방법으로 배열 될 수 있고, 셀 고유 막 지질은 식별 될 수 있음을 보여준다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지질 이중층 막 자연에 필수적인 구조입니다. 셀룰러 원형질막 및 소기관 막은 생활에 필요한 분자의 수를 반영 지질 이중층으로 구성되어있다. 많은 생명 유지 과정은 세포의 표면에 발생하거나 지질 이중층의 세포막과 관련된 분자에 의해 매개된다. 사실, 많은 제약 대상 프로세스 또는 분자는 1,2 또는 세포막에서 발견된다. 그것은 해석 등의 막 표면에 발생하는 화학 반응 또는 비공유 결합 이벤트와 같은 프로세스를 조사 할 필요가있다. 천연 막은 센서 분리 및 / 또는 인터페이스하기 어려울 수 있기 때문에, 많은 연구자들은 분석적 연구를 수행하기 위해 단순화 된 모델 막을 이용한다. 모델 멤브레인 시스템의 수는 나노 크기 3,4와 리포좀 직경 미크론의 수백 수만 할 수 있습니다 거대한 소포에 이르기까지 문헌에 설명되어 있습니다. Alternatively, 고체 지지체 상에 증착 평면 지질 이중층, 즉, 지질 이중층 (SLB 수)이 다른면의 개수에 형성 될 수 있고, 광범위하게, 생물 리 학적 생화학 및 분석 애플리케이션 (5)에 사용 된 지원. 전기 또는 광학 재료와 SLB 수 커플 링은 서로 다른 분석 기술의 사용을 통해 막 생화학 및 생물 물리학의 조사를 가능하게한다. 형광 현미경 (6), 전기 화학 7, 광학 분광 8, 주사 탐침 현미경 9, 표면 플라즈몬 공명 (10)와 질량 분석기 (11)는 모든 SLB 수의 구조와 특성을 연구하기 위해 사용되어왔다.

SLB 배열은 다중 분석 (12, 13)에 대한 센서의 설계에 추가 기능성을 제공합니다. 다른 응용 프로그램은 면역 세포 (14) 사이에 형성하는 접합을 모방하는 SLB 배열을 사용합니다. SLB 배열을위한 준비 방법은 microflu에서 변화 한IDIC 인접 SLB 패치 사이의 물리적 장벽을 사용하는 사람들에게 (15)에 접근한다. 16 다른 그룹은 인쇄 방법 17을 사용하고, 광 화학적 패턴 (18) 및 다양한 나노 공학은 SLB의 배열을 만들 수 (19)에 접근한다.

이 논문 및 첨부 된 영상에서 우리는 마이크로 웰 (20)의 정렬 된 어레이로 SLB-SiO2로 코팅 된 비드를 증착함으로써 SLB 어레이를 형성하는 방법을 보여준다. 우리는 구형 지원 지질 이중층 (SSLBs)로 SLB-코팅 그런가 2 구슬을 참조하십시오. 이 기술은 우리는 또한 예를 들어 결과를 보여되는 천연 자원 21에서 파생 된 인지질 소포 및 생체막의 배열을 생성 이전 작업의 연장이다. 생체막 입자 또는 소포를으로 배열하는 다른 방법은 소포 표면에 포함 된 보완 리간드와 연관 표면에 특정 표적 리간드의 패턴에 의존하고있다. 예 비오틴을 포함아비딘 협회 22,23 및 DNA 혼성화 기법 24. 우리의 접근 방식은 필요없는 타겟팅 또는 인식 부분과 마이크로 웰 어레이를 필요로합니다. SSLBs의 크기는 낮은 폴리 분산도가 그런가 2 비드 지원의 직경에 의해 정의된다. SSLB 직경보다 더 큰 단지에 마이크로 웰 지름을 조정함으로써, 단일 SSLB 각 마이크로 웰 나오기. 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS) 고무 롤러는 표면에서 마이크로 웰에 고정되지 않은 모든 SSLBs을 제거합니다. 마이크로 웰과 결과 SSLB 배열은 3 ㎛의 중심 간 간격과 육각형의주기와 높은 밀도 (~ 10 5 SSLBs / ㎟)가있다. 직렬 다른 지질 조성물로 SSLBs을 증착함으로써, 임의로 배치 SSLBs 가진 다 성분 배열을 생성 할 수있다. SSLB 배열의 감지 기능을 설명하기 위해, 우리는 SSLBs에 통합 강글리오사이드 (GM1)와 콜레라 독소 (CTx가)의 상호 작용을 사용했다. 와천연 막 입자, 우리는 두 가지 종류의 세포로부터 멤브레인 재료를 함유하는 다 성분 어레이 셀 고유 지질을 검출 할 수 있었다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 웰 어레이 기판의 1. 미세 가공

  1. 열 성장 산화물 (100) (Nm)에 4 인치의 실리콘 웨이퍼로 시작.
  2. 30 초 동안 4,000 rpm에서 웨이퍼에 SPR-955 0.7 포토 레지스트를 스핀.
  3. 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다.
  4. 포토 레지스트를 노출합니다.
    1. 배열은 2mm X 2mm 면적 3 μm의 기간이 육각형으로 배열 1 ㎛의 구멍을 만들 것입니다 마스크를 사용하십시오.
    2. 6mm의 스텝 사이즈 200 엠제이 / cm 2의 노출을 사용하여 i 선 스테퍼에 웨이퍼를 노출시킨다.
  5. 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다.
  6. 90 초 총 개발 시간의 웨이퍼에 CD-26의 2 웅덩이을 입금 스핀 Developer를 사용하여 개발할 수 있습니다.
  7. N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어.
  8. 아르곤 50 sccm으로, CF 4의 25 SCCM 및 CHF 3 FLO 50 SCCM으로 6 분 동안 반응성 이온 에칭 기에서 산화물을 에칭75 mTorr의 압력에서 날개.
  9. C 4 F 8 63 SCCM, SF 6의 27 SCCM, 아칸소의 40 SCCM, 및 O 2가 14 mTorr의 압력에서 흐르는 10 SCCM 2 분 ICP 깊은 트렌치 반응 이온 에칭에 실리콘 에칭.
  10. 저항 제거하기 위해 아세톤, 메탄올, 이소프로판올에 씻어.
  11. H 2 SO 4의 목욕 장소 : H 2 O 2 1:1 표면을 청소하는 10 분.
  12. N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어.
  13. 250 ° C에서 원자 층 증착에 의해 알이 1,080 Å O 3을 입금

폴리 2. 준비 (디메틸 실록산) 스퀴지

  1. 가능하면, 클린 룸에서 작동합니다. 그렇지 않으면 가능한 깨끗한 환경에서 작동합니다.
  2. ≥ 13mm의 측면과 함께 플라스틱 페트리 접시 (또는 다른 깨끗한 일회용 용기)를 구합니다.
  3. 그 접시에, 50g의 PDMS의 BAS 다음, 5g PDMS 경화제을 부어전자 에이전트 (또는 대부분 페트리 접시를 채울 1:10 비율로 무엇이든). 일회용 플라스틱 피펫 또는 막대로 충분히 섞는다.
  4. 거품이 혼합물 (약 30 분) 나올 때까지 진공을 적용, 진공 라인과 챔버에서 혼합 된 PDMS를 배치하여 거품을 제거합니다.
  5. 이미 배양 접시에 기포의 생성을 방지 페트리 접시에 PDMS를 부어하지 않을 경우.
  6. 50 ° C (적은 시간에 대한 높은 열이 또한 작동)>에서 핫 플레이트에서 하룻밤 치료.
  7. 새 / 깨끗한 면도날로,주의 깊게 가능한 한 깨끗한 표면을 유지, 사각형 조각 약 2.5 × 2.5 cm를 잘라. 깨끗한 포셉 함께 껍질. (이것은 스퀴지 공정에 사용되는 에지 예정) 가능한 한 날카로운 위쪽 가장자리를 만들기 위해, 한 동작으로 면도날을 눌러서 하나의 에지 (1.5 cm 아래로)를 잘라냅니다.
  8. 다음 아세톤, 메탄올, 이소 프로필 알코올, 및 초순수 DI 물을 청소하고, 청소 질소 가스로 건조한다. 깨끗한 페트리 접시에 보관합니다.

소포의 3. 준비

  1. 지질 재고 25 ㎎ / ㎖ 달걀 포스파티딜콜린 (PC)의 솔루션 및 1 ㎎ / ㎖, 1,2 - 디 팔미 토일-sn-phosphoethanolamine-N을 수집 - 클로로포름 (리사 민 로다 민 B의 설 포닐) 암모늄염 (RHO-DPPE) 클로로포름 / 메탄올 monosialoganglioside GM1의 0.5 ㎎ / ㎖의 원액 (2 : V / V).
  2. 작은 유리 병에 25 ㎎ / ㎖의 PC의 18.9 μL, 0.5 밀리그램의 39.6 μL / ㎖ GM1 및 7.9 μl를 추가하여 97 몰 %의 PC에, 2 몰 % GM1 1 몰 % RHO-DPPE 결과 혼합물을 1 ㎎ / 유리 주사기를 사용하여 ML RHO-DPPE.
  3. 참고 :. 나이 르 등 25 보충 자료는 원하는 구성의 소포를 만드는 데 필요한 지질의 양을 계산하는 뛰어난 사용자 정의 Excel 스프레드 시트가 포함되어 있습니다.
  4. 진공 건조기에서 유리 병을 넣고 6 시간 동안 진공 유리 병을 떠나는하여 용매를 제거한다.
  5. 0.1의 수용액을 만들M의 NaCl. 건조한 지질 필름을 함유하는 바이알에, 0.1 M NaCl 용액 0.5 ㎖를 추가.
  6. 수성 지질 혼합물이 하룻밤 휴식을하실 수 있습니다.
  7. 소포의 현탁액을 생성하기 위해 잠시 동안 소용돌이 혼합 한 다음 실온에서 욕조 초음파 처리기에서 20 분 동안 초음파 처리.
  8. 100 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 막을 통해 소포 현탁액을 돌출. 필터의 17 배를 통해 소포 현탁액을 전달합니다.
  9. 4 ℃에서 유리 병에 돌출 된 소포를 저장

구형 지원 지질 이중층의 4. 형성

  1. 700 나노 미터 직경의 SiO2 구슬을 수집합니다. 구슬은 1.4 × 10 11 비즈 / ㎖의 재고 농도 증류수에 공급된다.
  2. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 0.1 M NaCl을 893 μL에 구슬 원액 107 μL를 추가하여 1.5 × 10 10 비즈 / ㎖의 농도가 1 ㎖ 비드 현탁액을 준비합니다.
  3. 잘 마일 보장하기 위해 서스펜션을 흔든다XED.
  4. 20 분 후 상층 액을 버린다 1,700 XG에 현탁액을 원심 분리기. 0.1 M의 NaCl 1 ㎖에 비즈를 Resuspend. 철저하게 구슬을 씻어 두 번 더이 단계를 반복합니다.
  5. , SSLBs를 형성 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 1 ㎎ / ㎖ 소포 현탁액 200 μL에 그런가 2 비드 현탁액의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 서 보자. 이 단계에서 SSLB 농도는 1.7 × 10 9 SSLBs / ㎖이어야한다.
  6. SSLBs 펠렛 20 분 1,700 XG에 원심 분리기. 펠렛 인해 구슬 RHO-DPPE와 소포의 파열에 핑크를 나타납니다.
  7. 225 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS), pH가 7.4에서 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. 반복 SSLB 서스펜션에서 모든 비 파열 소포를 제거하는 4.6-4.7 두 번 더 단계.

SSLB 배열 5. 총회

  1. 4-6 마이크 사각형 조각의 결과로 마이크로 웰 어레이 베기 웨이퍼조각 당과 Rowell 배열.
  2. 소용돌이가 SSLB 현탁액을 혼합, 각 마이크로 웰 어레이에 SSLB 현탁액의 10 μl를 놓습니다. 1 시간 동안 나머지는 SSLBs 표면에 정착 할 수 있도록 않도록.
  3. 다음 조심스럽게 얕은 접시에 준비 PBS 욕조에 잠수함, 세척 병에서 PBS와 마이크로 웰 어레이 칩을 씻는다.
  4. 잠수하는 동안 부드럽게 마이크로 웰 어레이 칩의 PDMS 스퀴지 플러시를 배치하고 부드럽게 마이크로 웰에 고정되지 않은 SSLBs을 제거하기 위해 표면에 5 배를 따라 밀어 넣습니다.
  5. 그립은 부드럽게 마이크로 웰 어레이 핀셋 칩 및 초과 SSLBs를 제거하는 PBS 욕조에 흔들.
  6. 빨리 스퀴지 화장실에서 칩을 제거하고 더 사용할 때까지 신선한 PBS 욕조에 넣습니다. 칩의 표면은 SSLBs을 유지하기 위해 젖은 상태로 있어야합니다.

참고 : 위에서 설명한 조립 방법은 마우스의 뇌, 또는 포에서 격리 수초 입자처럼, 자연의 막 입자의 배열을 만들 수 있습니다그런가 2 비드 지원없이 spholipid 소포. 이 작품은 비텐 베르크 등에 자세히 설명되어 있습니다 알. (21) 대표 결과는 다음과 같습니다.

6. 콜레라 독소 결합 분석

  1. PBS에 소 혈청 알부민 (BSA)의 2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비합니다.
  2. 2 ㎎ / ㎖ BSA와 PBS에서 알렉사 488 - 복합 콜레라 독소 B-서브 유닛의 원하는 농도의 용액을 제조.
  3. PBS 화장실에서 SSLB 어레이 칩을 제거하고 닦아 실험실을 사용하여 PBS 솔루션의 대부분을 떨어져 심지. SSLB 배열이 수화 유지하기 위해 칩에 충분한 PBS를 남겨주세요.
  4. 비특이적 결합을 방지하기 위해, 2 ㎎ / ㎖ SSLB 어레이 칩 BSA 용액 200 μl를 추가합니다. 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 보자.
  5. 마이크로 피펫으로, SSLB 어레이 칩의 상단에서 솔루션 200 μl를 제거합니다.
  6. SSLB 어레이 칩에 콜레라 독소 솔루션 200 μl를 추가하고 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 할 수 있습니다.
  7. 부드럽게 모든 언 바운드 콜레라 독소를 제거하기 위해 세척 병에서 PBS와 SSLB 어레이 칩을 씻는다.
  8. 실험실을 사용하여 심지 멀리 초과 PBS는 닦아냅니다. 24mm X 40mm 커버 슬립으로 커버 칩 이미징 전에.
  9. 필터를 사용하여 직립 현미경 이미지 배열은 관심의 형광에 적합한 설정합니다.
  10. ImageJ에 소프트웨어의 자동화 된 입자 분석 기능을 사용하여 배열의 개별 SSLBs의 형광 강도를 분석.
  11. 주어진 배열에서 발견 SSLBs의 강도를 요약 막대 그래프로 개별 SSLBs에서 평균 형광 강도를 컴파일합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SiO2로 비즈 인지질, 형광 지질 등 강글리오사이드와 같은 다른 지질로 구성된 소포 용액과 혼합하는 경우도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 소체는 SSLBs을 형성 할 SiO2를 비드 표면에 파열. SSLBs 세척 후, SSLB 용액의 방울을 마이크로 웰 어레이에 배치되고, 비드 표면에 정착하는 것이 허용된다. (그림 1B1)이 그림 1B2에 표시됩니다 인지질 소포 또는 자연 막 입자의 서스펜션도를 수행 할 수 있습니다. 마이크로 웰 어레이 기판에 흡착 인지질 소체의 형광 이미지를도 1B3에 도시된다. 그런 다음 PDMS 스퀴지는 어떤 SSLBs (그림 1C1), 소포 또는 자연 막 입자 마이크로 웰에 정착하지 않았다 (그림 1C2)을 제거하기 위해 표면을 부드럽게 슬라이드한다. 이 SSLB 배열에 어떤 결과 각마이크로 웰 대부분...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 우리는지지 지질 이중층 코팅 단 분산의 SiO2 비즈 지질 이중층 또는 기판 표면 상에 리간드를 표적에 대한 필요없이 마이크로 웰 어레이로 배열 될 수 있으며, 배열이 독소 - 지질 상호 작용을 특성화에 사용될 수 있음을 보여준다. CTx/GM1 바인딩에 대해 계산 된 해리 상수 우리에 의하여 이전의보고와, 문헌 값의 폭 격차 관련, 바람직 비교 윈터 등. 지질 - 코팅 된 비드의 콜로이드 어셈블리는 약의 해리 상수를 계산하는 데 사용 된 곳 30 ㎚. 힐 Waud 바인딩 모델에 데이터를 피팅함으로써, 우리는 CTx/GM1 상호 작용은 이전의보고 28 동의 가능성 다가이라고 결정했다. 의 CTX B (강글 리오 시드 결합) 서브 유닛은 GM1 분자 (29)를 결합 할 수있는 오 유닛 각각과, 펜타 머로서 존재한다; 따라서, 하나 이상의 서브 유닛은 비교를 주어 결합 될 수 있다는 놀라운 일이 아니다SLB 수 30 GM1의...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM092993)에서 SHO 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (NSF 경력 수상 및 DBI 0,964,216), 해군 연구 국 (ONR) 젊은 탐정 프로그램 및 생명 공학에 대한 미네소타 파트너십 수상 의학 유전체학. 장치 제조는 국가 나노 기술 인프라 네트워크를 통해 NSF에서 지원을받는 미네소타 대학의 Nanofabrication이 센터 (NFC)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강 (NS048357, R21 NS073684), 국립 다중 경화증 학회 (CA1060A11), 알파 밤, 힐튼, 피터슨과 샌포드 기초 및 McNeilus 가족의 국립 연구소에서 MR 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 주사 전자 현미경에 대한 지원은 그림과 Shailabh 쿠마에 대한 지원은 Hyungsoon 임 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4 인치 실리콘 웨이퍼University Wafer425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 포토레지스트MicroChemSPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 개발자MicroChemCD-26
i-line 스테퍼Canon2500 i3 스테퍼
Vision 320 반응성 이온 에칭기Advanced VacuumVision 320 RIE
딥 트렌치 반응성 이온 에칭플라즈마 ThermSLR-770
원자층 탈퇴 시스템Cambridge NanoTechSavannah
Dow Corning Sylgard 184 폴리(디메틸실록산) 키트Ellsworth 접착제184 SIL ELAST KIT 0.5KG
계란 포스파티딜콜린Avanti 극성 지질840051C
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) 암모늄 염Avanti Polar Lipids810158C
Monosialoganglioside GM1Avanti Polar Lipids860065P
실리카 비드Bangs LaboratoriesSS03N/4666비드 용기의 포장에는 비드의 직경이 900nm라고 명시되어 있습니다. 그러나 광 산란과 전자 현미경 검사 후 비드의 직경이 약 700nm임을 확인했습니다.
콜레라 독소 B-subunit, Alexa 488-conjugateMolecular ProbesC-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugateR& D SystemsNL1326R
FM1-43분자 프로브T-3136
Eppendorf MiniSpin 원심분리기Fisher Scientific05-401-09

References

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