설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

고환에서 등장하는 데, 정자는 매우 아직 현저하게 차별화된다,이 세포는 ^{1, 2} 미숙. 이와 같이, 이들은 ^{3 개의} 난자 헤엄 능력 인드 포함한 완전한 기능이 부족하다. 정자 세포의 성숙이 더 필요하지만 그들의 세포 분화 과정이 단계들은 유전자 전사와 상기 단백질 생합성 ⁴ 없게되어 있기 때문에, 이것은 표준적인 경로를 통해 이루어질 수 없다. 그들은 정소두고 부고환 ^5라고도 남성 생식 기관의 일부를 입력 생물학적 능력이 정자에게 부여된다. 부고환은 정관에 (고환) 원심성 덕트를 연결하고 모든 남성 포유 동물 ^6에 존재 단단히 코일, 차별화 된 관입니다. 정자는 점진적으로 CR은 끊임없이 변화하는 내강 환경에 의존, 부고환 하강하는 동안 그들의 시비 가능성을 취득로컬 부고환 상피 세포 ⁷ 어갈. 부고환 환경의 행동에 존재하는 다양한 분비 및 재 흡수 활동은 단백질, 탄수화물 및 지질 성분 ^(6)을 변경, 정자 자체를 수정합니다. 이러한 구성의 특히 초기 'CAPUT'영역 부고환의 중요성은, 외과 용 결찰 ^기법을 이용하여 ⁸ 예로 들었다. 원심성 덕트 결찰에 의해 고환 내에서 유지 정자는 완전히 난자 ^9-11을 비옥하게하기 위해 어떤 능력이 부족합니다.

부고환 환경에 더하여, 정자 워크 내 신호 전달 경로는 전기 - 병진 기존 정자 세포 보충을 수정한다. 예를 들어, 부고환 초기 영역에서 정자 이러한 후자의 영역 ^-5,12- 비해 단백질 인산화의 다른 패턴을 표시. C 광대 차이가 있기 때문에 이는 놀랍지 않다이 지역에서 정자의 apability. 예를 들어, 초기의, 부고환 CAPUT 정자는 immotilite이다. 대조적으로, 카우 영역으로부터 정자 앞으로 한번 등장 매질에 배치 프로그레시브 운동성을 받게 될 것이다. 부고환 정자 세포가 드 노보 단백질 생합성 능력이 있기 때문에, 정자의 기능을 조절하는 모든 고유 경로는 번역 후 변형 (PTM)를 통해해야합니다. 따라서, 그 단백질 체학을 당연한, 우리는 정자 세포 성숙을 이해하는 경우 특히 이러한 인산화 등 PTMS의 조사는 큰 추력을해야합니다.

다른 방법은 ^{13 ~ 16} 복고풍 백 플러싱 사용 epididymidies에서 정자를 얻을 수있다. 이 기술은 확실히 더 많은 시간이 소모되며 조작자의 지식을 가진 큰 정도 소요되지만, 정충 일관 99.99 % 이상의 순도를 입증 수득. 또한, 모든 다른 기술과는 달리, 정자의 CAN 가능 정자 운동성이 개시되는 방법 공부하게 정지 상태로 단리 할. 샘플 준비가 단백질체 분석에 가장 중요한 측면이므로, 정자의 분리 정자 프로테오믹스 연구의 가장 중요한 측면 중 하나가되고있다. 이 프로토콜은 카우의 부고환에서 분리하는 방법 정자에 대한 설명을 제공합니다. 이어서, 형성된 티오 포스 _포이 농축 과정은 고도로 분화 된 세포로부터 정자 펩티드를 추출하는 방법에 대한 참조로, 개략되어있다. MS 접근법은 하나 하나의 상태에 꼬리 부고환 정자과 비교한다면 변화 포스 포를 구별하는데 사용될 수있다 (immotile 또는 비 capacitated) 정자 공부이에게 강력한 접근 방식을 (등 반응 운동성 capacitated, 첨체) 다른 기능.

문화 미디어와 요리 1. 준비

1. 5.54 g의 NaCl, 0.356 g의 KCl, 0.25 g의 _CaCl2를, 0.162 g의 H ₂ KO ₄ P, 및 0.294 g의 _황산 밀리 Q 물 L 1을 추가하여 비 거스 위튼과 위튼 (BWW) ⁽¹⁷⁾ 작업 용액 200 mL로 . 이 원액이며 개월까지 4 ℃에서 유지 될 수있다.
2. 스톡 용액으로부터,의 _NaHCO3 420 mg의 추가 ^- 200 mg의 글루코스, 6mg의 피루브산 나트륨 600 mg을 소 혈청 알부민, 0.74 ml의 나트륨 락 테이트, 및 BWW 스톡 4.0 HEPES 완충액 ml를 193 ml의. 이 작업 솔루션이며 항상 사용하기 전에 날에 신선한 만든 37 ° C 평형을한다.
3. 캐 뉼러를하려면, 튜브가 녹기 시작하는 것이 (일반적으로 메탄올 불꽃) 등을 0.4 mm의 내부 직경 1.1 mm의 외부 직경 폴리에틸렌 (PE) 관을 가지고 약한 불로 보유. 즉시 outw 튜브를 당겨ARD는 스트레칭과 외부 직경이 좁아 확인합니다.
4. 정관 쉽게 삽관을 허용 한 쪽 끝이 좁아을 생산 컷.
5. 약 15cm에 캐 뉼러의 다른 쪽 끝을 잘라. 무딘 끝으로 30 G 바늘을 삽입하고, 그것에 3 ML의 주사기를 연결 (완전 수축).
6. PE 튜브 (4.2 mm 내경 6.4 mm 외경)의 20cm 길이를 절단하여 흡입 마우스 피스를 확인합니다. 한쪽에 마우스 피스를 삽입합니다.
7. 마이크로 유리 모세관 튜브 홀더와 유리 마이크로 모세관 자체 (전형적으로 마우스에 대한 3 μL, 쥐 40 μL)를 삽입한다.

마우스에서 Epididymides 2. 제거

1. 각 기관에 특정 IACUC 승인 절차에 따라 쥐를 안락사.
2. 동물을 가지고 부고환을 노출 음낭에 작은 절개를합니다. 시계의 # 5 포셉 한 쌍을 사용하여 캐비티에서 고환과 부고환을 당깁니다.
3. 이러한 적어도 1-2cm가 카우의 부고환에 부착 된 상태로 유지 정관을 잘라. 또한, 고환 부고환 접속 근위 원심성 덕트 및 조직을 절단하고, 전체 트랙의 남성 생식을 제거한다.
4. 5-40X의 순서로 확대 범위 해부 현미경 전체 남성의 생식 트랙을 놓습니다.

3. 부고환을 Cannulating

1. 축소 (원추형) 끝에 1-2 센티미터 렌즈를 통해 무료로 볼 수 있도록 현미경에 캐 뉼러 아래 테이프.
2. 시계의 # 5 포셉 한 쌍을 가지고 부드럽게 정관의 양쪽 걸쇠와 캐 뉼러는 정관으로 진행되도록, 캐 뉼러에 정관을 당깁니다.
3. 비 흡수성 검은 꼰 치료 실크 (크기 5-0)의 길이를 가지고 유관 정관 주위에 매듭을 묶어. 확인 매듭이 정관 내부 캐 뉼러를 개최 단단히 당겨지면 공기 압력 FR옴 주사기 적용됩니다.

4. 역행 또는 꼬리 부고환 정자의 백 플러싱

1. 시계 제작자의 # 5 집게를 사용하여 카우의 epididymides의 말단부를 잡고 하나의 부고환 세관을 노출하기 위해 외막 albuginea를 제거합니다.
2. 포셉 사용하여 부드럽게 보이도록 가느 다란 관을 끌어와 정자가 해제 될 때까지 구멍을 만들 수 있도록 다음 떨어져 애타게.
3. 정관에 주사기에서 공기를 배출 할 수 있도록 조심스럽게 3 ㎖ (마우스) 20 ㎖ (쥐) 주사기에 밀어 넣습니다. 적절한 압력, 정자 천천히 카우의 부고환의 말단부에 깨진 가느 다란 관에서 나오는 시작합니다. 이때, 유리 모세관에 정자를 그릴 마우스 피스 흡입을 적용한다. 주 : 일반적으로 마우스에서, 정자 2-3 μL가 동물의 나이에 따라 얻을 수있다. 쥐 의지, 평균 수익률이 30 ~ 40 μL에.

5. 세척및 단백질 체학을위한 준비에 정자를 용균

1. 부드럽게 마우스 피스 불고 또는 주사기를 부착하고 모세관에서 다시 정자를 밀어하기 위해 공기를 추방하여 BWW 용액 1 ml의 용액 (37 ° C)에 유리 모세관에서 정자를 추방.
2. 정자 세포가 확산되면, 오염 단백질을 제거하는 1 ml의 BWW 3 배 (300 XG, 5 분)을 씻는다. 최종 세척 한 후, 상층 액을 제거합니다. 주 :이 시점에서, 정자 세포가 나중에 사용하기 위해 고정 될 수있다.
3. 간헐 텍싱 함께 1 시간 동안 4 % CHAPS, 2 M 티오 우레아, 50 mM 트리스, pH가 7.4를 사용하여 단백질을 가용화.
4. 세포를 원심 분리 (10,000 XG, 20 분) 용균 후, 상층 액을 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 주 :이 시점에서, 단백질의 정량을 행할 수있다.

6. 이황화 채권 감소와 알킬화

1. 용해 단백질에 최종 농도가 10 mM의 DTT를 추가, vort전은 30 분 동안 실온에서 품어.
2. 해물, 소용돌이에 최종 농도로 idodoacetamide의 50 mM을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.

7. 강수량

1. 메탄올 클로로포름, 해물 1 볼륨 (예를 들어 400 μL)를 추가하여 샘플을 침전 메탄올 하나의 볼륨 (400 μL) 0.5 볼륨 (200 μL) 클로로포름을 추가합니다.
2. 소용돌이 샘플 및 스핀 (10,000 XG, 2 분).
3. 두 단계 원심 분리 다음 나타납니다합니다. 상위 계층 (조심 인터페이스를 방해하지)의 모든하지만 2mm를 폐기하십시오.
4. 메탄올의 1 볼륨 (400 μl를) 추가, 반전 튜브는 부드럽게 (10,000 XG, 15 분) 혼합하고 다시 스핀 1-2X. 3 ~ 4 분 동안 낭비 뜨는 공기 건조 펠렛을 폐기하십시오.

8. 트립신 소화

1. (50)의 비율을 1 M 우레아를 함유하는 25 mM의 중탄산 암모늄의 트립신 재구성 : 1 (W / W 단백질 : 트립신) 및 비켜 인큐베이션바람직하게는 써모 700 rpm에서 37 ° C에서 rnight.
2. 스핀 (10,000 XG, 15 분) 소화되지 않은 물질을 펠렛. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.

9. 포스 포 심화

1. 이전 ¹⁸ 설명 된대로 소화 트립신에서 정제 및 인산 화합물의 농축을 수행합니다. 350 ㎎ / ㎖의 2,5- dihydrobenzesulfonic 벤조산 (DHB), 80 % (V / V) ACN (아세토 니트릴), 2 % (v / v)의 TFA (트리 플루오 : 트립신 펩티드에게 DHB 완충액에서 10 배 희석 [DHB 버퍼 이루어져 산)] 및 티오 ₂ 구슬 (200 μg의)를 건조에 적용됩니다.
2. 1 시간 동안 실온에서 회 전자에 둡니다.
3. , DHB 버퍼와 샘플을 씻으 스핀 뜨는을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 세척 버퍼 [80 % ACN (v / v)의 2 % TFA (v / v)로] DHB를 제거하려면로 3 회 세척한다.
4. 최종 스핀 후 직접 2.5 % 수산화 암모늄 25 μL, pH가 10.5 ≥ 용액을 첨가하여 용출 완충제를 사용하여 포스 포 용출. 에스핀과 상층 액을 제거합니다. 즉시 ~ 0.3 μL 포름산으로 중화.

어떤 단백질체 분석 결과의 품질은 출발 물질에 의존하고있다. 현대 MS로, 샘플 준비에 약간의 오염은 쉽게 선택됩니다. 따라서, 고순도의 정자를 제공하는 방법을 선택하는, 정자 세포 프로테오믹스의 경우, 중요하다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 역행 역세는 카우의 부고환에서 정자를 검색하는 데 사용된다. 이것은 하나 천천히 부착 된 주사기에서 공기 압력을 적용 할 수 있습니다 PE 튜브와 정관을 cannulating 포함한다. 그림 1a는 정관과 함께 카우의 부고환을 보여줍니다. 그림 1B는 정관이 연결되는 방식의 근접 촬영입니다 캐 뉼러를 삽입됩니다. 이 과정에서, 그래서 정자는 꼬리 epididymides에서 한 세관의 절제 끝에서 방출된다. 도 2a에 도시 된 바와 같이,이 정자 caud의 정점 영역에서 추출부고환과는 정지 상태 (그림 2B)에 유리 모세관에 빨려된다. 이 이전과 운동의 활성화 후 정자의 phoshoproteomic 분석을 수행 할 수있는 능력이다 조금도있는 전통적인 "수영 - 업"방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 정자는 다음 중 하나의 선택의 매체로 추방 될 수있다. 그림 2C (왼쪽)은 정자가 BWW 미디어로 추방 후 즉시보고하는 방법을 보여줍니다. 세포의 대부분은 뭉쳐있다. 그들이 용액 (도 2C, 우측 셀) 내로 균일 밖으로 수영 때문에, 세포의 10 분 후 능력이 증명된다. 백 플러싱 기술은 정자 세포에 거의 영향을 가지고 있기 때문에, 우리는 가까운 100 % 운동을 획득하고 세포가 외부 자극없이 미디어로 빠르게 분산. 일반적인 백 플러싱 실험에서 정자는 스위스 - 마우스가 포함되어에서 복구6 10 × 1-5 사이의 세포. 이것은 동물의 나이에 크게 의존와 마우스의 다른 균주에 따라 다를 수 있습니다. 노르웨이 쥐, 우리는 일반적으로 200 × 106 정자를 얻을, ± 20 %. 그림 2D는 쥐 카우의 부고환에서 얻은 정자의 순도를 나타냅니다.

샘플 자체 외에, 샘플 제조에 관한 주요한 문제점 중 하나는 트립신 소화 수율이다. 단백질 침전뿐만 아니라 단백질의 변성,뿐만 아니라 MS와 호환되지 않는 둘 불필요한 세제 염을 제거에 중요한 역할을한다. 우리는 최선을 작업 할 수있는 메탄올 - 클로로포름 침전을 발견했다. 뿐만 아니라,이 절차는 TCA 침전 (19) 등 다른 것보다 더 낮은 풍부한 단백질을 침전보고되어 있지만, 부가적인 장점을 가지고있다. TCA 침전 후, 꽤 남아있을 수 TCA 펠릿 정지 후 pH를 다시​​ 조정하는 것이 필요하다산성. TCA 침전의 펠렛 아세트산을 제거 높은 유기 용액으로 세정 될 수 있지만, 이는 처리 및 결과 irreproducibility 견본을 추가한다. 산을 중화 않으면 가난한 트립신 펩티드 수율 발생합니다. 메탄올 - 클로로포름 침전뿐만 아니라 퀵하지만 샘플을 산성화하지 않을 것이다. (3)은 일반적으로 상부 및 하부 사이의 상간 100 μg의 샘플에서 본 단백질 펠렛을 도시한다.

인산 화합물의 분리는 다수의 방식으로 발생할 수있다; 그러나 재현성이 샘플이이 단계를 포함까지 취급 된 방법에 따라 달라집니다. 일반적인 개발 방법 중 하나는 티오 2, 원래 마틴 라센 18,20,21의 그룹에 의해 개발했다. 마이크로 컬럼에 사용하기위한 프로세스로서 설명했지만, 우리는 일괄 크로마토 그래피를 이용하여 재생 가능한 데이터를 획득 할 수있다. 프로세스의 성공은 용출 버퍼에 크게 의존, 미친있는이어야합니다 올바른 구성과 전자; 그렇지 않으면 인산 화합물이 전혀 용출되지 않습니다.

이산화 티탄의 프로토콜과 대표 데이터의 재현성이 아닌 운동성 (그림 4 위)과 m에서 운동성 (그림 4 하단) 상태에서 카우의 부고환 정자에서 포스 포 농축 / Z 650-670 볼 수 있습니다. 우리는이 생물 복제합니다 (17)를 사용하여도 매우 재현 기술이 있음을 증명하고있다. 시간이 지남에 따라 나타나는 청색 줄무늬 아세토 니트릴의 농도가 증가로서 C18 나노 컬럼으로부터 용출 된 펩타이드이다. 분명히, 운동성 인구 (N = 3, N = 8 도시 전형적 실행), 비 - 운동성 범위에 완전히 존재하지 않는 다 651.5 범위 주위 모노 이소 ​​토픽 질량, 펩티드 클러스터있다. 탠덤 질량 분석은 다음이 펩티드를 식별하는 데 사용된다.

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그림 1 :. 카우의 부고환의 카우의 부고환의 캐 뉼러 (A) 그림. 정맥 자체는 미리 뽑아 끝 부분의 약 1-2cm를 노출 아래로 녹화됩니다. 이는 미세 # 1 5watchmakers 집게를 사용 정관에 삽입된다. (B) 캐 뉼러 정관과 캐 뉼러를 모두 포함 세그먼트 주위에 잘 실크 매로 고정된다. 마우스에서 꼬리 부고환 세포 및 유체의 약 2-3 μL를 1 × 106 / μL의 농도로 수집된다. 쥐 (도시)에서 유체의 약 30 ~ 40 μl의 비슷한 농도를 얻을 수있다.

그림 2 : 유능한 부고환 정자를 수집하는 데 사용되는 유리 모세관. (A) 카우 전자의 정점에서 하나의 가느 다란 관 pididymis 격리 및 깨진 것입니다. 이 도시되어 발생되는 대략적인 위치. (B) 이미지의 상단에는 빈 유리 모세관 튜브를 표시하고 아래는 이전에 백 플러싱 쥐에서 하나 보여줍니다. 더 혈액 오염을 최소화 상피 세포 오염이 없습니다. (C) 정자가 여전히 부고환 액에 희석하지 않았을 아르, 그들은 활성화하기 시작하지 않았습니다. 정자가 처음 BWW 솔루션으로 추방 될 때, 컴팩트 "문자열"(왼쪽)으로 나와. 10 분 후에 정자의 대부분은 어떠한 외란 (오른쪽)없이 용액에 수영 때문에 셀의 능력을 용이하게 확립된다. (D)들이 수영 왼쪽왔다 직후 꼬리 부고환 세포의 분취 량 포토 아웃 세포의 순도를 보여준다.

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그림 3 :. 메탄올 - 클로로포름 침전되면 정자 용해왔다, 가용성 분획 메탄올 - 클로로포름은 단백질과 오염 물질의 제거의 변성을 보장하기 위해 침전이다. 단백질 펠렛은 메탄올 / 물과 클로로포름 단계 사이의 인터페이스에 나타납니다. 이 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 상층을 제거한다. 그것은 어떤 단백질이 손실되지 않도록 상위 단계의 2 ~ 3 mm로 떠날 것이 일반적이다.

그림 4 :. 일반적인 이산화 티탄 풍성 포스 포 프로필 설명 프로토콜을 사용하여, 꼬리 부고환 정자는 (상위 N = 3) immotile 하나에서 분리되었다 또는 운동성이있는 상태 (아래, N = 3). ~ 651.5 D의 단일 동위 원소 질량 펩타이드 클러스터이 immotile 것 (화살표)에서 운동성이 인구에 존재하지만 완전히없는 것으로 표시됩니다. 이러한 특성의 비교는 "이 라벨없는 (MS는 기반)"라고 칭한다. 펩티드 질량 및 체류 시간은 다음 펩티드로부터 유래 된 단백질을 탠덤 질량 분석 용 화합물을 대상으로 식별하는 데 사용된다.

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.