로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

요약

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

초록

만성 염증은 병적 조직 손상과 종양,자가 면역, 및 만성 염증성 질환을 포함하여 인간에서 많은 만성 질환의 통합 특성의 주요 드라이버이다. 증거 신흥 임상 증상의 다양한 개발과 만성 질환의 진행에 병원체 - 유도 만성 염증을 연루. 때문에 만성 질환의 복잡하고 다원적 원인에 인과 관계의 증거 및 기계적인 링크의 설립을위한 실험을 설계하는 사람이 거의 불가능하다. 동물 모델을 사용하는 장점은 특정 질병의 과정에 영향을 미칠 수있는 유전 적 및 환경 적 요인이 제어 될 수 있다는 것이다. 따라서, 관련 감염 동물 모델을 설계하는 것은 만성 염증에 기여하는 호스트와 병원체 특정 메커니즘을 식별하는 중요한 단계를 나타낸다.

여기에서 우리는 병원균에 의한 만성 infla의 마우스 모델을 설명구강 병원균 Porphyromonas 진지 발리 밀접하게 인간 치주 질환과 연관된 세균 감염 다음 로컬 및 전신 사이트에서 mmation. 특정 병원체 무료 쥐의 구강 감염은 치조골, 치주 질환의 특징을 지원하는 치아의 파괴의 결과로 지방의 염증 반응을 유도한다. P.로 설립 된 마우스 죽상 동맥 경화증의 모델, 감염 진지 발리는 혈관 내피 세포의 활성화, 증가 된 면역 세포의 침윤 및 병변 내에서 염증 매개 물질의 높은 발현과 함께 대동맥 동과 무명 동맥 내 염증 플라크 침착을 가속화합니다. 우리 지역 및 전신 사이트에서 염증의 평가를위한 세부 방법론. 트랜스 제닉 마우스와 정의 된 돌연변이 세균의 사용은 호스트 및 질병의 개시, 진행 및 결과에 관여하는 미생물 인자 모두를 식별하기위한 모델이 특히 적합하다. AdditionallY는, 모델은 백신 접종과 약리학 적 개입을 포함한 신규 한 치료 전략을 선별하는데 사용될 수있다.

서론

만성 염증은 병적 조직 손상과 인간의 많은 만성 질환의 통합 특성의 주요 드라이버이다. 이 질환은 종양,자가 면역, 만성 염증성 질환 ^일을 포함한다. 많은 만성 질환의 원인은 불분명하지만, 유전 적 소인, 환경 적 요인의 도입을 모두 포함하는, 복잡하고 다원적 인 것으로 이해된다. 염증의 perpetuators이 어려운 남아 있지만, 면역 활성화 세포 및 분자 프로파일은 ^{병원균이에} 대한 호스트 응답에서 관찰 된 것과 패턴이 상당히 겹칩니다.

장착 증거는 미생물 개발에 병원균 및 만성 염증의 진행과 다양한 임상 양상 ^2,3 감염 연루. 병원균은 유도와 지속적인 감염을 호스트 면역 체계를 전복하고 구축하여 만성 염증을 직접적으로 유지할 수 ^{4. 미생물의 지속성이없는 경우, 감염은 자기 항원에 의해 유발 분자 입내 면역 반응, 면역 원성들을 렌더링자가 항원, 또는 이전에 마스킹 숙주 항원을 해제 손상의 변화에​​서 만성 염증을 석출 할 수있다. 거의 그러나 특정 병원균이 특정 만성 질환의 보편적 인 원인으로 확인 된이 없습니다. 오히려, 사용 가능한 데이터의 대다수는 병원체가 유 전적으로 감수성 호스트 3에서 임상 적 질병 결과의 광범위한 만성 염증을 유도하기 위해 별개의 메커니즘을 사용할 것을 제안한다. 따라서, 특정 병원체가 주요 공중 보건에 대한 영향뿐만 아니라, 많은 만성 질환의 치료 및 예방을 가질 수 만성 염증을 유도하는 메커니즘을 상세히 이해할.}

만성 염증의 유도 및 유지에 기여하는 호스트와 특정 병원균 메커니즘이지만제대로 병원체에 의한 만성 염증의 모델링의 발전은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해를 증진하기 시작했다, 이해했다. P. 진지 발리 경구 감염 모델은 호스트 및 병원균 로컬 (경구 뼈 손실)에서 만성 염증에 기여하는 특정 메카니즘 및 전신성 사이트 (동맥 경화증) ^5,6의 분석을 허용 병원균 - 유도 된 만성 염증의 고유 잘 특성화 된 마우스 모델이다.

P. 진지 발리는 인간 치주 질환, 조직 ^7을 지원하는 치아의 파괴를 특징으로하는 감염 중심의 만성 염증성 질환에 연루 그람 음성, 혐기성 구강 병원균이다. 감염의 초기 부위 병리학 외에 축적 증거 P. 연루 진지 발리가 개발 및 죽상 동맥 경화증 ^(5)을 포함하여 전신 질환의 진행에 만성 염증을 유도 된, 질병은 만성 inflammatio 특징동맥 혈관 벽의 명. P.와 특정 병원체 무료 쥐의 구강 감염 진지 발리는 치조골 ^(8)을지지 치아의 파괴를 초래 로컬 염증 반응을 유도한다.을 P. 진지 발리 닫 사십이일 감염 후 ⁸ 생쥐 병원균 특이 혈청 항체 역가 ^(9)의 상부를 개발할 감염된 마우스의 입으로부터 회수 할 수있다. ^{- / -} 아포지 단백질 E를 사용하여 아테롬성 동맥 경화증의 구축 마우스 모델 생쥐 (아포 E ^{- / -),} P. 경구 감염 진지 발리는 대동맥 동 ^(10)과 무명 동맥 ⁽¹¹⁾ 내에서 염증성 플라크 침착을 구동 만성 염증을 유도한다. P.의 무명 동맥 내에서 진보적 인 염증 진지 발리는 마우스 생체 내 MRI에 사용 살아있는 동물에서 모니터링 할 수 있습니다 -infected. P.에서 조직 학적으로, 동맥 병변 진지 발리는 쥐 지질 accompa의 증가 축적을 전시 -infected혈관 내피 세포의 활성화, 증가 된 면역 세포의 침윤, 염증 매개 물질 ^(12)의 상승 된 발현에 의해 nied. 녹아웃 마우스에서이 모델의 사용은 호스트 시그널링 컴포넌트 및 염증성 매개체의 역할뿐만 아니라, 셀을 구동 P. 특정 상호 작용을 밝혀왔다 ^{14 -} 진지 발리는 면역 병리 ^{(12) 유도} 된. 또한, 정의 된 돌연변이 세균을 이용한 실험은 중요한 P. 확인한 진지 발리 지역 및 전신 사이트 ^15에 만성 염증에 기여하는 요인을 독성.

이 문서에서는 P.의 평가 방법의 자세한 사항 진지 발리 지역 및 전신 부위에 만성 염증을 유도 된. 우리는 아미라 소프트웨어를 사용 microCT 의해 치조골 손실의 상세한 분석 프로토콜을 제공한다. 또한, 우리는 진보의 평가에 대한 생체 살아있는 동물 MRI에서 일련의 유틸리티를 정의무명 동맥 내 flammation. 우리는 시각화 및 동맥 병변의 염증 플라크의 정량 방법을 포함, 자신의 조직 학적 특성에 대해 설명합니다. 트랜스 제닉 마우스와 정의 된 돌연변이 세균의 사용은 호스트 및 질병의 개시, 진행 및 결과에 관여하는 미생물 인자 모두를 식별하기위한 모델이 특히 적합하다. 또한, 모델은 백신 접종과 약리학 적 개입을 포함한 신규 한 치료 전략을 선별하는데 사용될 수있다.

프로토콜

1 성장과 박테리아의 배양

1. P.의 킬 냉동 주식 혐기성 혈액 한천 플레이트 상에 진지 발리 381 3 부화 - 37 ° C에서 혐기성 챔버 (10 % H ₂ / 10 % CO ₂ / 80 % N _2)에서 5 일.
2. 5 ㎖의 뇌 심장 주입 국물 효모 추출물 (0.5 %), 헤민 (10 μg / ml)에 용해시키고, 메나 디온 (1 μg / ml)로 보충 (BHI)의 액체 문화를 접종 판 성장 생물을 사용합니다. O / N의 성장에 따라, BHI의 45 ML에 5 ㎖의 문화를 전송합니다.
3. additional18에 대한 혐기성 50 ㎖의 액체 문화를 품다 - 늦은 로그 단계 중순에서 24 시간 및 수확입니다. 문화의 참고 순도는 항상 동물에 박테리아를 도입하기 전에 그람 염색으로 확인해야합니다.
4. 10 분 동안 7,000 XG에서 원심 분리하여 박테리아를 수확. 뜨는을 대기음하고 철저하게 혈청 학적 피펫을 사용하여 5 ㎖의 PBS에있는 박테리아 세포 펠렛을 재현 탁. 추가 추가를 10 분 동안 7,000 XG에 PBS 및 45 ㎖의 원심 분리. 세 세척 총 두 번이 단계를 반복합니다.
5. 마지막 세척 후에, 배양의 1:10 희석액 660 나노 미터 (1 ₆₆₀ ¹⁰⁹ CFU / ㎖에 해당 OD)에서 1.0의 광학 밀도가되도록 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 2 % w / V 솔루션을 달성하기 위해 충분한 카르복시 메틸 셀룰로오스 (중간 viscocity)를 달다 (예를 들면, 문화 5 ㎖ 당 0.1 g). 응집을 피하기 위해 텍싱하면서 천천히 세균 현탁액에 카르복시 메틸 셀룰로오스를 추가한다.

2 구강 감염

참고도 1에 도시 된 바와 같이, 적당한 마우스 모델과 구강 감염 요법, P.를 사용 진지 발리는 만성 염증과 면역 병리 지역 (구강)에서 전신 사이트 (동맥)을 유도한다.

1. 설파를 관리 (0.87 ㎎ / ㎖) 및 트리 메소 프림 (0.17 ㎎ / ㎖) (Sulfatrim)은 8 주 - 오 방학을합니다이주에 대한 식수에 광고를 무제한으로 LD 남성 마우스는 정상 식물을 줄일 수 있습니다. 호박색 유리 병에 항생제 용액을 유지 및 열화를 방지하는 광으로부터 보호.
2. 항생제 용액의 침전을 방지하기 위해 (아침과 늦은 오후에, 즉) 한 번 또는 하루에 두 번 병을 흔들어. 5 일 - 매 3 새로 제조 한 용액으로 교체합니다.
3. 이주 후, 기존의 식수 항생제 솔루션을 대체합니다. 이전의 경구 감염에 2 일 항생제 휴식 기간을 허용합니다.
4. P.를로드 첨부 된 공급 바늘으로 한 ML의 투베르쿨린 주사기에 진지 발리 / 차량 서스펜션. 수동으로 자신의 목 뒤에 목덜미를 잡아 마우스를 억제. 그립 마우스의 머리의 이동을 제한하기에 충분한 회사입니다 확인합니다.
5. P.의 국소 응용 프로그램이 쥐를 감염 상악의 협측 표면에서 진지 발리. 공급 바늘 같은 그쪽의 위치를t 오른쪽 상악 대구치의 협측 표면에 정렬 및 세균 현탁액의 50 UL를 배출한다. 공급 바늘의 볼을 이용하여 1 분 동안 잇몸을 따라 부드럽게 용액을 분산.
6. 마우스 왼쪽 상악의 절차를 반복하기 전에 30 초 ~ 1 분 동안 휴식을 허용. 컨트롤 마우스는 항생제 전처리 및 구강 투여 차량 단독 (PBS에서 2 % 카르복시 메틸 셀룰로오스)를받을 수 있습니다.
7. 2 일 간격으로 3 회 쥐를 감염시켜 치조골 손실 유도 로컬 사이트에서 병원균 - 유도 된 만성 염증을 조사. microCT에 의한 골 소실의 평가가 6 주 후 쥐를 희생.
8. 삼주 생쥐 일주일에 5 번 ^{- / -} 로컬 및 전신 사이트의 병원체에 의한 만성 염증을 검사하려면, 동맥 경화가 발생하기 쉬운 아포 E에게 감염.
   참고 : 무명 동맥 질환의 진행은 생체 내에서 일련 MRI에 의해 모니터링된다. 이미지 다양한 시간 지점에서 마우스와 6-16 늦게 WKS 희생연구. 희생의 시간에, 얼굴 분석 엔으로 글로벌 동맥 경화 부담을 평가하고 microCT에 의해 치조골의 손실을 결정합니다. 조직학 및 면역 조직 화학 염색에 의해 동맥 경화 병변을 특성화.

3 단층 촬영 (microCT) 마이크로 계산

1. 표본 준비
   1. 원하는 시점에서 감염 후 마우스를 희생한다. CO ₂ asphyxation 또는 기관의 동물 시설의 승인을 또 다른 방법으로 쥐를 안락사.
      참고 : 다른 곳에서 ^구 바와 같이 반 P.gingivalis의 IgG의 분석을 위해 -80 ° C에서 심장 천자, 별도의 혈청 및 저장에 의해 혈액을 수집합니다.
   2. 두개골의 바닥에 심한 마우스 머리 잘린 위의 큰 쌍을 사용합니다. 포셉 한 쌍의 살을 제거하고 4 % 파라 포름 알데히드 버퍼의 30 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 두개골을 배치합니다. 4 ° C에서 48 시간 - (24)에 대한 표본을 수정합니다.
   3. 고정, rins에 따라철저하게 PBS로 표본을 전자.
   4. 상악 블록 생검을 만듭니다.
   5. microCT에 의해 평가 될 때까지 4 ° C에서 조직 학적 등급 70 % EtOH로의 헤미 - 상악을 저장합니다.
2. 이미지 획득
   1. 바탕 화면 microCT 스캐너를 사용하여 이미지 획득을 수행합니다. 114 μA의 전류 및 70 kV의 전압의 X-ray 소스를 설정한다. 이미징 용기에 개별 헤미 - 상악를 넣고 세 가지 차원 공간에서 12 μm의의 해상도로 스캔 할 수 있습니다.
      참고 : 영상 용기 내에서 동시에 여러 헤미 - 상악을로드합니다.
   2. 사용자가 시스템을 사용하여 화상 취득을 위해 경계를 묘사하고 관심 (ROI)의 영역에 주사를 제한 할 수 있도록 예비 저해​​상도 검사를 수행한다.
      참고 : 에나멜의 강도가 상악 대구치의 왕관을 쉽게 구별 할 수 있습니다. 세 대구치와 폐포 주위의 봉을 포함하는 기준으로 촬상 경계가 어금니를 느슨하게 세트 사용전자. 이 기능은 동일 용기 내에서 여러 샘플을 스캔 할 때 개별 헤미 - 상악 구별하는 데 사용됩니다.
   3. 스캔이 완료되면, 원시 이미지 파일 고품질 dicoms로 (.ISQ) (.DCM)으로 변환한다.
3. 이미지 분석
   이 프로토콜에서, 이미지 분석 데이터 시각화, 처리 및 분석 소프트웨어를 이용하여 수행된다. 첫째, cementoenamel 접합 (CEJ)에 대한 최적의 평면을 만드는 형태의 랜드 마크를 사용합니다. 이어서 치조골 볼륨의 후속 측정을위한 기준 방향으로 헤미 상악를 변환을 사용한다.
   1. 소프트웨어를 열고 풀의 왼쪽 상단 모서리에있는 "오픈 데이터"아이콘을 클릭합니다. 또한,> 열기 데이터 파일을 사용합니다.
   2. DICOM 이미지 스택을 선택하고로드를 클릭합니다. DICOM 로더 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다.
   3. 풀에 녹색 아이콘으로 데이터 세트를 관찰한다. 데이터 객체를 클릭하면 추가됩니다 알 수 있지만,톤이 풀의 상단 버튼 영역에 표시한다. 아이콘을 선택하는 것은 또한 등록 영역에 표시 될 데이터 레코드에 대한 정보를 발생.
   4. 수영장에서 각 아이콘은 서로 다른 모듈을 선택할 수있는 팝업 메뉴를 제공합니다. 데이터 아이콘의 오른쪽 모서리에있는 흰색 화살표를 클릭하여 팝업 메뉴를 활성화합니다. 디스플레이 모듈에서있는 isosurface (디스플레이>있는 isosurface)을 선택합니다. 있는 isosurface 아이콘은 풀 영역에 나타납니다. 이 옵션을 선택하면 추가 설정은 등록 정보 영역에 나타납니다.
   5. 투명 그리기 스타일 및 2000에 대한 임계 값을 설정합니다. 확인 compactify를 확인하고 다운 샘플링 버튼은 옵션에서 선택됩니다. 평균에서, 배는, y 및 z가 모두있는 isosurface를 생성하기 위해 적용을 클릭으로 설정되어 있는지 확인.
      참고 : 3D 뷰어에서 헤미 상악의 투명 3D 재구성을 준수하십시오. 화상 재구성을위한 투명한 연신 스타일을 사용하는 이점은 어금니의 뿌리 수용이하게 식별 될 수있다. 표준 방향으로 시편을 가하고 때 중요합니다.
   6. 그린 데이터 아이콘을 선택하고 속성 영역에서 자르기 아이콘을 선택합니다. 사이즈 및 데이터의 좌표를 표시하는 창을 관찰한다. 지금은 옆이 설정합니다. 경계 상자는 각 모서리에서 녹색 탭이 3D 뷰어에 나타납니다.
   7. 뷰어 도구 모음에서 인터랙트 버튼을 선택합니다. 클릭하고 녹색 모서리에 드래그하여 테두리 상자의 크기를 수정합니다. 상자가 관심 (ROI)의 영역을 포함하고 가능한 한 많은 죽은 공간과 파편을 제거해야합니다. 이것은 컴퓨터의 계산 요구를 줄이는 것이다.
   8. 완전히 경계 상자에 포함 된 투자 수익 (ROI)을 보장하는 3D 뷰어 내에서 객체를 회전 뷰어 도구 모음에서 트랙볼 버튼을 사용합니다. 만족하는 경우, 8 단계에서 따로 자르기 창에서 확인을 클릭합니다.
   9. (OB를 데이터 아이콘을 선택하고 디스플레이 모듈에서 사선 슬라이스를 선택S). (디스플레이> OBS)
   10. OBS를 선택합니다. 속성 영역에서 최고에 매핑을 선형 유형, -200에서 10,000 데이터 창 범위 및 샘플링을 설정합니다. 이제 선택은 옵션에서 회전합니다. OBS의 중심에 회전 전환을 준수하십시오.
   11. 뷰어 도구 모음에서 상호 작용 버튼을 선택하고 슬라이스의 절단면을 조정 토글의 핸들을 사용합니다. 치아의 교합면에 치아의 뿌리에 수직 병렬로 실행되는 시상면을 만듭니다. 도 2에 도시 된 바와 같이 평면은 세 어금니 (M1-M3)을 이등분한다.
   12. 회전을 끄고 OBS (object> 중복 객체) 중복. 새로운 OBS는 OBS 2 OBS에게 회전에 켭 이름이 나타납니다.
   13. 이 OBS 하나와 수직이되도록 OBS이 방향을 재 회전 핸들을 사용하여 (그림 2 참조).
   14. 전원을 켜고 OBS이 오프 회전 3 중복 조각을 만들 수 있습니다. 이들은 OBS 3, 4, 5의 이름한다.
4. 맞춤의 평면에 점을 선택
   참고 : CEJ가 최적의 평면을 만들어 함께 단계 8 점의 위치를​​ 설명 3.4.1-3.4.5. 시상 조각 및 관상 조각에서 다른 사에서 점의 사를 선택합니다 (그림 3 참조). 3.4.6에서 시상 조각에있는 점을 선택하면, OBS 일 조정해야 할 필요가있을 수 있습니다.
   1. 시상면에서 M1의 가장 근심 루트의 중심과 OBS 일을 맞 춥니 다. 관상면에서 M1의 가장 근심 루트의 중심과 OBS 둘을 맞 춥니 다.
   2. 관상면에서 M1의 부코-말단 루트의 중심과 OBS 셋을 맞 춥니 다. 필요한 경우, 20 단계에서 포인트를 선택할 때이 약 매리 져널면에서 M1의 부코-말단 루트와 중앙 그래서 OBS 일을 조정합니다.
   3. M2의 구강 뿌리의 치근과 OBS 사를 맞 춥니 다. OBS 넷은 M2의 부코 - 근심과 부코-말단 뿌리 사이를 중심으로해야합니다. 필요한 경우, OBS 일이 약 중앙 그래서 지혜를 조정시상면에서의 M2-H 부코 원위 루트 단계 (20)에서의 포인트를 선택
   4. 이 관상면에서 M3의 중심을 아래로 실행되도록 OBS 5를 조정합니다. 필요한 경우, 20 단계에서 포인트를 선택할 때이 약 시상면에서 M3의 가장 말단 루트와 중앙 그래서 OBS 일을 조정합니다.
   5. OBSS (OBS 6) 중 하나를 복제하고 속성 창에서 포인트에 맞는 선택합니다. 포인트 전환에 맞는 2D 또는 3D에 3 점 이상을 선택하는 연구자가 뷰어에있는 개체 및 다음 최적의 평면을 계산 할 수 있습니다. 이 경우, 이전 단계에서 설명한 2D OBSS는 CEJ 따라 8 점을 선택하는데 사용된다.
   6. 데이터 아이콘의 오른쪽 모서리에있는 오렌지 상자를 클릭하여 3D 뷰어에서 OBS 6을 숨 깁니다. 모든 2D 조각에 CEJ 볼 수 있도록 3D 뷰어에서있는 isosurface을 숨 깁니다. Shift 키를 누른 전술 한 바와 같이 CEJ 함께 8 점을 선택합니다.
      주 : 선택할 때 Shift 키를 누르고 있지 않은 경우포인트는, 평면은 자동으로 제 세 점 후에 계산 될 것이다.
   7. 모두 8 점을 선택한 후, OBS 6 볼 수 있도록. 이 약 교합 평면에 평행하게 실행됩니다 축 슬라이스 있음을 유의하십시오.
5. 변환 및 방향 설정 참고 : 최적의 평면은 이후의 체적 측정을위한 표준 방향으로 데이터를 변환하는 데 사용됩니다.
   1. 데이터 아이콘> 컴퓨팅> ApplyTransform을 클릭합니다. ApplyTransform 아이콘이 풀 영역에 나타납니다. ApplyTransform 아이콘을 선택 기준의 모서리에있는 흰색 사각형을 클릭하고 OBS 6 클릭합니다.
   2. 등록 정보 영역에서는 선택 보간 방법에 대한 표준 모드로 연장. 에 변형을 적용 할 수 있습니다.
   3. 있는 isosurface 및 새로운 데이터 파일에 대한 관상 OBS를 만듭니다. 그것은 (도 2에 도시) M1과 대략 직각이되도록 축 방향 OBS을 돌린다. 몰의 교두와 교합 C를 사용하여가이드로 urvatures.
   4. 단계 3.5.1과 3.5.2에서와 같이 데이터를 변환하기 위해이 비행기를 사용합니다. 변환 된 데이터 파일을 저장합니다.
6. 분할 및 뼈의 양 측정
   참고 : 아래의 단계는 치조골의 분할 및 측정을 설명합니다. CEJ위한 최적의 평면에 대응하는 슬라이스 식별과 기준면이 선택된다. CEJ와 대구치의 협측의 얼굴에 참조 평면 사이의 치조골은 분할 및 측정된다. M1의 가장 근심 루트 및 M3의 가장 말단 루트는 엔드 포인트 명소를 제공하고 있습니다. 15 ~ 20 조각 CEJ 아래 참조 평면을 설정하면 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 추가 조각의 포함은 마스크 치료 그룹 사이 뼈 볼륨의 차이 변동성을 소개합니다.
   1. 분할 편집기를 열고 변환 된 데이터에 대한 새 레이블을 만들 수 있습니다.
   2. 새로운 재료를 만들고 그것을 치조골의 이름을 지정합니다.
   3. 줌 및 데이터 창에서 데이터를 이리저리 범위 설정m 만 -200.
   4. 디스플레이 및 마스킹에서 2D 십자선, 3D MPR 및 3D 볼륨 렌더링 아이콘을 선택합니다. 2500에서 8000로 데이터 범위를 설정합니다. 데이터 마스킹을 사용합니다.
   5. 뷰어 도구 모음에서 설정 네 개의 시청자 디스플레이를 선택합니다. 디스플레이 매리 져널, 관상, 및 축 이미지 스택 동시 검사뿐만 아니라, 3 차원 볼륨 렌더링을 허용하는 사분면으로 분할된다.
   6. 에나멜 M1과 M3의 구강 얼굴에 볼 수있는 마지막 조각을 식별하는 네 개의 사분면을 사용합니다. 이 위치는 CEJ위한 최적의 평면에 상당한다. 축 슬라이스 번호를 기록합니다.
   7. 축면에서 치조골 크레스트을 향해 15 ~ 20 조각을 계속합니다. 이 참조 평면을 나타냅니다.
   8. CEJ과 기준면 사이 대구치 협측 얼굴에 치조골을 선택하는 분할 도구의 조합을 사용한다. M1의 가장 근심 루트 및 엔드 포인트의 명소로 M3의 가장 말단 루트를 사용합니다.
   9. 만족하는 경우, 자료 목록 아래 치조골에 선택을 추가합니다.
   10. 오브젝트 풀에 반환합니다. 확장자 「.Labels "와 새로운 아이콘 화상 데이터를 아이콘에 추가되어야한다. 레이블 아이콘을 선택하고 드롭 메뉴에서> MaterialStatistics을 재료를 선택합니다.
   11. 속성 영역에서 재료를 선택하고 적용 누르십시오. 표는 재료 목록에있는 각 소재에 대한 몇 가지 매개 변수를 표시 나타납니다. 치조골의 양을 기록한다.

동맥 경화의 4 평가

1. 대동맥 박리
   1. 원하는 시점 이후의 감염에 의한 질식 CO ₂ 마우스를 희생한다.
   2. 아래로 몸 윗면, 테이프에 마우스를 올려 놓고 70 % EtOH로 마우스를 닦아냅니다. 단지 xyphoid 과정 위 복부의 중앙으로부터 복부 측면에있는 피부를 잘라.
   3. xyphoid 프로세스가 보일 때까지 복부 피부를 잘라. 작은 PA로 xyphoid 과정을 들어 올려집게의 IR은 흉곽의 양쪽에 상처를 확인하고 다이어프램을 잘라. 그런 마음을 노출하는 흉곽의 양쪽 아래 두 컷을합니다.
   4. 우심실의 정점에 배치 된 27 G 인슐린 주사기를 이용하여 마우스에게서 피를 뽑다. 채혈 동안 주기적 심실 벽에 의해 개구의 차단을 방지하기 위해 바늘을 회전한다. 통상적으로, 0.8 - 1 mL의 혈액이 방법을 사용하여 얻을 수있다.
   5. SUP> 참고 : 안티 P.gingivalis의 IgG의 분석을 위해 -80 ° C에서 분리 된 혈청 및 저장은 ⁹ 다른 곳에서 설명 된대로
   6. 우심방을 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
   7. 마음의 후방 측의 좌심실을 찾습니다. 챔버의 중심을 향하도록 바늘의 베벨과, 좌심실의 정점에 21 G 바늘을 도입하고 서서히 3 순환계를 플러시 - 조직 고정액 5 ㎖.
   8. 심장을 둘러싼 트림 지방과 흉선.
   9. 루를 제거NGS.
   10. 세 가지와 대동맥 궁을 찾아 더 나은 노출을 둘러싼 지방층을 멀리 취소합니다.
   11. 다이어프램의베이스에 아치에서 대동맥 박리를 계속합니다.
   12. 간을 제거하고 하행 대동맥을 노출하는 장 조직을 치환. 신장 동맥 분지에 이르기까지 원위부​​ 대동맥을 해부하다.
   13. 신장 동맥을 잘라 회장 분기까지 절개를 계속합니다.
   14. 대동맥은 대부분의 결합 조직에서 무료로되면, 대동맥의 정상으로 돌아가 마음 위의 대동맥 세 가지의 매우 상단 부분을 싹둑.
   15. 껍질 심장 위쪽으로, 몸에서 마음을 분리하기 위해 기초 지방 조직을 자르는.
   16. 집게와 함께 마음을 잡고 계속 부착 될 수있다 결합 조직을 절단, 위쪽으로 당겨, 그리고 신장까지 계속 다리 아래로 수행 가능한 가장 낮은 지점에서 싹둑.
   17. subse 1 시간 동안 10 % 포르말린에 대동맥 수정quent PBS는 1 시간에 씻는다. 또한, 10 % 포르말린 O / N에 저장 대동맥 다음 일 PBS로 씻어 절개를 계속합니다.
   18. PBS를 포함하는 10cm 배양 접시에 장소 대동맥.
   19. 해부 범위를 사용하여 조심스럽게 대동맥에서 외막 조직을 제거합니다.
   20. 대동맥은 여분의 지방 조직이없는 경우, 심장의 아래쪽 3 분의 2 차단. 거리 대동맥의 심장의 대향 단부에서 심장 근육을 박리 시작. 대동맥의 전구 천천히 착색 흰색이 될 것이다, 나타납니다.
   21. 대동맥 전구는 심장 근육 조직의 분리 될 때까지이 집게를 사용주의 절개를 계속합니다.
   22. 검은 해부 트레이에 청소 대동맥을 놓고 PBS 커버.
2. 대동맥의 피닝
   1. 피닝에 걸쳐 PBS에 덮여 대동맥을 유지합니다.
   2. 왼쪽에있는 대동맥의 전구 해부학 적 위치에있는 대동맥을 놓습니다.
   3. 셋째 아래 하나에서 시작 5 곳) 대동맥의 상단, 2)에서 임시 minutien 핀 배치아치의 지점, 대퇴 동맥의 지점 위의 대동맥 5)를 내림차순의 하단 근처에 대동맥 4)를 내림차순의 3)의 중간.
   4. 극세 봄 가위를 사용하여, 상행 대동맥의 아래 가장 낮은 지점에 대동맥까지의 모든 방법은 대퇴 동맥의 왼쪽 지점에서 시작하여 대동맥의 왼쪽에서 잘라.
   5. 틈새에서 가장 낮은 대동맥 전구의 좌측 측면에서 잘라 내기 및 대동맥의 수직 컷을 따라 컷의 교차로에 도달하기 위해 잘라 계속합니다.
   6. 대동맥을 가로 질러 수평으로 상행 대동맥의 가장 낮은 지점의 지점에 도달합니다
   7. 대동맥 위의 가장 높은 지점에 오른쪽에 위쪽으로 잘라.
   8. 내면을 노출 각 지점을 잘라.
   9. 임시 핀의 일부를 제거하고, 접이식없이 해부학 적 위치에있는 모든 대동맥을 달아 대동맥의 스트레칭의 목적으로 영구 핀으로 교체합니다. 목표는 대동맥의 내부 표면을 노출하는 것입니다.
   10. 대동맥의 모든 내부 표면은 시각적 INT의 무료 노출 위에서 분명하게 볼 수 있고 될 때까지 달아 계속핀에서 erference.
3. 지질 염색 및 병변 정량화
   1. 수단 IV 염색 용액 (5 ㎎ / ㎖ 70 % 이소프로판올)을 준비한다. 잘 혼합하고 어떤 결정이 존재하지 않는 확인하기 위해 필터링합니다.
   2. 50 분 동안 수단 IV 용액 커버 고정 대동맥.
   3. 5 분 - 1 70 % 이소프로판올로 세척 할 것. 대동맥 탈락 물이 더 이상 빨간색 때까지​​ 조심스럽게 ddH20과 대동맥을 씻어 없습니다.
   4. PBS와 대동맥을 커버. 해부 현미경에 부착 된 고해상도 카메라로 대동맥의 이미지를 캡처하고 저장할 디지털 이미지 파일 (.TIFF). 교정을 지원하기 위해 각 이미지 옆에 통치자를 놓습니다.
   5. 병변의 내막과 면적의 영역을 결정하기 ImageJ에 소프트웨어를 사용한다. 수동 영역을 결정하는 내막 표면을 추적. 병변 면적을 자동 컬러 임계 값을 사용하여 계산 될 수있다. 이것은 정상 영역에서 병변을 판별 색상 강도를 정의하는 임계 값을 설정해야.
   6. 의 백분율을 계산죽상 동맥 경화 병변에 의해 보호 내막 표면.

동맥 경화성 병변의 조직 학적 평가 (5)

1. 심장 조직과 대동맥 궁을 수확하고 일회용베이스 금형에서 2011 년 10 월에 담그지.
2. 5 μm의 시리얼 저온부 -17 ° C에서 설정 저온 유지 장치를 사용하여 대동맥 동과 무명 동맥의 모든 50 μm의 수집 및 현미경 슬라이드에 조직 섹션을 탑재합니다. 스토어 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드.
3. 헤 마톡 실린 및 에오신 적절한 절차를 사용하여와 조직 학적 평가, 얼룩하십시오.

동맥 경화성 병변의 6 면역 조직 화학적 특성.

일반적으로 항체 기반의 프로토콜이 일상적으로 사용 개요 아래 단계 P.의 동맥 경화 병변을 평가하기 진지 발리는 쥐를 -infected. 이 프로토콜은 각 항체 또는 시약에 대한 최적화가 필요합니다.

1. 냉장고에서 슬라이드를 제거하고 수정얼음처럼 차가운 정착액 (아세톤 또는 기타 정착액)에서 2 분.
2. 슬라이드 RT에 와서 용매에 강한 펜으로 라벨을 허용합니다.
3. 린스는 조직 동결 행렬을 제거하기 위해 PBS에 3 배 슬라이드
4. 10 분 동안 0.3 %의 H에 PBS에서 ₂ O ₂ 용액을 슬라이드를 배양하여 내인성 과산화 효소 활성을 차단합니다.
5. 린스는 2 분 때마다 PBS에서 배를 슬라이드.
6. RT에서 30 분 동안 완충액 (PBS 10 % 토끼 혈청)에서 배양함으로써 차단 비특이적 결합 막기.
7. 10 % 토끼 혈청 차 항체 1:50 희석.
8. 슬라이드에 조직 섹션에 희석 된 항체를 적용합니다.
9. 실온에서 1 시간 동안 품어.
10. 린스는 2 분마다 PBS에서 배를 슬라이드.
11. 100 % 10 토끼 혈청 : 차 항체 일 오티 닐화 항 - 쥐를 희석.
12. 슬라이드에 조직 섹션에 적용하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
13. 린스는 2 분마다 PBS에서 배를 슬라이드.
14. 추가하여 DAB 기질 용액을 준비모든 1 ML의 DAB 버퍼에 DAB의 발색의 한 방울.
15. 슬라이드에서 PBS 드레인 DAB 기질 용액을 적용한다. 슬라이드를 5 분 동안 또는 원하는 색상 농도에 도달 할 때까지 배양 할 수있다.
16. 2 분마다 물 세척 3X.
17. 헤 마톡 실린와 카운터 얼룩.
18. 알코올의 사 변화 (95 % 1 분, 95 % 1 분, 100 % 1 분, 100 % 5 분)를 통해 탈수.
19. 자일 렌의 3 변경에 걸린.
20. 마운팅 용액을 사용하여 커버 슬립하고 현미경으로 질적으로 분석한다. 정량적 분석을 위해, 이미지를 획득하고 자동화 된 임계 값을 사용하여 ImageJ에와 염색 면적을 계산.

7 MRI

1. MRI에 대한 동물 준비
   1. MRI 실험을하기 전에 마우스를 마취. 유도 챔버에서 2-3 분 동안 4 % 기화 이소 플루오 란을 사용하여 마취 초기 유도를 수행한다. 0.5의 지속적인 흐름 이용한 영상주기 동안 마취를 유지 - 2 % 이소 플루오 란 delivere 기화코 콘 설정 또는 마스크를 통해 라.
   2. 마취 (즉, 아니 발가락 핀치 응답)의 수술 비행기에 도달 한 후, 코 콘에 삽입의 코를 가진 동물 홀더에 마우스를 놓습니다. 촬상 중에 전위의 움직임을 최소화하기 위해 사용될 수있는 시판 동물 소유자의 여러 종류가있다. 우리는 물린 바 맞춤 설계된 홀더를 사용합니다.
   3. 호흡과 심장주기를 모니터링하고 영상 획득이 작은 동물 모니터링 및 게이팅 시스템을 갖추고 (마우스의 복부에 위치) 호흡 베개를 이용하여 동기화 할 수 있습니다.
   4. 실험실 동물 필름 홀더 상에 마우스 및 감시 시스템을 고정.
2. MRI 데이터 취득
   1. 30mm 수직 프로브 (마이크로 2.5)으로 누운 자세에서 첫번째 마우스의 머리와 동물 홀더를 배치는 23 ° C로 유지하고에 11.7 T MRI 스캐너를 수직 낳았다.
   2. t의 중심과 홀더를 맞 춥니 다그는 코일에서 RF.
   3. 단일 펄스 시퀀스를 사용 shimming 과정을 수행.
   4. RARE 시퀀스를 사용하여, 축 관상 및 시상 이미지를 만드는 세 직교 방향을 따라 정찰 이미지를 수집.
   5. 낮은 해상도 자기 공명 혈관 조영술 (MRA)은 다음 매개 변수로 ungated 3D 그라데이션 에코 시퀀스를 사용하여 수행 슬래브 두께 = 1.5 cm를; 플립 각도 = 45 °; 반복 시간 = 20 밀리 초; 에코 시간 = 2.2 MS] 시야 = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm; 행렬 = 64 × 64 × 64; 평균 = 1 전체 스캔 시간의 수 : 2 ~ 3 분. 이 검사의 목적은 이미지가 목표 영역 (무명 동맥)에서 획득되는 것을 보장하는 것이다.
   6. 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 ungated 3D 그라데이션 에코 시퀀스와 무명 동맥의 고해상도 MRA를 수행 슬래브 두께 = 1.5 cm를; 플립 각도 = 45 °; 반복 시간 = 20 밀리 초; 에코 시간 = 2.2 MS] 시야 = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm; 행렬 = 128 &# 215; 128 × 128; 평균 = 4 전체 스캔 시간의 수는 ~ 25 분이었다.
   7. 쇄골 분기 아래 무명 동맥 0.5mm의 연속 축 이미지를 얻습니다.
3. MRI 데이터 분석
   1. 스캐너와 관련된 이미징 소프트웨어를 사용하여 영상 재구성 및 분석을 수행합니다. 최대 강도 투사에 의한 MRA 영상의 3 차원 복원을 얻을 수 있습니다.
   2. 다른 마우스 또는 서로 다른 시간 지점에서 동일한 마우스에서 수집 된 데이터를 정렬 해부학 적 마커로 쇄골 분기를 사용합니다. subclavianbifurcation 아래 0.5-mm의 거리 0.3-에서 무명 동맥의 대상 단면을 선택합니다.
   3. 정의하고 ImageJ에와 선택한 단면의 내강 면적을 계산. 측정은 두 개의 독립적 인 관찰자의 눈을 멀게 방식으로 수행되어야한다. 모델 간의 상관 계수를 계산함으로써 측정의 재현성을 확인합니다.
   4. 직렬 IMAG와 종 방향 연구ING 각 마우스에 대한 기준선 (연구에서 매우 제 가능)에서 얻어진 루멘의 영역에 내강 영역 정상화. 시간이 지남에 따라 내강 영역의 변화 등의 결과를 표현한다.
   5. 적절한 통계 분석을 수행합니다 (즉, 학생 t 시험) 실험 그룹 간의 유의 한 차이를 확인합니다.

결과

적절한 마우스 모델 및 구강 감염 요법, P.를 사용하여 진지 발리는 만성 염증과 면역 병리 지역 (구강)에서 전신 사이트 (동맥) (그림 1)를 유도한다.

에서 마우스, P. 경구 감염 진지 발리는 치조골 ^(8)을지지 치아의 파괴를 구동 로컬 염증 반응을 유도한다.을 P. 진지 발리 쥐가 주로 IgG의 아이소 타입 ^9의 아르이 생물에 대한 혈청 항체 반응을 개발 -infected. 도 4에 도시 된 결과는 C57BL / 6 이일 P.gingivalis 간격으로 3 회 감염된 microCT 의해 치조골 손실의 평가가 6 주후에 희생되는 실험의 대표이다. 아미라 소프트웨어를 사용하여 부피 분석은 P.를 보여 진지 발리 -infected 생쥐 (감염되지 ...

토론

P. 진지 발리 경구 감염 모델은 로컬 및 전신 사이트의 병원체에 의한 만성 염증의 연구를위한 유용한 도구를 제공합니다. 이 독특한 모델은 만성 염증과 면역 병리에 기여 모두 호스트와 병원체의 특정 메커니즘의 특성을 수 있습니다. 또한, 모델이 면역 및 약리학 적 개입을 포함한 신규 한 치료 전략을 선별하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜에서 설명하는 단계는 P.의 개시, 진행 및 결과를 평가하기 위해이 모델 및 세부 방법론의 성공적인 사용을 설명 진지 발리는 만성 염증 유도 된.

염증성 골 손실을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용할 때주의해야 할 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 첫째, P. 감염의 결과에 주목해야한다 감염 2) 병원균에 호스트의 1) 유전 적 감수성 : 진지 발리는 세 가지 주요 요인에 의해 결정된다독성 (병원체의 유전), 3) 결과 호스트 병원체 상호 작용 (두 개의 게놈의 상호...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amira 분석 소프트웨어	시각화 과학 그룹
혐기성 챔버 DW Scientific 모델 MG500	미생물학 국제
BHI	벡턴-디킨슨
헤민	시그마-알드리치	51280-5G
메나디온(비타민 K)	시그마-알드리치	M5625-25G
효모 추출물	Becton-Dickinson	212750
카르복시메틸셀룰로오스(중간 점도)	시그마-알드리치	C-4888
Sulfamethoxazole 및 trimethoprim 경구 현탁액 5ml 당 200 mg/40 mg	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μ 코네티컷 40	Scanco
HistoChoice 조직 고정 시	그마-알드리치	H2904
수단 IV	시그마-알드리치	S4261-25G
수직 보어 11.7T Avance 분광계	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat 안티 마우스 F4/80	Serotec	MCA497R
Rat 안티 마우스 TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 해부 스코프	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm