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방법 논문

외과 검색, 분리 및

11.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51597

⸱

2014년 4월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

이 논문에서

요약

전방 십자 인대 (ACL)의 부분적인 눈물을 복구하는 패치 향후 애플리케이션의 경우, 인간의 ACL 유래 세포는 체외에서 확장 및 조직 공학적 지지체에 성장 재건 과정 중에 얻은 조직에서 분리되었다. 세포 접착 및 형태학이어서 지지체 표면에 생체 적합성을 확인하기 위하여 실시 하였다.

초록

ACL에 부상을 활성 개인에 일반적으로 발생하는 문제입니다. 기능과 안정성에 악영향을 생 역학적 결함이 관절 내 무릎 인대 리드 부분도 눈물. 열 변형, 단일 번들 수리, 완전한 재건, 네이티브 인대의 손상 부분의 재건 : 부분 ACL 눈물의 치료를 위해 현재 옵션은 보존 적, 보수적 인 경영에서 다음과 같은 여러 수술 옵션에 이르기까지 다양합니다. 연구는 거의 모든 경우, 관리는 지속적으로 우수한 것으로에 대한 하나의 방법을 증명하고있다, 많은 경우에 환자는 지속적인 불안정과 다른 동반 질환을 설명하기 위해 계속합니다.

본 연구의 목표는 부분적으로 찢어 ACL의 수선에서 구현 될 수있는 조직 공학적 패치의 개발에 활용 가능성 셀 소스를 식별하는 것이다. 새로운 프로토콜은 patie에서 파생 된 세포의 확장을 위해 개발 된전방 십자 인대 재건술을받은 국세청. 세포를 분리하기 위해 ACL 재구성 동안 획득 다진 hACL 조직은 콜라게나 제 용액에서 분해시켰다. 확장은 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 DMEM/F12 배지를 사용하여 실시 하였다. 세포는 그 다음 DMSO, FBS와 팽창 매체로 이루어진 동결 배지에서 -80 º C의 또는 액체 질소에 보관 하였다. 해동 후, hACL 유래 세포는 조직 공학적 지지체, PLAGA (폴리 락트산 - 코 - 글리콜 산) 및 제어 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)에 접종 하였다. 7 일 후에, SEM은 제어 TCPS 대 PLAGA 셀룰러 밀착성과 비교하기 위해 수행 하였다. 세포 형태는 면역 형광 염색법을 사용하여 평가 하였다. SEM (주사 전자 현미경) 현미경은 세포가 성장하고 PLAGA 및 TCPS 양면에 부착하고 7 일째하여 전체 표면에 컨 플루 언트 된 것을 보여 주었다. 면역 형광 염색이 아닌 일반 강조 형태 학적을 보여 주었다양면에 알 패턴. 이 기술은 ACL 재생 및 재건에 응용 프로그램에 대한 약속한다.

서론

전방 십자 인대 (ACL)은 무릎 부상 일반적으로 관절 내 인대이다. 약 20 만 (ACL) 부상은 미국에서 매년보고됩니다. 정형 외과 재건 수술 1,2,3,4에 대한 ACL 부상 OPT가 발생 환자의 75 % 이상. 외과 적 수술은 종종 인해 본질적으로 가난한 치유의 가능성 (3)에 표시됩니다. 전방 십자 인대 재건술은 일반적으로자가 이식 또는 동종 이식 건을 이용하여 수행됩니다. 그들은 높은 성공률 및 차 봉합 수리, 다른 치료 옵션을 자랑으로자가 이식과 동종 이식은 재건을위한 황금 표준을 나타냅니다, 최대 94 % 5,6,7의 실패율을 보였다.

ACL의 부분 눈물이 모든 ACL의 눈물 (8)의 28 %에 10 %를 나타냅니다. 전향 적 연구에서, 노이스 등. 더 ACL의 절반 이상에 영향을 미치는 부분 눈물을 가진 환자의 50 %가 후 ACL 부족을 완료하기 위해 비 진행 추정수술 적 치료 9. 다른 연구는 지속적인 불안정을보고하고 자신의 전 상해 활동 레벨 9,10,11,12,13로 돌아갈 수의 환자 미만 30 %와 기능을 감소. 치료 옵션이 제한됩니다 보수적 인 양식, 나머지 ACL의 열 수축, 또는 전방 십자 인대 재건술이 (가) 있습니다. 최근 증강 차 수리에 대한 관심이 증가하고있다. 이 기술은 차 봉합 수리 (14)을 향상시키기 위해 생물학적 제제를 사용합니다. 최근의 연구는 중간 엽 같은 hACL는, 이식 제한을 회피하기 위해 (31, 32)를 줄기 세포를 유도하지만, 이러한 세포의 타당성과 유효성은 아직 알 수없는 수확을 시도하고있다. 조직 공학 응용 프로그램에 대한 이상적인 셀 소스 hACL은 섬유 아세포의 세포를 유도 비 mesechymal 것으로 보인다.

현재 연구는 적절한 매트릭스 재료와 설계 비계에 대한 세포 소스를 식별에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 스와로 폐기 될 찢어진 AC​​L에 대한 표준 절차재건 수술 중 rgical 폐기물은, 그러나,이 손상된 인대는 ACL 교체를 설계에 이상적인 조직을 개발하고 강화하는 데 필요한 세포의 획득을위한 품질의 소스가 될 수 있습니다. 우리 연구소는 이러한 수확 hACL 유래 세포의 체외 확장을위한 프로토콜을 개발했습니다. hACL 유래 세포 주입 설계 2D 매트릭스를 사용하여, 우리는 잠재적으로 부분 ACL 수리를 확장하고 찢어진 인대를 강화 할 수있는 패치를 설계했다.

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프로토콜

1. 수술 불러

참고 : IRB 승인이 ACL 재건 수술하는 동안 ACL 그루터기를 수집 얻었다. 사용되는 ACL 그루터기는 일반적으로 수술 폐기물로 폐기되었다으로 IRB 면제가 주어졌다. 20 명의 환자는 ACL 그루터기를 수집하는 데 사용되었다.

  1. 환자에게 기관의 프로토콜에 따라 전신 마취 및 수술 전 항생제를 관리 할 수​​ 있습니다.
  2. 지혈대를 적용하고 수축기 혈압 이상 100 ㎎의 팽창.
  3. 앙와위에서 환자를 놓다. 5mm의 포털에 대한 30 ~ 45 °의 굴곡에 무릎과 수평 외측 절개를 30 °에서 suprapatellar 주머니로 관절 경 트로 카메라를 삽입합니다.
  4. 일상적인 진단 관절 경을 수행합니다.
  5. 노치를 입력하고 찢어진 AC​​L에 막 활액막을 debride.
  6. ACL 그루터기를 식별 할 수있는 4.5 mm 면도기 및 애블 레이터를 사용합니다.
  7. 여러 개의 SPE를 수집하는 직선 쓴 짱구를 사용나머지 ACL 그루터기에서 cimens.
  8. 멸균 용기에 생리 식염수에서 샘플을 유지한다.
  9. 디코딩 및 실험실 시설에 최종 전달을 위해 병리에 견본을 보낸다.
  10. 환자를 복구하고 기관의 프로토콜에 따라 수술 치료를 수행합니다.

2. 조직 소화 hACL 격리

  1. 멸균 식염수 / PBS와 페트리 접시에 병리로부터 수신 ACL 인간 조직을 전송 (인산염 완충 염수).
  2. 1~2밀리미터 3 조각으로 멸균 가위를 사용하여 조직을 말하다 및 식염수로 3 회 이상 다진 조직을 씻어.
  3. DMEM/F-12 0.4 % 콜라게나 37 ℃에서 4 ~ 6 시​​간 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 ((50 / 50), 1X) 매체와 다진 조직 다이제스트
  4. 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 원심 분리하고 배지에서 세포를 재현 탁.
  5. 다음의 2 ~ 3 배의 배지로 세포를 씻어EED / 2 ~ 3 일 T-25 플라스크에 문화.

3. 세포 확장, 냉동 및 해동

  1. T-25 플라스크에 2 ~ 3 일 배양 세포를 시각화하기 위해 광학 현미경을 사용합니다.
  2. DMEM/F-12에서 37 ° C에서 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 ((50 / 50), 1X) 매체를 유지한다.
    참고 : 세포 부착 및 표준 형태를 표시 할 때 미디어를 변경합니다. 세포를 관찰하는 광학 현미경을 사용합니다.
  3. 7 일 (~ 1.3 X 10 6 세포 / 플라스크)에서 PBS에 합류 세포를 씻으십시오. 트립신 (0.5 g / L)을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 트립신을 중화 일시 중단 세포에 미디어를 추가합니다. 세 개의 T-25 플라스크의 미디어 세포 혼합물을 나눈다.
  4. 트립신 (0.5 g / L)를 추가, PBS로 합류 세포를 씻어 DMSO, FBS와 완전한 매체를 포함하는 매체를 동결에서 그들을 재현 탁의 (DMEM/F-12 중간 + 10 % FBS + 1 % P / S) 비 1시 2분 7초.
  5. 저장세포가 더 긴 기간 동안 저장 될 경우 세포가 한 달 내에 사용하고, 액체 질소 될 경우 -80 ° C에서 저온 유리 병.
  6. 재사용을 위해 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 해동.
    참고 : 일반적으로 90 % -95 %의 세포가 남아있다.

4. 2-D 폴리 락트산 - 글리콜 산 (PLAGA) 비계 엔지니어링 조직의 제작

  1. 20 ㎖ 섬광 유리 병에 12 ㎖의 디클로로 메탄에 PLAGA 1 g을 녹여 일정한 속도 (800 RPM)에서 8 시간 동안 솔루션을 소용돌이.
    참고 :. 굽타 등 15 자세한 설명
  2. 불화 보호 종이 줄 지어 유리 페트리 접시에 용해 된 용액을 전송합니다.
  3. 30 분 동안 진공 후드 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서 하룻밤 후 -20 ° C에서 배양 접시를 남겨주세요. 고분자의 박막을 얻기 위해 용매의 완전한 증발을 보장하기 위해 동결 건조기의 배양 접시를 놓습니다.
  4. 폴리머 Fi를 배치24 시간 동안 건조기에서 LMS.
  5. 12mm 직경의 원형 디스크에 폴리머 필름을 잘라 필요할 때까지 데시 케이 터에 보관하십시오.

5. 주사 전자 현미경 (SEM)

  1. 세포 (50,000 세포 / 디스크)를 세척 파종 7 일 to 이후 PBS와 제어 TCPS 및 PLAGA 비계에 시드.
  2. 세포를 고정 후 고정 용 0.1 M Cacodylate 버퍼에 2.5 % OSO 4 0.1 M Cacodylate 버퍼에 1.5 % 글루 타르 알데히드를 사용합니다.
  3. 0.1 M Cacodylate 버퍼를 사용하여 고정 된 세포를 씻으십시오. 15 분마다, 밤새 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 추가 건조를 위해 직렬 탈수 에탄올 (50 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 %)을 사용하여 고정 된 세포를 건조.
  4. 버튼 밸브 SEM 스퍼터 코팅 시스템의 챔버를 배출하고 상판을 올린다.
  5. 챔버에서 건조 된 샘플을 놓습니다. 상판을 낮 춥니 다.
  6. 배기를 시작하는 펌프 컨트롤 노브를 전환합니다.
  7. 오픈 아르곤 누출 밸브. 잠깐만 요진공 0.05 밀리바에 떨어 뜨리도록.
  8. 금 / 팔라듐의 얇은 층 (0.13 NM)와 코트 건조 된 샘플.
  9. 폐쇄 위치에 아르곤 누출 밸브를 돌려줍니다.
  10. 오프에 컨트롤 노브를 전환합니다.
  11. 버튼 밸브 챔버 환기와 상판을 올린다.
  12. 샘플을 제거하고 24 시간 동안 건조기에 저장합니다.
  13. 주사 전자 현미경으로 시료를 관찰한다.

6. 면역 형광 염색법

  1. 세포 (50,000 세포 / 디스크)를 세척 파종 7 일 to 이후 PBS와 제어 TCPS 및 PLAGA 비계에 시드.
  2. 10 분 동안 70 % 에탄올 (차가운)를 사용하여 세포를 고정한다.
  3. PBS는 20 분 동안 0.05 % 트리톤 X-100을 갖는 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 실온에서 고정 된 세포를 배양한다.
  4. 20 분 동안 실온에서 1 % 트윈으로 샘플을 담금.
  5. 단클론 마우스 안티-β-액틴 항체 (1:400)를 추가하고 overnigh 세포를 배양4 ° C에서 T
  6. 0.05 % 트윈으로 세포를 씻으십시오. 세포를 이차 항체 (항 - 마우스 F (AB '산양) 형광 프로브, 1:400으로 공액의 IgG 2 단편)을 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  7. PBS로 세포를 씻으십시오. 핵 얼룩 세포를 얼룩과 글리세롤 80 %를 사용하여 마운트합니다.
  8. 공 초점 현미경으로 세포를 관찰합니다.

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결과

외과 검색, 조직의 소화와 인간의 전방 십자 인대 (hACL) 유래 세포의 분리를위한 작업 모델은 그림 1에 나타내었다. 외식에서 마이그레이션 및 T-25 플라스크에 부착 된 세포를. 이 세포는 3 일 동안 배양 한 후 광학 현미경 (그림 2)에서 가시화되었다. 합류 단층은 하루 7을 얻었다. 건강, 생존 세포의 존재가 hACL 유래 세포를 성공적으로 검색 및 문화를 지적했다.

PLAGA 및 TCPS의 표면에 세포 부착은 SEM을 통해 정 성적으로 측정 하였다. 각 고분자 표면에 hACL 유래 세포의 3 전시의 부착과 증식을 그림. 휴대 합류는 PLAGA 및 TCPS 관찰되었다.

세포 형태학 및 접착 분석은 면역 형광 염색법을 통해 결정되었다. β-액틴 염색 hACL 파생 된 세포가 준수 시연D 및 PLA...

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토론

이 hACL/2D 발판 연구의 주요 목적은 부분​​ ACL 눈물의 차 수리를 증가시키기 위해 패치에서 얻은 세포를 사용하는 것이 었습니다. 부분 ACL 눈물의 비수술 적 관리는 고정, 보조기, 진보적 인 재활 프로그램, 정기적 인 후속 평가 13,16,17의 짧은 기간을 포함 할 수있다. 그러나 많은 연구는 운동 선수의 보존 적 치료가 가난한 결과와 실패와 관련되어 있음을 보여줍니다. 버클리 등 알. 중간 추시 부분 ACL의 눈물로 25 명의 환자를 평가하고 환자의 단지 44 %가 자신의 전 상해 수준에서 운동을 다시 시작하고, 72 %가 활동 관련 증상 8보고 된 것으로 나타났습니다. 박 등 알. 5.3 년의 평균에 대한 격리 된 부분 ACL의 눈물 (56) 환자를 따라 환자의 30 %는 사전에 부상 활동 10을 다시 시작했다. Fritschy 등. 부분 ACL 눈물을 가진 43 명의 환자 (18)는 5 년 후속으로 파...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

저자는 시작 기금 및 서던 일리노이 대학, 의과 대학에서 외과 연구 보조금의 부서를 인정하고 싶습니다; 및 기념 의료 재단 보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
페트리 접시Fisher Scientific08-757-103C
인산염 완충 식염수(PBS)Fisher ScientificBP3994
콜라겐분해효소Gibco17018-0294 °에 저장; C
DMEM/F-12Cellgro10-092-CV4 °에 보관;C. 37 °에 따뜻하게 보관; C 사용 전 수조.
소태아 혈청 (FBS)Gibco10082-80 ° 저장; C
페니실린/스트렙토마이신Lonza17-602E4 ° 매장; C
원심 분리기 튜브 - 15 mlCorning430790
T-25 플라스크BD Falcon3013
Trypsin-Versene 혼합물Lonza17-161E4 °C. 37 °에서 따뜻하게 보관; C 사용 전 수조.
DMSOFisher ScientificBP231-100가연성 액체. 피부, 눈 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다.
극저온 바이알Corning430489
PLAGAPurac BiomaterialsPurasorb PLG8523Store at -80 ° C
TCPS 디스크Fisher Scientific12-545-82
디클로로메탄Fisher ScientificAC36423-0010암 위험이 있습니다. 건조하고 서늘한 곳에 보관하십시오.
Bytac 종이Saint gobin 성능 플라스틱1420652
섬광 바이알Fisher Scientific03-339-21G
소 혈청 알부민 (BSA)시그마 AldrichA79064 &# 176 저장; C
TweenFisher ScientificBP337-500
마우스 항-베타;-액틴 항체 (1° Ab)Sigma AldrichA5441-20 ° 매장; C
염소-항-마우스 항체 (2° Ab)세포 신호4408-20 °에 저장된다. C
Hoechst 염료Sigma Aldrich14530-20 °에 저장; C
: 글리세롤Fisher ScientificBP229-1
글루타르알데히드Fisher ScientificBP2547-1흡입 및 삼키면 독성이 있습니다. 모든 노출 경로에서 화상을 입힙니다.
HexamethyldisilazaneFisher ScientificAC43085-1000가연성 액체 및 증기. 모든 노출 경로에서 화상을 입힙니다.
멸균 가위McKesson25-716
원심분리기Eppendorf5804R
광학 현미경OlympusCK40
수조Thermo scientific2845
VortexLabnetVX-200
유리 페트리 플레이트fisher ScientificS31473
Acu-punch아큐덤 Inc.P1225Acu-Punch는 12mm 디스크
Cacodylate bufferSigma Aldrich97068가연성 액체, 발암 물질 및 자극성을
오스뮴 테트라옥사이드Sigma Aldrich201030고독성
Triton X-100Sigma AldrichT8787삼키면 유해
Decon Labs2705열, 스파크, 화염 및 기타 형태의 발화로부터 멀리하십시오.
일반/지역 마취Amphastar 제약1% 리도카인, 0.25% 부피바카인, 유도 및 유지용 마취제
항생제Hospira0409-0805-01Ancef 1 g i.v.
관절경 투관침스미스 및 조카
관절경 카메라스미스 및 조카
관절경 그래스퍼와 쓴Arthrex
4.5mm 면도기Arthrex
간섭 나사Arthrex스테인리스 스틸 나사
스퍼터 코터PolaronE5400
은 절단하는 데 사용되었습니다. 에탄올을 함

참고문헌

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