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이 논문에서
요약
초록
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.
서론
인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라....
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프로토콜
1. 문화 미디어, 코팅 식기 hPSCs의 유지 보수의 제조
1.1 미디어 준비
참고 : 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 살균 및 저장에 대한 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 시약 이름, 회사 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나와 있습니다.
- DMEM/10 % FBS : 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖ 펜 / Strep의 5 ML L-글루타민을 결합합니다.
- HES - 중간 : 800 ml의 DMEM/F12, 200 ㎖의 KSR, 5 ㎖ L-글루타민, 5 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. FGF-2 미디어를 필터링 한 후 10 NG / ㎖를 추가합니다.
주의 : β-메르 캅토 에탄올은 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피할 것, 독성이다. - KSR-차별화 매체 : 820 ml의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 KSR, 10 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다.
- N2-differentia....
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결과
MS5-R-NC 프로토콜 (11)를 통해 R-NC 프로토콜의 두 가지 가장 중요한 개선 피더가없는, 정의 분화 조건 및 시간 요건의 전체적인 단축이다. MS5 피더 셀 (13)는 인간 배아 줄기 세포 (14)로부터의 신경 분화를 지원하기 위해 표시되었습니다 쥐의 골수 유래 기질 세포이다. 인간 배아 줄기 세포 따라서 초기 인간 신경 발달을 흉내 낸, NC 세포가 10 등장하는의 주변에, 저밀도 형태의 상피 구조와 신경 근엽 15에 MS5 피더 세포 배양. 그러나, 분자 및 성장 인자 시그널링 MS5 피더 세포로부터 방출하는지 명확하지 않다. 따라서 분화 조건을 제대로 어려운 재발 실험과 hPSC 라인을 통해이를 재현하고, 정의되어 있습니다. 적절한 신경 유도를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 합병증이 MS5 피더 세포에 작은 식민지에서 낮은 밀도로 접종 할 필요가팅 스케일링 업 및 분화 된 세포의 높은 수율에 도달. 2009 년, .......
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토론
hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의 생존과 R-NC 분화의 효율성에 영향을 미친다. 그것은 경험적으로 효율적인 NC 차별화를 지원하는 특정 KSR에서 최적의 농도와 시약의 일부 로트 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 세포에서 물방울 일 11시 replated 때, 10 ㎕의 방울 내의 셀 밀도가 높아야하고 유용한 실험적으로 결정된다. 적절한 장미와 NC-형성은 액적 내에서 적절한 세포 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 obser을 경험적으로세포가 accutase 치료 후 두 번 이상 세척 할 때 VED는 세포의 생존을 증가 시켰습니다. FAC.......
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공개 사항
저자는 공개하는 이해 충돌이 없습니다.
감사의 글
및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| 녹아웃 세럼 교체 | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | 로트 테스트 필요 |
| L-글루타민 | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| 페니신린/스트렙토마이신 | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM 최소 필수 아미노산 용액 | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-메르캅토에탄올 | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 독성 |
| 재조합 인간 FGF 염기성(FGF2) | R& D 시스템 | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 파우더 | Invitrogen | 12500-096 | |
| 글루코스 | 시그마 | G7021 | |
| 소듐 바이카보네이트 | Sigma | S5761 | |
| APO 인간 트랜스퍼린 | Sigma | T1147 | |
| 인간 인슐린 | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R& 앰프; D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Hank's Balanced Salt Solution에 분배 5 U/ml | 줄기세포 기술 | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 디하이드로클로라이드 | Tocris-R& D 시스템 | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 아스코르브산 | 시그마 | A4034 | |
| BDNF | R& D 시스템 | 248-BD | |
| FGF8 | R& D Systems | 423-F8 | |
| 마우스 재조합 음파 고슴도치(SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| 인간 재조합 EGF | R& D Systems | 236EG | |
| gelatin (Mg/Ca 없는 PBS) | 사내 | ||
| 항체: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot must be tested |
| anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting systems | AB-N07 | lot should be |
| tested APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | 로트는 |
| AlexaFluor 488 염소 안티-마우스 IgG1을 테스트해야 합니다 | Invitrogen | A21121 | 로트는 |
| Anti Oct4 mIgG2b(1:200 희석으로 사용) | Santa Cruz | sc-5279 | 로트는 테스트를 거쳐야 합니다 |
| 재료/장비: | |||
| 마우스 배아 섬유아세포(700만 세포/바이알) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| 세포 배양 접시: 10cm 및 15cm 플레이트, 원심분리기, FACS 튜브, 피펫, 피펫 팁 | |||
| 유리 혈구 분석기 | |||
| 세포 배양 원심 분리기 | |||
| 세포 배양 인큐베이터 (CO2, 습도 및 온도 제어) | |||
| 현미경 | |||
| 세포 배양 생물 안전 후드 | |||
| 세포 선별 기계, i.e. MoFlo | |||
| 도립 현미경 | |||
| 1ml TB 주사기 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| 세포 리프터 폴리에틸렌 | 코닝 주식회사 | 3008 |
참고문헌
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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재인쇄 및 허가
