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방법 논문

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

14K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51609

⸱

2014년 5월 22일

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

이 논문에서

요약

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는 적응 시험관 hPSCs에서 NC 세포의 유도를위한 분화 프로토콜이 제공됩니다.

초록

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.

서론

인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라 최대 재현성을 표시하는 것이 바람직하다.

신경 능선 (NC) 세포는 표피와 신경 상피 세포 사이의 척추 neurulation 동안 등장. 그들은 증식과 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 뼈 / 연골, 두개 안면 골격, 감각 신경, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 평활근 세포, 장내 신경, 자율 신경, 크롬 친화 세포를 포함, 자손 세포 유형의 인상적인 다양성을 일으키다 , 심장 중격 세포의 치아와 부신 / 갑상선 선의 세포 6. 따라서, NC 세포 매력적인 셀 줄기 세포들에 대한 분류 및 위해 중요이러한 Hirschsprung의 질병 7, 가족 성 자율 신경 8뿐만 아니라 신경 모세포종 9로 암과 같은 질병의 다양한 모델링. 또한, 그들은 체외에서 인간의 배아 발달의 양상을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다.

현재 널리 인간 배아 줄기 세포 (10, 11)에서 NC 세포의 유도에 대한 시험 관내 분화 프로토콜에 적용 분화 35 일까지 요구하고는 MS5 세포와 같은 기질 피더 세포에 신경 유도를 포함하고, 따라서 제대로 정의되지 않은 조건에서 수행된다. 이 NC 세포를 대량으로 생성하는 스케일 업 할 수 있지만, 높은 처리량 약물 스크리닝 4 필요한 예를 들어, 이는 노동 및 비용 집약적이다. 또한, 재현하기 어려울 수 있습니다 신경 근엽, 수동 계대을 포함하고는 hESC의 또는 hiPSC의 큰 다양성에 적용 할 경우, 따라서 특히 전반적인 변동성이 적용됩니다선. 여기서, 피더 세포의 자유 18 일간 ​​프로토콜 NC 세포의 단계적 유도가 도시된다. 이 방법은 현재 사용되는 프로토콜보다 더 짧고 더 정의된다. 또한, 다른 hiPSC 라인 구비 NC 세포 생성에 매우 강력하다. 중요한 것은이 두 프로토콜에 의해 산출 NC 세포가 신경 근엽 (이하 불리는 장미-NC 또는 R-NC)의 경계에서 나오는 것을 알 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 유도 된 세포들은 동일한 NC 마커를 표현하고 마이크로 어레이 분석에 함께 클러스터 형태 학적으로 동일하게 보인다. 새로운 프로토콜 (R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포들은 마이그레이션 및 상기 뉴런으로 분화 할 수 있도록 이전 프로토콜 (MS5-R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포와 유사한 기능이다. 따라서 세포는 MS5-R-NC 세포와 동시에 사용될 수있다. hESC의 / IPSC에서 NC 세포의 유도를위한 R-NC 세포 프로토콜은 NC의 혈통을 포함 hESC의 / IPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 도움이 될 것입니다.

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프로토콜

1. 문화 미디어, 코팅 식기 hPSCs의 유지 보수의 제조

1.1 미디어 준비

참고 : 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 살균 및 저장에 대한 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 시약 이름, 회사 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나와 있습니다.

  1. DMEM/10 % FBS : 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖ 펜 / Strep의 5 ML L-글루타민을 결합합니다.
  2. HES - 중간 : 800 ml의 DMEM/F12, 200 ㎖의 KSR, 5 ㎖ L-글루타민, 5 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. FGF-2 미디어를 필터링 한 후 10 NG / ㎖를 추가합니다.
    주의 : β-메르 캅토 에탄올은 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피할 것, 독성이다.
  3. KSR-차별화 매체 : 820 ml의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 KSR, 10 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다.
  4. N2-differentiati매체 : 980 ml의 dH보다 2 O에 12g의 DMEM/F12 분말을 녹여 1.55 g 포도당, 2g 중탄산 나트륨 100 mg의 APO 인간 트랜스페린을 추가합니다. 매체에 용해 된 솔루션을 추가, 25 mg의 인간 인슐린과 40 ㎕의 1 N NaOH로 2 ㎖ Dh를 2 O 혼합. 100 ㎕의 퓨 트레 디 히드로 클로라이드, 60 μL 셀렌, 100 ㎕의 프로게스테론을 추가하고 dH보다 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게

문화 요리의 1.2 코팅

  1. 리겔 코팅 : 해동 1 ㎖는 용해 될 때까지 나누어지는에 19 ㎖의 DMEM/F12를 피펫으로 리겔 나누어지는 냉동. 40 μm의 셀 스트레이너 및 판 (8) ml/10 cm 접시를 통과하여 덩어리를 제거합니다. 실온에서 1 시간 동안 요리를 품어. 즉시 세포를 도금하기 전에 리겔을 대기음.
    참고 : 4 ° C 이상의 온도에서 응집 할 수 있기 때문에 리겔 빠르게 작업
  2. PO / 램 / FN 코팅 : 10cm 접시에 15 ㎍ / ㎖의 폴리-L Ornithin 브롬화 수소 산염을 포함하는 1X PBS의 10 ML을 추가. 37 ℃에서 밤새 요리를 품어 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 2 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌-I 및 2 ㎍ / ml의 피브로넥틴을 포함하는 1X PBS의 10 ml/10 cm 접시를 추가합니다. 37 ℃에서 밤새 요리를 품다 세포를 도금하기 전에 완전히 솔루션을 제거하고 플레이트에 뚜껑없이 조직 문화 후드의 벽에 그들을 서서 15 ~ 20 분 동안 실온에서 건조시킵니다.
    참고 : 요리는 하나 (눈에 보이는) 표면에 결정 구조를 볼 수 있습니다 때 완전히 건조 및 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다. 번호판이 건조 상태에서 몇 시간 동안 RT에서 유지 될 수있다. PO / 램 / FN 요리 2 일간 미리 준비해야합니다. 비상 사태의 경우 램 / FN은 2 ~ 4 시간 동안 배양 할 수있다. 그러나, 이는 차선의 분화 / 생존 결과 위험있다.

hPSCs 1.3 유지

참고 : hPSCs는 0.1 % 젤라틴 및 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (M에 유지HES 매체에서 EFS를) 보충 10 NG / ML FGF-2 이전에 10, 12 설명한대로. 세포는 6~8일마다 분할해야합니다.

  1. 5 분 동안 실온에서 (마그네슘이나 칼슘없이 1X PBS에서) 8 ㎖의 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시.
  2. 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 냉동 MEFs 해동. 10 ㎖ DMEM/10 % FBS에 1 백만 MEFs를 추가합니다.
  3. 젤라틴을 기음과 세포를 접시. 최소 6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  4. 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 10 ㎖의 HES 매체를 추가, 준비된 MEF 플레이트에서 DMEM/10의 %의 FBS를 대기음. 매체는 20 분 동안 37 ° C로 예열합니다.
    참고 : hPSCs 수동 분할하는 임베디드 현미경 층류 후드가 사용된다. 그러나, 세포는 적절한 대안적인 방법을 사용하여 계대 배양 할 수있다.
  5. 임베디드 현미경으로 층류 후드에서 셀 리프터를 사용하여 별도의 식민지를 분리하고 그들을 떠 보자.
  6. 을 사용하여부동 식민지를 대기음 신선하고 따뜻한 MEF 접시에 그들을 파견하는 1 ML의 주사기. 새 접시에 세포의 약 사분의를 전송합니다. 37 ° C에서 알을 품다
  7. 신선한 HES 매체 매일 세포를 피드.

차별화를위한 hPSCs 2. 도금

참고 : hPSCs (그림 1B 참조) 분할 또는 도금 차별화 식민지가 대형 인 경우에,하지만 여전히 자신의 테두리에서 가능한 차별화 된 세포와 같은 적은 날카로운 가장자리가되어야한다. 세포 계대 설명서를 사용하여 유지하는 경우 콜로니를 쉽게 눈으로 볼 수 있도록 충분히 커야한다. 이 시점에 맞는 느낌을 얻으려면 하나는 계대없이 2 주 동안 별도의 hPSC 요리를 유지하고 세포에 도달보고를 차별화 / 계대를위한 최적의 시점을 통과 할 수있다.

  1. 분화를 시작하기 전에 리겔 1 시간으로 10 센티미터 요리를 준비합니다. 성공적인 매트 리겔이 도포 될 수있다배의 배율로 확인.
  2. hPSCs 분할 할 준비가되면, 매체를 기음과 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ㎖를 추가합니다.
  3. 하나 하나의 세포가 현미경으로 접시를 들기로 MEFs을 볼 수 있습니다 적극적으로 될 때까지 2 분 동안 수평으로 요리를 흔들어. hPSC 식민지는 식민지로 첨부 남아있다.
  4. 즉시 철저하게, 트립신을 대기음 판은 2-4 분 동안 RT에 서 보자.
  5. 플레이트에 HES - 중간 2 ML을 추가하고 P1000 피펫을 사용하여 세포를 분리.
    주 : 세포가 쉽게 표면으로부터 들어 올려 질 수없는 경우에, 플레이트가 다른 2-3 분 동안 RT에서 비어 인큐베이션 될 수있다.
  6. 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 8 ML의 HES-매체에 세포를 전송합니다.
  7. 이전에 준비 10cm 접시에서 리겔을 대기음. 리겔 판에 (한 10cm 접시에서 세포가 2 개의 10 센티미터 요리로 분할됩니다 예를 들어) 1:1 또는 1:2의 세포를 접시. 37 ° 품다밤에 C.
    참고 :이 도금은 약 10 만 셀 / ㎠가 발생한다.

신경 분화 3. 유도

참고 : 세포 90-100 % 년 합류 (그림 1C 참조), 일반적으로 다음과 같은 일 때 차별화 (0 일) 시작할 수 있습니다. 정확한 컨 플루가 아직 도달하지 않은 경우가 차별화를위한 준비가 될 때까지, 세포 HES 중간 매일 공급 될 수있다. 대안 적으로, 도금 셀의 초기 수는 증가 될 수있다.

  1. 3 0 일에, 0.1 μM의 LDN193189 및 10 μM SB431542를 포함 KSR-분화 매체를 접시 10 ml/10 cm 매일 세포를 공급.
  2. 하루 4, 5 급지 75 % KSR-분화 매체 및 25 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두.
  3. 6 일, 7 사료에 50 % KSR-분화 배지와 50 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189 및 SB4를 포함 모두31542.
  4. 하루에 8, 9 공급에 25 % KSR-분화 매체 75 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두.
  5. 하루 11 세포의 replating 1.2.2에 표시된 날에 9와 10은 PO / 램 / FN 요리를 준비합니다.
  6. 날 N2-분화 배지로 10 피드 세포 LDN193189와 SB431542를 포함.

NC 사양의 물방울 4. Replating

  1. 하루 11 대기음 램 / FN의 이전 준비 판에서와 1.2.2에 설명 된대로 그들이, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 완전히 건조 보자.
  2. 분화 세포에서 매체를 제거 1X PBS로 한 번 세포를 씻어 8 ML의 accutase/10 센티미터 요리를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어
  3. 셀 리프터를 사용하여 세포를 분리하고 5 ㎖ 피펫 accutase에이를 재현 탁. 15 ML 튜브에 현탁액을 전송합니다.
  4. 1X PBS의 5 ML을 추가, 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
  5. 10 ㎖ 1 세포를 재현 탁X PBS. 단일 세포 현탁액을 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 및 혈구 또는 이에 상응하는 기술을 사용하여 세포 수를 세는 방법을 보여줍니다.
  6. 아래 세포를 스핀 100,000의 농도 200 μM 아스 코르 빈산 (AA), 20 NG / ML BDNF, 100 NG / ML FGF8, 20 NG / ML SHH, 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함하는 N2-분화 배지를 재현 탁 -150,000 cells/10 μL.
  7. 그들이 건조 PO / 램 / FN 15cm 접시에 닿지 않고 서로 가까이 반복 - 피펫, 판 (10) μL 방울을 사용.
    참고 : 분화 된 세포의 한 10cm 접시는 일반적으로 약 2 ~ 3 배 15cm 접시 또는 약 100 × 10 μL의 droplets/15 센티미터 요리를 초래한다.
  8. 물방울 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ㎖를 추가하고 37 ℃에서 부화 (방울을 방해하지 않는) 매우 신중하게 한 다음, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자
  9. 하루에 12에서주의 깊게 20 ml/15 cm 접시 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH으로 세포를 공급.
  10. 다에서Y 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8으로 모든 두 번째 또는 세 번째 날 세포를 공급.
  11. 하루에 16, 17에 FACS 정렬 후 NC 세포를 replate하는 PO / 램 / FN 판을 준비합니다.

오. 형광 활성화 된 셀 NC 셀들 (FACS)를 정렬

참고 : FACS에 대한 세포의 준비는 약 2 시간이 필요합니다.

  1. 18 일째 제거 매체에서 접시에 1X PBS로 한 번 세포를 세척하고 12 ML의 accutase를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어
  2. 셀 리프터를 사용하여, 표면으로부터 세포를 분리하고 그들을 플로트하자. 50 ML 튜브로 전송하고 1X PBS 30 ㎖를 추가, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 현탁액에 세포를 피펫. 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
  3. P1000 피펫을 사용하여, 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS (HBSS 15 mM의 HEPES를 포함)에있는 세포를 재현 탁. 2 % FBS / HBSS의 19 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 할 수 있습니다. 15m 얼음에 세포를 품어항체 블로킹에서 다음 혈구를 사용하여 계산합니다.
  4. 아래 세포를 스핀 및 2 % FBS / HBSS에서 천만 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을.
  5. 컨트롤 만 (APC 만 및 488 만) FACS 염색 흠, 단일 염색 (HNK-1 만 만 P75) 및 이차 항체에 대한 1 백만 세포에게 별도로 각을 설정합니다.
  6. 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 천만 셀 당 P75 차 항체의 HNK-1과 5 μL의 5 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어.
  7. 10 ㎖의 1X PBS (114 XG에 원심 분리기 5 분)에서 세포를 세척하고 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS에있는 세포를 재현 탁. 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 APC의 2 μL 및 1,000 만 셀 당 488 차 항체의 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 품어.
    참고 : APC와 488은 각각 HNK-1, P75 염색 여기에 사용되는 이차 항체이다.
  8. 10 ㎖의 1X PBS로 세포를 씻어 두 번, 500 ㎕의 1 천만 세포를 재현 탁DAPI (0.5에서 NG / μL) 또는 FACS 분석에서 죽은 세포를 제외 할 수있는 대체 라이브 셀 얼룩을 포함하는 2 % FBS / HBSS.
  9. FACS 튜브를 충당하기 위해 샘플을 전송합니다.
  10. 세포 수집에 0.5 ㎖의 2 % FBS / HBSS와 FACS 튜브를 준비합니다.
    참고 : 세포 및 수집 튜브가 정렬 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 보관됩니다.
  11. DAPI, APC와 488 종류의 DAPI-/HNK-1 + / P75 + 더블 양성 세포를 검출 할 수있는 레이저와 셀 정렬 기계를 사용.
    주 : 이들 세포가 정렬 된 모집단에서 제외하기위한 준비 시간 및 셀의 처리는 세포 사멸의 작은 비율에 이르게 DAPI 얼룩 사균에만 따라서 허용한다. 어떤 대안 죽은 / 라이브 얼룩은이 목적을 위해 동일하게 작동합니다. DAPI 자체는 살아있는 세포 인구의 세포 독성을 유발하지 않습니다.

6. 순위 세포의 Replating, NC 유지 보수 및 확장

참고 : FACS 분류 세포는 손이어야한다최적의 생존을 보장하기 위해 특별한주의와 함께했다. 그들을 replating까지 얼음에 있습니다. 와동 또는 가혹를 피펫하지 마십시오. 셀은 튜브를 가볍게 치면 재현 탁 될 수있다.

  1. FACS 정렬 한 후, 그 아래로 회전 한 후, NC 세포를 계산하고 N2-분화 배지에서 재현 탁 30,000 세포에서 그들을 replate에 해당하는 양의 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 / 10 μL 방울.
  2. 완전히 건조 이전에 PO / 램 / FN 접시와 10cm 접시 당 플레이트 약 50 ~ 70 방울을 준비했다. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자.
  3. 매우 조심스럽게 방울을 방해하지 않고 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어
  4. N2/FGF2/EGF으로 2-3 일마다 세포를 공급.
    참고 : 그들은 방울 내에서 말뚝 박기 시작할 때 NC 세포가 확장 또는 계대마다 약 4 ~ 5 일이나된다.
  5. 통로 NC 세포는 배지, WA 제거SH 세포는 한 번 1X PBS와 및 CM 요리 accutase/10 8 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어
  6. 5 ㎖ 피펫을 사용하여 플레이트 떨어져 세포를 피펫과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. PBS 1X 6 ML을 추가합니다.
  7. 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀.
  8. 물방울 μL 20,000 cells/10을 위해 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 N2-분화 배지에서 세포를 Resuspend.
  9. 건조 PO / 램 / FN 판에 10 μL 방울의 세포를 Replate. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자.
  10. 조심스럽게 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 알을 품다
    참고 : NC 세포가 유지되거나 상대적으로 균일 한 전구 인구로 최대 2 주 동안 확장 할 수 있습니다. 더 이상 문화가 다양한 자손 세포 유형으로 분화하도록 발생할 수 있습니다.

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결과

MS5-R-NC 프로토콜 (11)를 통해 R-NC 프로토콜의 두 가지 가장 중요한 개선 피더가없는, 정의 분화 조건 및 시간 요건의 전체적인 단축이다. MS5 피더 셀 (13)는 인간 배아 줄기 세포 (14)로부터의 신경 분화를 지원하기 위해 표시되었습니다 쥐의 골수 유래 기질 세포이다. 인간 배아 줄기 세포 따라서 초기 인간 신경 발달을 흉내 낸, NC 세포가 10 등장하는의 주변에, 저밀도 형태의 상피 구조와 신경 근엽 15에 MS5 피더 세포 배양. 그러나, 분자 및 성장 인자 시그널링 MS5 피더 세포로부터 방출하는지 명확하지 않다. 따라서 분화 조건을 제대로 어려운 재발 실험과 hPSC 라인을 통해이를 재현하고, 정의되어 있습니다. 적절한 신경 유도를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 합병증이 MS5 피더 세포에 작은 식민지에서 낮은 밀도로 접종 할 필요가팅 스케일링 업 및 분화 된 세포의 높은 수율에 도달. 2009 년, ...

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토론

hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의 생존과 R-NC 분화의 효율성에 영향을 미친다. 그것은 경험적으로 효율적인 NC 차별화를 지원하는 특정 KSR에서 최적의 농도와 시약의 일부 로트 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 세포에서 물방울 일 11시 replated 때, 10 ㎕의 방울 내의 셀 밀도가 높아야하고 유용한 실험적으로 결정된다. 적절한 장미와 NC-형성은 액적 내에서 적절한 세포 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 obser을 경험적으로세포가 accutase 치료 후 두 번 이상 세척 할 때 VED는 세포의 생존을 증가 시켰습니다. FAC...

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공개 사항

저자는 공개하는 이해 충돌이 없습니다.

감사의 글

및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
태아 소 혈청 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
녹아웃 세럼 교체Gibco-Life Technologies10828-028로트 테스트 필요
L-글루타민Gibco-Life Technologies25030-081
페니신린/스트렙토마이신Gibco-Life Technologies15140-122
MEM 최소 필수 아미노산 용액 Gibco-Life Technologies11140-050
β-메르캅토에탄올 Gibco-Life Technologies21985-023독성
재조합 인간 FGF 염기성(FGF2)R& D 시스템233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM/F12 파우더 Invitrogen12500-096
글루코스시그마G7021
소듐 바이카보네이트 SigmaS5761
APO 인간 트랜스퍼린SigmaT1147
인간 인슐린 SigmaI2643
Putriscine dihydrochlorideSigmaP5780
SeleniteSigmaS5261
ProgesteroneSigmaP8783
Matrigel matrixBD Biosciences354234
Poly-L Ornithin hydrobromideSigmaP3655
Mouse Laminin-IR& 앰프; D Systems3400-010-01
FibronectinBD Biosciences356008
Hank's Balanced Salt Solution에 분배 5 U/ml줄기세포 기술7013
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 디하이드로클로라이드Tocris-R& D 시스템1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
아스코르브산 시그마A4034
BDNFR& D 시스템248-BD
FGF8R& D Systems423-F8
마우스 재조합 음파 고슴도치(SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
인간 재조합 EGFR& D Systems236EG
gelatin (Mg/Ca 없는 PBS)사내
항체:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTlot must be tested
anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)Advanced Targeting systemsAB-N07lot should be
tested APC rat anti-mIgMBD Parmingen550676로트는
AlexaFluor 488 염소 안티-마우스 IgG1을 테스트해야 합니다 InvitrogenA21121로트는
Anti Oct4 mIgG2b(1:200 희석으로 사용)Santa Cruzsc-5279로트는 테스트를 거쳐야 합니다
재료/장비:
마우스 배아 섬유아세포(700만 세포/바이알)GlobalStemGSC-6105M
세포 배양 접시: 10cm 및 15cm 플레이트, 원심분리기, FACS 튜브,  피펫, 피펫 팁
유리 혈구 분석기
세포 배양 원심 분리기
세포 배양 인큐베이터 (CO2, 습도 및 온도 제어)
현미경
세포 배양 생물 안전 후드
세포 선별 기계, i.e. MoFlo
도립 현미경
1ml TB 주사기 27Gx1/2BD Biosciences309623
세포 리프터 폴리에틸렌코닝 주식회사3008
를 테스트해야 합니다..이 내장된 세포 배양 층류 후드

참고문헌

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HNK 1 p75Poly L ornithineN2
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