이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
골수(BM)의 세포 구성에 대한 연속 샘플링은 임상 혈액학에 중요한 일상적인 절차입니다. 이 프로토콜은 BM에 존재하는 세포의 연속 특성화를 허용하는 살아있는 마우스의 유사한 절차에 대한 자세한 단계별 기술 절차를 설명합니다. 이 절차는 예를 들어 이종 이식 연구에서 수행되는 것처럼 마우스의 BM 내에서 외인성으로 투여된 세포의 존재를 감지하는 것을 목표로 하는 연구를 용이하게 합니다. 또한, 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 같은 BM이 풍부한 세포의 검색 및 특성화를 가능하게 합니다. 말초 혈액의 세포 구성이 반드시 골수에 존재하는 줄기 및 전구 세포의 비율과 유형을 반영하는 것은 아니라는 점을 감안할 때, 생쥐를 제거하지 않고 이 구획에 접근할 수 있는 절차는 매우 도움이 됩니다. 골수 세포의 세포학적 분석, 조혈 줄기/전구 격실의 유세포 분석 특성화, 기존 골수 수확과 비교하여 대퇴골 BM 흡인으로 얻은 분류된 HSPC의 배양을 위해 대퇴골 골수 흡인의 사용이 여기에 설명되어 있습니다.
서론
모든 혈액 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래합니다. 동물을 희생할 필요 없이 생쥐와 남성의 대다수 HSC 부위인 골수(BM)에 접근할 수 있는 절차는 조혈의 원인을 연속적으로 모니터링할 수 있는 자원을 제공합니다. 여기에 설명된 절차의 전반적인 목표는 마우스의 희생을 통해 BM 세포의 기존 수확에 의해 회수될 세포를 대표하는 물질을 제공하는 살아있는 마우스의 대퇴골에서 BM 세포의 샘플링을 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 기존의 BM 세포 수확에 비해 이 절차의 장점은 이 절차가 마우스의 희생을 필요로 하지 않으므로 시간이 지남에 따라 마우스의 골수 구획에 대한 종단 연구가 가능하다는 것입니다.
이 쥐 골수 흡인 절차는 많은 연구에서 사용되어 왔으며 이전에 설명되었습니다 (Sundberg et al. 역사적 검토를 위해1), 이 기술을 설명하는 공식적인 단계별 절차는 이전에 발표되지 않았습니다. 이 프로토콜은 외인성으로 마우스에 도입된 세포의 BM에 있는 생착 평가 (예를 들어2,3의 경우 이종 이식 연구에서 수행됨), 말초 혈액의 그것과 비교하기 위한 BM의 키메라 분석(결과가 반드시 일치하지는 않는 경우), 조혈 줄기 및 전구 세포와 같이 골수에서 일반적으로 풍부하게 하는 특정 세포 유형의 풍부함을 모니터링하는 등의 목적으로 BM의 일상적인 연속 샘플링을 가능하게 합니다. 및 생체 외 배양 및/또는 이식을 위한 BM 세포 회수. 또한, 말초 혈액에서 질병이 뚜렷하지 않을 수 있는 시점에서 흡인이 혈액 질환 부담을 평가하는 데 도움이 되기 때문에 골수 함량 평가는 혈액 질환의 쥐 모델에서 매우 유용할 수 있습니다3-5. 또한, 이 기술은 치료 연구에서 투여된 약물에 대한 골수 내 혈액 질환의 반응을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 여기에 설명된 절차는 마우스에 대한 희생이나 해를 입히지 않고 세포학적 분석, 유세포 분석, 체외 배양 및/또는 생체 내 이식 연구를 위해 마우스의 골수 조혈 세포에 액세스하고자 하는 조사자에게 이상적입니다.
여기에 설명된 BM 샘플링 프로토콜은 골수강에 직접 재료를 대퇴골 내 주입하는 데 사용되는 기술과 매우 유사합니다3,6. 가장 큰 차이점은 이 프로토콜은 대퇴골 내 주사와 같이 골수 공간 내에 물질을 직접 주입하는 것과는 대조적으로 골수에서 세포를 제거하는 절차를 자세히 설명한다는 것입니다.
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시하고, 메모 리얼 슬로안 - 케터링 암 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었다.
대퇴골에서 골수의 1. 흡인 (BM) 세포
- 정밀 기화기 투여 이소 플루 란 (1-4 %)과 대퇴 골수 흡인을 받게 될 것이다 마우스를 마취. 마취 심도가 수술 조작 및 / 또는 귀, 발가락, 테일 핀치와 관련된 호흡에 변화가없는 것을 관찰함으로써 절차 내내 매 50-10 분을 모니터해야한다. 마취는 이소 플루 란으로 유도하고 또한 이소 플루 란과 절차를 통해 유지된다. 0.05-0.1 밀리그램의 부 프레 노르 핀 투여 량의 선제 사전 절차 용량 / kg 피하 매 6-12 시간은 ADJ로 절차와 관련된 통증을 방지하는데 사용될 수있다Carprofen에 unct.
- 각막 건조를 방지하기 위해 마취의 마우스 다음 유도의 눈 안과 연고를 적용합니다.
- 모피는 신중하게 의도 열망 사이트의 면적보다 약 150 % 더 큰 피부의 영역에서 잘립니다. 느슨한 모피는 촉촉한 거즈 패드로 제거됩니다. 절차를 수행하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 순환 온수 패드 또는 다른 안전한 온도 조절 장치로 통제 된 표면에서 마우스를 보관하십시오.
- (포비돈 요오드 (베타 딘) 또는 클로르헥시딘 (Nolvasan) 스크럽 70 % 이소 프로필 알코올이나 70 % 에탄올을 적신 거즈 스폰지 하나와 교류) 교류 수술의 세 가지 세트로 포부를 받게 될 것이다 대퇴골을 포함하는 전체 다리를 소독.
- BM을 흡입하기 전에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 :; : 0.5 ㎖ 투베르쿨린 주사기 (27.5 G 게이지 0.5 cc의 볼륨)을 적 십니다. PBS의 200 ~ 500 ㎕ 씩 주사기를 입력하고 즉시 PBS를 추방. 이 절차 2-3t를 반복IME를.
- 반지 손가락 또는 다섯 번째 손가락 하나와 경골을 눌러 대퇴골에서 경골의 굴곡을 유지합니다. 적절한 마취 비행기가 달성되었는지 확인합니다. 주사기는 엄지와 집게 손가락을 사용하여 유지된다. 이는 관절 구가 노광 될 수 있도록하고 바늘의 삽입을 용이하게한다.
- 바늘이 대퇴골 두 관절 구 사이에 단단히 박혀되도록 주사기를 적시 한 후, 슬개를 통해 바늘을 삽입합니다. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 대퇴골 골단 부근 골간을 유지함으로써, 바늘이 쉽게 대퇴골의 샤프트에 삽입된다.
- 이 대퇴골 축과 평행이되도록 외측으로 상향 바늘 스위블. 이 작업은 대퇴골 축에서 골수 내용의 검색을 용이하게한다.
- 대퇴 골수 구멍으로 천천히 누르면서 시계 반대 방향으로 바늘을 시계 방향으로 돌려. 온화 싸이 이동하여 바늘의 정확한 위치 확인옆으로 ringe.
- 앞뒤로 BM 캐비티 내에서 바늘을 이동하는 동안 부드럽게, 부정 압력을 생성, 다시 바늘 플런저를 잡아 당깁니다. 주 : 흡입 된 BM의 부피는 일반적으로 0.4-0.8 × 106 단핵 세포에 상당 약 5 μL 것이다. 성공 열망은 주사기의 기지에있는 바늘의 위쪽에있는 혈액의 모양을 시각적으로 확인 될 것이다. 피가 주사기에서 볼 경우 그것은 작은 뼈 또는 조직 조각이 바늘에 걸린 가능성이 높습니다. 이것은 (이것은 주사기 BM 흡입 전에 PBS로 채워져해야 하나의 이유이다) PBS에 상하 플런저를 이동함으로써 바늘로부터 제거 될 수있다. 조직이 주사기로부터 빠질 수없는 경우, 새로운 바늘과 주사기 (다시 PBS의 200-500 μL와 주사기를 젖은 상태) 사용.
- BM이 성공적으로 대퇴골에서 흡입되면, 대퇴골 및 마우스에서 바늘과 주사기를 제거합니다.
- 의 미세 튜브 홍보에 흡입 된 BM 이동PBS 500 μL와 efilled. 대부분의 응용 프로그램, BM 세포는 추가 처리를 가능하면 때까지 얼음에 보관해야합니다.
- 절차의 완료 후, 5 ㎎ / ㎏ 피하 carprofen으로 진통을 관리 할 수 있습니다. 그 후 마취에서 마우스를 제거하고 완전히 회복 될 때까지 가열 패드에 배치합니다. 참고 : 만약 제대로 흡입 절차에 따라 경험 합병증이나 고통이 없어야합니다.
- 주택 지역에 마우스를 반환하기 전에, 그들은 음식과 물을 ambulate 및 도달 할 수 있는지. 다음 24 시간에 고통이나 감염 후 절차의 징후 쥐를 관찰합니다. 증상은 다음을 포함한다 : 지속적인 출혈, 빈혈, 혼수를. 이러한 징후는 포스트 절차를 보이는 경우, 동물 (들) 안락사한다. 주 : BM 흡입 / 샘플링을 반복 할 수 있지만 반복 절차는 동일 다리 반복 외상을 방지하기 위해 대향 대퇴골을 수행하여야한다. FR에 대한 가능한 약간의 정보가있다equency 그 BM 열망을 수행 할 수 있습니다. 대퇴 골수 흡입은 일반적으로 더 자주 매 2 주 이상 반복되지 않습니다.
으로 발음 BM 세포의 세포 내용의 2. 평가
- 4 O를 C 또는 RT에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 미세 원심 분리 튜브에 BM 열망과 장소에서 검색 펠렛 세포.
- 뜨는을 대기음 후 ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 ( "암모늄, 염화 칼륨,"용해 버퍼) 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
- 10 분 동안 적혈구 용해 완충액에 세포를 부화 후 PBS 1 ㎖를 추가하고 4 입출력 C 또는 RT에서 5 분 동안 300 XG에 다시 혼합물을 스핀 다운. 참고 : 적혈구 용해 펠릿 지금 BM 단핵 세포로 구성되어 있습니다. 이들은 FACS 염색, 세포 계수, 이식, cytospin 분석 및 / 또는 기타 사용 (희생 생쥐에서 수확 BM 세포를 사용하는 것처럼)에 재현 탁 할 수있다.
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결과
라이브 C57/B6 마우스의 대퇴골 BM 흡입은 희생 후의 같은 종래의 마우스 BM 수확 하였다 BM 단핵 세포를 수득하는 데에 이용 하였다. 이 방법에 의해 얻어진 BM 단핵 세포이어서, BM 세포 (1) 세포 학적 분석에 의해 분석 (2) 조혈 줄기 / 전구 세포의 상대적인 주파수 (HSPCs)를 결정하고, 소트 HSPCs (3) 체외 배양 하였다. 후자의 실험, 혈통 부정적인 SCA1 + C-KIT에서 + (LSK) 세포는 BM 흡인에 의해뿐만 아니라 기존의 BM 수확 단핵 세포에서 분류되었다. 각각의 방법에 의해 얻어진 150 LSK 세포는 다음 기술 중복 7 일 동안 골수 - 적혈구 사이토 카인을 포함하는 메틸 반 고체 미디어 도금했다. 그림 1에 나타낸 데이터, B는 대량 세포와 HSPCs의 유사한 유형 및 비율이 형태 학적으로 볼 대퇴 BM 흡인 또는 기존의 BM 수확 중 하나를 사용하여 유세포 분석 흐름되었다는 것을 보여줍니다.
<...액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
직렬 BM 열망은 인간의 혈액 학적 장애의 임상 연구에 중요한 일상적인 절차입니다. 긴 실험을 통하여 세포의 구성 및 BM의 성분의 특성에 마우스에서 BM의 유사한 일련의 샘플링을 수행 할 수있는 능력 역시 매우 중요합니다. 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 또한 말초 혈액의 내용이 BM에 거주하는 세포의 반사되지 않을 수 인스턴스에서 BM있는 추가적인 세포 유형의 존재를 검출하기위한 HSPC의 특성화에 유용하다. 직렬 BM 열망은 인간 세포의 존재, 예를 들어 3 면역 억제 마우스에 이종 이식 모니터링이 나중에 목적을 위해 매우 효과적으로 사용되어왔다. 0.4-0.8 × 106 세포는 일반적으로 각 BM 흡인으로 검색되는 것을 감안할 때, 이러한 세포는 세포 학적 분석 (도 1a)을 포함한 다수의 목적, 디아 위해 이용 될 수있다영지 유동 세포 계측법 (도 1b), 세포 (도 1c)의 배양 등 정...
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
O.A.-W.는 NIH K08 Clinical Investigator Award(1K08CA160647-01), U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research(W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Investigator Program 및 Evan's Foundation의 지원을 받는 Damon Runyon Clinical Investigator Award의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| 둔감한 혈청 알부민 | PAA | K41-001 | |
| ACK 용해 완충액 | 수제 | . pH를 조정하십시오 7.2 ~ 7.4 및 0.22 &mu로 무균 여과기; m 진공 필터. | |
| 8.3 g 염화 암모늄 | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g 중탄산 칼 | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml 투베르쿨린 주사기 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| 멸균 세포 여과기 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| 무툼 바늘 | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide 바늘 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml 주사기 Luer-Lok 팁 | Becton Dickinson | 309657 | |
| 비조직 배양 처리 플레이트, 6 웰 | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml 튜브 | Becton Dickinson | 352054 | FACS 염색 |
| 12 x 75 mm 5 ml 튜브(세포 여과기 캡 포함 | Becton Dickinson | 352235 | FACS 염색 |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G 및 Ly-6C(Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117(c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E(Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | 메토셀룰로오스 배양용 |
| Carprofen | Crescent Chemical 회사 | C11045850 | 1회 투여량(5mg/kg) |
| 유세포 분석기, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet 연고 (멸균 바셀린 안과 연고) | Dechra-US | 17033-211-38 |
참고문헌
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
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