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방법 논문

이소성 심장 이식 마우스 모델을 사용하여 폐동맥 판막 이식

18.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51695

⸱

2014년 7월 23일

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1Tissue Engineering Program and Surgical Research, Nationwide Children's Hospital, 2Cardiothoracic Surgery, Nationwide Children's Hospital, 3Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital

이 논문에서

요약

조직 공학 심장 판막에 neotissue 형성 및 협착증 개발을 기초 세포 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 이소성 심장 판막 이식 뮤린 모델이 개발되었다. 폐동맥 판막은 이소성 심장 이식 기술을 사용하여 수신자에게 이식 하였다.

초록

조직 공학 심장 판막, 특히 decellularized 밸브, 혼합 결과와 교정 수술의 임상 사용에 추진력을 얻기 시작됩니다. 그러나, neotissue 개발, 밸브 두껍게, 그리고 협착 개발의 세포 및 분자 메커니즘은 광범위하게 연구되어 있지 않습니다. 위의 질문에 대답하기 위해, 우리는 쥐의 이소성 심장 판막 이식 모델을 개발했다. 심장 밸브는 밸브 기증자 마우스에서 수확 및 심장 기증자 마우스에 이식했다. 새로운 밸브 마음은받는 사람 마우스 heterotopically 이식했다. 이식 된 심장은받는 사람의 심장 박동의 독립적 인 자신의 심장 박동을 보여 주었다. 혈류는 펄 스파 도플러와 고주파 초음파 시스템을 이용하여 정량 하였다. 이식 된 폐 밸브를 통과하는 흐름은 최소한의 역류와 흐름을 앞으로 보여 피크 흐름은 100mm / 초에 가까웠다. 심장 판막 이식이 쥐 모델은 highl입니다다목적 Y, 그래서 수정 된 다른 혈역학 환경을 제공하기 위하여 및 / 또는 조직 공학 심장 판막에 neotissue 개발을 연구하기위한 다양한 트랜스 제닉 마우스와 함께 사용할 수있는 적응 될 수있다.

서론

선천성 심장 결함은 서쪽 세계 1,2에서 유아 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 그 중, 폐동맥 판막 협착과 뾰족한 끝이 둘있는 대동맥 판막 결함이 자주 발생하는 형태 3입니다. 심장 판막 교체 수술은 재건 수술의 일상적인 선택이 될 것입니다; 그러나, 협착 및 석회화 심장 밸브 및 항응고제에 평생 의존 등의 합병증은 만성 건강 쇠약과 죽음 4-7의 중요한 원천입니다. 또한, 성장 잠재력의 부족은 더욱 그 젊은 환자 4,8,9의 사망률을 증가시키는 개정 수술을 필요로합니다.

생분해 성 합성 심장 밸브 (8) 상에 성장 잠재력, Shinoka 외. 시드자가 세포와 기능적 여분 심장 밸브를 개발하기위한 시도. 성장 potenti와 같은 구조 네이티브 심장 밸브로 변환 합성 밸브알. 예비 많은 동물 연구는 기능적인 심장 밸브 (10)를 생성하기 위해이 방법을 사용할 수있는 가능성을 보여 주었다. 그러나, 장기 이식 연구 인해 심장 판막의 협착 발생 밸브 neotissue 점진적으로 두껍게별로 내구성을 보여 주었다. Sodian에서 작업 등. Shinoka 방법을 사용하지만, 궁극적으로 더 많은 생리 학적 프로파일 9,11,12을 구성 조직 설계 밸브의 생 역학적 특성을 준 생분해 성 엘라스토머와 PGA 매트릭스를 대체했다. 생체 내 연구에서는 이식의 성공에도 불구하고, 합류 내피 세포 라이닝이 지지체 (12)의 장기 성공을 제한 할 수있는 형성되지 않았다.

합리적 개선 번째 세대 합성 심장 밸브를 설계하기 위해, 심장 판막 이식 뮤린 모델은 세포 및 분자 메커니즘 underlyin을 조사하기 위해 만들어진G의 neotissue 형성, 밸브 두껍게, 그리고 협착 개발. 쥐 모델은 다른 종 7에서 쉽게 사용할 수없는 형질 전환 등의 분자 시약의 광대 한 배열을 제공하고 있습니다. 이 심장 판막 이식 모델에서 생체 동계 폐 심장 판막 치환술은 우선 수행 하였다; 다음 주입 심장 밸브와 심장은 미세 수술 기술을 이용하여 동계 호스트로 heterotopically 주입 하였다. 이 모델은, 체외 순환을위한 필요없이 심장 밸브 교체를 가능하게한다.

이 논문에서, 심장 판막 수확에 대한 자세한 설명은, 기증자의 심장 준비, 심장 판막 이식, 이소성 심장 이식이 설명되어 있습니다. 결과는받는 사람의 심장 박동의 독립적 인 한 기증자의 심장에서 연속적인 심장 박동을 보여 주었다. 주입 폐동맥 밸브를 통해 혈류는 펄 스파 명소와 고주파 초음파 시스템을 이용하여 측정 하였다ppler.

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프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

심장 밸브 기증자 마우스 1. 폐 심장 밸브 수확

  1. 수술 전에 수술 도구를 압력솥 : 미세 가위, 배 마이크로 집게, 배 미세 혈관 클램프, 1X 클램프 적용 집게, 1X 마이크로 니들 홀더, 1X 봄 가위, 1X 트랙터를 1x는.
  2. 6-8 주 된 여성 C57BL / 6 마​​우스는 폐 심장 판막 기증자로 사용됩니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 무게를 달고, 다음 케타민 / 자일 라진 칵테일 (케타민, 200 ㎎ / ㎏과 자일 라진, 20 ㎎ / kg, IP) 과다 복용으로 안락사.
  3. 가슴 부분을 클립 및 패드에 지느러미 드러 누움 위치에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 개흉술을합니다. 심장을 노출 우심방에 작은 상처를 확인하고 차가운 얼음 식염수 좌심실을 perfuse.
  4. 퉁명스럽게 상승에서 폐동맥 (PA)를 해부하다오르타. 폐동맥의 2mm의 커프스와 함께 폐 밸브 (PV)를 잘라. 마음의 나머지를 폐기하십시오.
  5. 차가운 헤파린과 생리 식염수 (100 단위 / ml)에 PV를 저장합니다. 주 : PV는 기증자의 심장에 이식하기 전에 2 시간 동안 용액에 보관하실 수 있습니다.

2. 기증자의 심장 준비

  1. 6-8 주 된 여성 C57BL / 6 마​​우스가 심장 기증자로 사용됩니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 무게를 달고, 다음 케타민 / 자일 라진 칵테일 (케타민, 200 ㎎ / ㎏과 자일 라진, 20 ㎎ / kg, IP) 과다 복용으로 안락사. 이 터미널의 절차입니다.
  2. 가슴 부분을 클립 및 패드에 지느러미 드러 누움 위치에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 개흉술을합니다. 퉁명스럽게 심장, 하대 정맥 (IVC), 우수한 대정 맥 (SVC), 상행 대동맥, PA, 폐 정맥을 분리합니다. 얼음 차가운 멸균 식염수로 IVC를 Perfuse.
  3. IVC, SVC하고 우수한 잘라 6-0 실크 봉합사와 폐 혈관을 결찰합자.
  4. 2mm 팔목과 대동맥 및 PA를 잘라.
  5. PV를 잘라서 폐기하십시오.

기증자의 심장 위에 3. 심장 밸브 이식

  1. 즉시 2.5 단계 후, 기증자의 마음에 단계 1.5에서 심장 밸브를 배치하고 심장 밸브의 방향.
  2. 테이퍼 바늘에 10-0 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 밸브의 오른쪽에 스티치와 PV를 확보하고 태양 광 발전의 다른 측면에서 5-6 stiches와 함께 지속적으로 봉합하기 시작합니다.
  3. 전방 측을 마친 후 수평 심장 회전 공여체 심장에 PV의이면을 봉합하기 시작한다.
  4. 차가운 멸균 헤파린 / 식염수에 마음을 저장합니다. 참고 : 기증자의 마음이받는 마우스에 주입하기 전에 2 시간 동안 용액에 보관하실 수 있습니다.

받는 사람 마우스에 4. 이소성 심장 이식

  1. 6-8 주 된 여성 C57BL / 6 마​​우스 RECI로 사용되었다pient. 케이지에서 마우스를 제거하고 케타민 / 자일 라진 칵테일 (케타민, 100 ㎎ / ㎏과 자일 라진 10 ㎎ / ㎏)으로 마취, 그것은 무게. 케토 프로 펜 (5 ㎎ / kg)을 preanesthesia 진통제로서 사용된다.
  2. 곤란 꼬리에 의한 진정 작용의 수준을 확인한 후, 복부와 가슴 머리를 클립. 멸균 안과 연고와 함께 눈에 기름칠을하고, 패드에 지느러미 드러 누움 위치에 마우스를 놓습니다. 베타 딘, 알코올 패드로 복부를 소독. 그런 다음 멸균 드레이프와 마우스를 커버 만 절개 영역을 노출합니다.
  3. 치골 지역에 xyphoid 아래에서 중간 선 개복술의 절개를하고, 자체 유지 견인기를 삽입합니다. 식염수를 적신 거즈에 내장을 감싸십시오. 퉁명스럽게 신동맥 대동맥과 대정맥을 정의합니다.
  4. 혈액 순환을 억제하는 대동맥과 IVC 주변의 근위 및 원위 두 6-0 실크 봉합사를 놓습니다.
  5. 복부 대동맥의 오른쪽에있는 기증자의 심장을 놓고 멸균 GAU로 커버'제. 식염수로 보습.
  6. 30 G 바늘을 사용하여 복부 대동맥에 aortotomy을 확인하고 기증자의 대동맥의 크기에 가위로 구멍을 확장합니다.
  7. 테이퍼 바늘에 멸균 10-0 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 측면 엔드 - 투 문합을 수행합니다. 복부 대동맥의 입구의 기단에 하나의 스티치 기증자의 대동맥을 확보하고 복부 대동맥의 말단부에서 4-5 stiches와 함께 지속적으로 봉합하기 시작합니다.
  8. 왼쪽에 마음을 뒤집기 식염수 주입 거즈로 커버하고, 복부 대동맥의 말단부에서 4-5 stiches와 지속적으로 봉합하기 시작합니다.
  9. 30 G 바늘을 사용하여 IVC의 venotomy을 확인하고 기증자 폐동맥의 크기로 구멍을 확장합니다.
  10. 테이퍼 바늘에 멸균 10-0 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 측 문합에 종지부를 수행합니다. IVC의 개구부의 기단에 하나의 스티치 기증자 PA를 확보에서 4-5 stiches를 연속 봉합 시작하대 정맥의 말단. 대동맥 길에 있기 때문에 이번에는 반드시 기증자의 PA의 왼쪽 벽의 봉합은 IVC의 내부에 있는지 확인합니다.
  11. 헤파린과 생리 식염수 (100 단위 / ml)로 I​​VC 루멘을 세척합니다. 선단에 계속을 봉합하여 기증자 PA 사람과받는 사람 IVC의 오른쪽 벽을 닫습니다.
  12. 원심 합자를 제거하고 국소 흡수 멸균 지혈 에이전트를 적용하여 출혈을 제어 할 수 있습니다. 출혈이 완전히 정지 할 때, 근위 봉합사를 제거하고 출혈 같은 방법으로 제어 할 수 있습니다.
  13. 창자를 반환하고 6-0 블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 두 층으로 복부 근육과 피부를 닫습니다.
  14. 0.5 ㎖의 생리 식염수를 피하 주사와 마우스가 완전히 이동할 때까지 온난화 패드 복구 새장에 마우스를 놓습니다. 복구시, 종이 침구 새 케이지에 마우스를 반환합니다. 48 시간 동안 진통제 (이부프로펜, 30 ㎎ / ㎏, 식수를) 제공합니다. 할완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을했다 동물을 반환하지.

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결과

도 1은 이소성 심장 이식을 이용한 심장 판막 이식 모델의 개략도를 도시한다. 심장 판막은 기증자의 심장에서 수확 및 제 기증자 마우스의 심장에 이식했다. 그런 다음 새로운 심장 판막과 마음이받는 사람 마우스의 복부에 이식했다. 2 오른쪽 심장 이식 (B) 후, 복부 공간 (A)에 이식 마음의 그림을 보여주고, 이식 후 5 분 그림. 대동맥과 IVC의 양쪽에 봉합사를 제거하면, 마음은 나중에 1 ~ 2 분을 이길 시작하고 더 많은 혈액 순환과 핑커됩니다. 우심방이 더 (B)보다 (C)에 넓히고 있습니다. 마음은 점점 더 강한 박동 및 24 시간 후 안정되어있다.

이식 된 폐 밸브를 통해 혈액의 흐름을 사용하여 십일 주입 후 경피적으로 측정 하였다펄스 파 도플러 모드 (도 3)와

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토론

이 절차의 사망률은 주로받는 사람 복부 대동맥에 기증자의 대동맥의 PV 이식 사이트와 문합에서 출혈에 의해 발생 된 20 %에 가깝습니다. 대부분의 경우, 사망률이 유의하게 48 시간의 수술 후 감소한다. 생존 마우스는 이식 된 태양 광 발전을 통해 강한 심장 박동, 혈액 흐름을 보여 주었다. 전체 과정은 경험이 풍부한 마이크로 외과 의사 네 시간이 소요됩니다. 이 기술을 마스터하기 위해 약 250 마우스를 취할 것입니다. 이소성 심장 이식은 기증자의 심장에 태양 광 주입에 비해 상대적으로 앞으로 똑바로입니다. 성공적인 HV 이식을위한 가장 중요한 단계 중 하나는 기증자 마우스의 PV 구조의 수확입니다. PV 구조는 밸브 아래 1-2mm 주위에 가로로해야한다. 나머지 조직이 너무 짧으면, 문합 어려울 것이다. 태양 광 아래의 조직, 즉 (너무 긴 경우. PA는 승천에 비해 너무 긴 것) 주입 후 대동맥을 보내고, 이식 된 PA는 비틀거나 꼬임 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 이식 PA와 수신자 IVC 사이...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작품은 CKB에 NIH (RO1 HL098228)에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DPBSGibco14190-144
현미경LeicaM80
C57BL/6J (H-2B), 여성Jackson Laboratories6648-12주
케타민 염산염 주입Hospira Inc.NDC 0409-2053
자일라진 멸균 솔루션Akorn Inc.NADA# 139-236
케토프로펜포트 닷지 동물 건강NDC 0856-4396-01
이부프로펜PrecisionDoseNDC 68094-494-59
헤파린 나트륨사젠트 PharmaceticalsNDC 25021-400
식염수(멸균 0.9% 염화나트륨)호스피라NDC 0409-0138-22
0.9 % 염화나트륨 주입호스피라 주식회사NDC 0409-4888-10
바셀린 안과 연고Dechra 수의학 제품NDC 17033-211-38
요오드 준비 패드Triad Disposables, Inc.NDC 50730-3201-1
알코올 준비 패드McKesson Corp.NDC 68599-5805-1
코튼 팁 애플리케이터Fisher Sientific23-400-118
파인 가위FST14028-10
마이크로 애드슨 겸FST11018-12
클램프 적용 겸FST00072-14
S & T 혈관 클램프FST00396-01
스프링 가위FST15008-08
Colibri 견인기FST17000-04
Dumont #5 포셉FST11251-20
Dumont #7 - 파인 펜치FST11274-20
Dumont #5/45 포셉스FST11251-35
티쉬 니들 홀더/ 집게MicrinsMI1540
블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사, 10-0AROsurgical Instruments CorporationTI638402이식편 봉
합 블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사, 6-0ARO수술 기기SN-1956근육 및 피부 폐쇄
용 부직포 스폰지McKesson Corp.94442000
흡수성 지혈Ethicon1961
1 ml 주사기BD309659
3 ml 주사기BD309657
10 ml 주사기BD309604
18 G 1 1/2 in, 바늘BD305190
25 G 1 in., 바늘BD305125
30 G 1 in., 바늘BD305106
따뜻한 물 RecircultorGaymarTP-700
온난화 패드GaymarTP-22G
트리머Wahl9854-500
VEVO2100 고주파 초음파VisualSonicshttp://www.visualsonics.com/vevo2100< / a>카탈로그 번호와 가격은 영업 담당자로부터 얻을 수 있습니다.
초음파 투과 젤Parker Laboratories,
INC.		01-02
탁상용 실험실 동물 마취 시스템VetEquip, INC.
이소플루란박스터1001936060
자 자 제 901806

참고문헌

  1. Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
  2. Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
  3. Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
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  5. van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
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  7. Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
  8. Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
  9. Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
  10. Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
  11. Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
  12. Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).

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