방법 논문

형성 초점 : 세포 기반 분석은 유전자의 발암 성 가능성을 파악하기 위해

DOI:

10.3791/51742

⸱

2014년 12월 31일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis

이 논문에서

요약

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초점 형성의 분석은 후보 종양 유전자의 변화 가능성을 평가하기위한 간단한 방법을 제공한다.

초록

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세포의 악성 형질전환은 전형적으로 증식 증가, 접촉 억제 상실, 고정 독립적 성장 잠재력 획득 및 실험 동물에서 종양을 형성하는 능력과 관련이 있습니다1. NIH 3T3 세포에서 Ras 신호 전달 경로는 Ras 변환으로 알려진 이러한 이벤트 중 많은 부분을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. NIH 3T3 세포에 과발현 유전자를 도입하면 형태학적 변형 및 접촉 억제 상실을 촉진할 수 있으며, 이는 관심 유전자의 발암 가능성을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종양유전자의 형질전환 가능성의 한 측면을 평가하기 위한 간단한 방법을 제공하는 분석법은 FFA(Focus Formation Assay)2입니다. NIH 3T3 세포가 배양에서 정상적으로 분열할 때 합류 단층에 도달할 때까지 분열합니다. 그러나 과발현된 종양유전자가 있는 경우 이러한 세포는 조밀한 다층 초점1에서 성장하기 시작할 수 있으며, 이는 결정 바이올렛 또는 Hema 3 염색으로 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 기사에서는 관심 유전자를 NIH 3T3 세포로 레트로바이러스 형질전환하는 FFA 프로토콜과 염색을 통해 병소 수를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 레트로바이러스 형질도입은 형질주입보다 더 효율적인 유전자 전달 방법을 제공하며, 친환경성 쥐 레트로바이러스의 사용은 잠재적인 인간 종양유전자를 다룰 때 생물안전성 제어를 제공합니다.

서론

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종양 세포 유전자 발현의 패턴에서 증식 및 형태 학적 변화 후성 유전학에, 변경의 폭 넓은 정상 대조 구별 될 수있다. 후자 중에서, 궁극적으로 동물에 주입시 종양을 형성하는 능력은 악성화 (3)의 유용한 측정 지표 인 혈청에 의존하여, 접점 (밀도) 억제의 상실, 앵커리지 - 독립된 확산 인수를 감소. 생체 외 및 생체 내 분석 몇몇 셀룰러 변환을 위해 개발되었다. 시험 관내 분석법을 목표 (환원 혈청 성장)을 식별하고 배양 모폴로지 (초점 형성 어 세이), 문화 역학 (성장 속도, 포화 농도) 및 성장 인자의 변화가 측정 또는 요구 사항 앵커리지 (소프트 한천의 성장). 세포 유형의 악성 특성을 결정하기위한 금 표준 실험 동물에서 종양 형성 (이종) 남아있다. 그러나, t그는 비용 및 생체 내 연구의 길이는 항상 후보 종양 유전자의 첫 번째 검증 단계 또는 스크리닝 그들을 정당화하지 않습니다. 어떤 시험 관내 분석은 유전자의 발암 가능성의 명확한 평가를 제공하지 않지만, 그들은 생체 내 (in vivo) 연구가 미래를 좁힐 수 발암 가능성에 대한 통찰력을 제공 않습니다. 시험관 내에서 종양 발생 가능성을 평가하기위한 가장 널리 사용되는 시스템 중 하나는 초점 형성 분석법이있다. 이 접근법은 NIH 3T3 마우스 섬유 모세포, 강한 접촉 억제를 나타내고 형질 전환되지 않은 세포주의 사용에 의존한다. 밀도에 의존하는 성장의 손실 종양 유전자 결과의 과발현; 형질 전환 된 세포를 용이하게 형질 전환되지 않은 세포의 배경에 대해 단층 가시화 "초점"을 형성하는, 다층으로 성장할 수있다. 접점의 ON 인 손실에 의해 입증되는 바와 같이 포커스 정량법 형성 후, 악성 변환을 유도하는 후보의 종양 유전자 능력을 측정측정 표현형으로 ition. FFA (예를 들면, Src에 4 BRAF 5) 단백질 키나제의 과발현, 전사 인자 (예, N-myc의 6) (예 P2RY8 7), G는 단백질 - 결합 수용체와 GTP 아제 (예에 의해 변형을 평가하기 위해 사용되어왔다 , 라스 1), 다른 사람의 사이에서. 이 분석의 상대적 용이성은 유전자의 과발현은 체외에서 NIH 3T3 마우스 섬유 아세포를 변환 할만큼 충분한 지 여부에 대한 신속하고 시각적으로 명확한 답을 제공 할 것입니다 좋은 선택입니다.

이 프로토콜에서 설명 FFA 패키징 바이러스 단백질을 제공 Plat의 E-패키징 세포주 (8)를 사용하고, 레트로 바이러스 벡터 pBABEpuro 9 (Addgene 플라스미드 1764)는 레트로 바이러스를 생성한다. 관심의 유전자를 포함하는 구조체 pBABEpuro 형질 감염 후, E-Plat의 세포주는 NIH 3T3 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 ecotropic 레트로 바이러스를 생성 할 것이다. 티유전자 전달에있어서의 그의 바이러스 전통적인 화학적 형질 전환 방법보다 더 효율적이며 지속적으로 10 유전자를 발현 할 수있는 방법을 제공한다. 일단 NIH 3T3 세포의 게놈 내로 혼입, 목적 유전자의 과발현은 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터 (11)에 의해 구동된다. 이 상수는 식 NIH 3T3 세포상의 초점의 형성에 의해 측정 된 관심 유전자, 종양 활성을 가지고 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.

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프로토콜

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1. 바이러스 성 벡터를 만들기

목적 유전자뿐만 아니라, 양성 및 음성 대조군에 대한 코딩 서열은, 전통적인 클로닝 방법 (PCR 증폭, 제한 효소 및 라이 게이션)에 의하여 pBABEpuro 삽입된다. BamHI로, SnaBI로, EcoRI 및 SalI로 : DNA가 삽입 될 수있다 벡터 네 개의 제한 부위가있다.

  1. QIAGEN 플라스미드 미디 키트를 사용하여 유능한 세포에서 형질 급 플라스미드 DNA를 준비합니다.
  2. NanoDrop2000 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다.

2. 레트로 바이러스 생산

Plat의 E-패키징 세포주 NIH 3T3 세포가 관심 cDNA를 제공한다 ecotropic 레트로 바이러스를 생산하는 데 사용한다.

  1. 냉동 세포에서 Plat의-E 문화 구축
    1. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 Plat의-E 세포를 해동하고 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 천천히 (뒤를 Plat의-E 매체의 9를 가하여lbecco 개변 이글 DMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 스트렙토 마이신 +).
    2. 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
    3. 10cm의 배양 접시에 작은지면-E 매체 및 전송 10 mL로 세포를 다시 일시 중지합니다.
    4. 그들은 80 ~ 90 %의 합류 (약 2 일) 때까지 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 품어.
  2. 셀 분할
    1. 매체를 대기음 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
    2. 0.05 % 트립신 EDTA 2 ㎖를 추가하고 실온에서 1 분 동안 품어.
    3. 도청 손가락으로 세포를 분리 Plat의-E 배지 10 mL를 넣고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송.
    4. 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
    5. 작은지면-E 매체의 10 ml의 세포를 재현 탁 1에서 새로운 요리를 시드 : 4-1 : 6 희석.
  3. 작은지면-E 시드 및 형질
    1. 시드 2 × 10 (6)어떤 항생제없이 작은지면-E 매체를 이용하여 10cm 배양 접시 당 세포.
    2. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포 O / N을 품어.
    3. 다음 날, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 옵티-MEM 300 μl를 전송합니다.
    4. 옵티-MEM으로 준비 관, 폴리에틸렌 이민의 27 μL (PEI), 비용 효율적인 형질 전환 시약 (12)를 추가합니다. 도청 손가락으로 부드럽게 섞어 실온에서 5 분 동안 품어.
    5. , 옵티-MEM / PEI 튜브에 형질 급 플라스미드 DNA의 9 μg의 추가 텍싱하여 부드럽게 혼합하고, 실온에서 15 분 동안 품어.
    6. 추가 DNA / PEI Plat의-E 접시에, 37 ° C에서 O / N을 품어 복합 한 방울 씩, 5 % CO 2.
    7. 다음 날, 형질 전환 시약을 포함하는 매체를 대기음 (항생제없이) 신선한 Plat의-E의 10 ml의 배지를 추가합니다.
    8. 인큐베이터에 세포를 돌려줍니다.

3. NIH 3T3 세포 및 감염

  1. NIH 구축3T3 문화 및 시드
    1. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 NIH 3T3 세포를 해동하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 천천히 NIH 3T3 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 구를 가하여.
    2. 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
    3. 10cm 배양 접시 NIH 3T3 매체와 전사 10 mL로 세포를 재현 탁.
    4. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 그것은 자연 변환 (그리고 초점 형성 따라서 기초 수준)의 주파수로 문화 포화 상태에 도달하면 증가, NIH 3T3 세포는 항상 underconfluent (50~60%)을 유지하는 것이 매우 중요합니다.
    5. 10cm 접시 당 종자 3 × 10 5 세포는 다음날 감염 O / N을 배양한다.
  2. 감염
    1. 0.45 ㎛의 세공 크기를 나일론 멤브레인 필터로 여과 한, 10 ㎖의 일회용 주사기를 사용하고, 15 ㎖ 중에 전송해서 E-Plat의 접시에서 레트로 바이러스 상등액을 수확튜브.
    2. (항생제없이) 세포에 신선한 Plat의-E 매체의 10 ML을 추가하고 인큐베이터에 반환.
    3. 감염 될 수있는 NIH 3T3 세포 접시에서 매체를 대기음, 바이러스 함유 필터링 된 상층 액의 5 정기적 인 NIH 3T3 매체 ml의 5 mL를 추가합니다.
    4. 6 ㎍ / ml의 농도로 폴리 브렌 접시에 추가.
    5. 37 ° C, 5 % CO 2의 세포 O / N을 품어.
    6. 감염의 두 번째 라운드에 대한 3.2.5 - 다음 날, 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.
    7. 일반 NIH 3T3 매체와 바이러스 함유 배지를 교체합니다.
    8. 필요에 따라 매체를 교체, NIH 3T3 세포를 2 ~ 3 주 동안 성장하는 것을 허용합니다. 복제 판에서 전체 세포 용 해물에 기존의 단백질 전기 영동 및 면역에 의해 관심의 단백질의 발현을 확인합니다.

4. 염색 및 정량화

  1. 크리스탈 바이올렛 염색
    1. NIH 3T3 매체를 대기음 요리를 배치얼음에.
    2. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 요리를 씻으십시오.
    3. 10 분 동안 빙냉 메탄올로 세포를 고정.
    4. 얼음에서 요리를 제거하고 메탄올을 대기음, 25 % 메탄올 (RT)에서 만든 0.5 % 크리스탈 바이올렛 용액 3 ㎖를 추가합니다.
    5. RT에서 5 분 동안 요리를 품어.
    6. 크리스탈 바이올렛 솔루션을 기음과 컬러가 린스 벗기하지 않을 때까지 조심스럽게 밀리-Q의 H 2 O와 접시를 씻어.
    7. 요리는 벤치 탑에 O / N을 건조하도록 허용 (발견).
  2. 초점 정량화
    1. 요리가 건조되면, 접시에 세포의 음울 색깔의 컬렉션을 측정하는 통치자를 사용합니다. 만 등의 직경보다 5mm 된 것을 계산 "초점을."초점의 수를 기록하고 평균과 컨트롤에 비해 중요성을 계산합니다.

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결과

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MXD3는 MYC / MAX / MAD 네트워크의 구성원 인 염기성 헬릭스 - 루프 - 헬릭스 류신 지퍼 (bHLHZ) 전사 인자이다. 그것은 MAD 가족 13-15의 비정형 부재이며, 그것은 암화 (16, 17)에 관여하는 것으로보고되었다. pBABEpuro (대조군)과 MYC (양성 대조군)과 비교했을 때, MXD3가 과발현 된 NIH 3T3 요리는 훨씬 적은 초점 (그림 1A)를했다. 도 1b의 데이터는 중요성을 결정하기 위해 여러 실험으로부터 수집 하였다.

이 MYC와 유사한 활동 (알려진 발암 유전자)를 가지고 있기 때문에 MXD3의 발암 가능성을 결정하는 초기 관심이 있었다. 그러나,이 분석 결과는 MXD3는 종양 유전자의 기능을하지 않는 것이 좋습니다.

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토론

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FFA는 체외에서 악성 변화를 평가하기위한 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 이는 후보 유전자의 상대적으로 큰 수의 검사 의무이며, 그 완만 한 기술적 요구는 비용 효율적인 만든다. 또한, 두 개 이상의 유전자를 공 발현 할 수있다 조합 발암 잠재력을 평가하는 (때때로 "협동"분석법이라 함). 이 분석의 장점은 간단 기술, 정량의 용이성과 상대적으로 짧은 턴어라운드 시간에 의존하고있다. 그것은 그것이 모든 시험 관내 분석의 한계를 제기 않는다는 점을 강조해야한다. 분석은 암세포의 한 표현형 특성을 측정함으로써 평가 발암 변환, 즉, 자신의 능력을 배양 접시에 단층 넘을한다. 부정적인 결과는, 따라서,이 특정 phenotyp을 추진하지 않고 변화를 유도 할 수있는 특정 암에서 신중하게 해석되어야한다e 또는 다른 유전자 (즉, 협력 위에서 언급 한)와 동시 발현을 필요로 할 수있다. 이 경우에, 그것은 예를 들면 증식률 혈청 요건 및 / 또는 독립적 앵커리지 의해 결...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 프로그램 (ED)에서 부여에 의해 지원되었다. AA는 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 학부 상에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pBABE-puro vectorAddgenePlasmid 1764클로닝 벡터
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, EcotropicCell Biolabs, Inc.바이러스 생산을 위한RV-101
NIH 3T3 세포주 쥐Sigma-Aldrich93061524초점 형성 분석을 위한 세포주
10ml BD Luer-Lok 팁 주사기BD Biosciences309604바이러스 생산 시약
0.45 μ m Puradisc 주사기 필터Whatman6750-2504바이러스 생산 시약
폴리에틸렌이민(PEI)Polysciences, Inc.23966-2세포 형질주입 시약
폴리브레네 감염 / 형질주입 시약EMD MilliporeTR-1003-G세포 형질주입 시약
크리스탈 바이올렛피셔 사이언티픽C581-25세포 염색 시약
플라스미드 플러스 미디 키트QIAGEN12945플라스미드 정제
BD 팔콘 조직 배양 접시BD Biosciences353003세포 배양 용품
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065세포 배양 배지
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054세포 배양 용품
Opti-MEM I 환원 혈청 배지Gibco31985-062세포 배양
배지 Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044세포 배양 배지
세포주

참고문헌

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NIH 3T3Pla E

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