마우스 도파민 뉴런의 차 문화

요약

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

초록

도파민 뉴런은 뇌 신경 세포의 총 수의 1 % 미만을 나타낸다. 신경이 적은 양의은 모터 제어, 동기 부여, 및 작업 메모리 중요 뇌 기능을 조절한다. 흑질 선조체 도파민 뉴런 선택적 파킨슨 병 (PD)에 퇴화. 이 진보적 인 신경 세포의 손실은 명백하게 병리의 모터 증상 (운동 완만, 휴식 진전, 근육 강도)와 연결되어 있습니다. 도파민 신경 세포의 변성을 담당하는 주요 에이전트는 아직 알 수 없습니다. 그러나 이러한 신경 세포는 다양한 조건에서 매우 취약한 것으로 나타납니다. 차 문화는 속성과 도파민 신경 세포의 특성을 조사하기 위해 가장 중요한 모델 중 하나를 구성한다. 이러한 문화는 중지하거나 신경 세포의 변성을 느리게하기 위해 PD 병리를 모방 다양한 스트레스 에이전트 및 신경 보호 화합물을 제공 할 수 있습니다. GENER왔다 PD의 수많은 형질 전환 마우스 모델지난 10 년간 나타나는데 더 도파민 신경 세포 배양에 대한 연구자들의 관심이 증가했다. 여기서, 비디오 프로토콜은 배아 마우스 뇌의 섬세한 절개에 초점을 맞추고있다. 복부 중뇌의 정확한 절제 후속 연구를 할 수 있도록 도파민 세포에서 충분히 풍부한 신경의 문화를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 배아 형질 전환 마우스 실현 면역 형광 염색, 정량 PCR, 둘째 메신저 정량화, 또는 신경 세포의 죽음 / 생존 평가에 적합하다 할 수 있습니다.

서론

도파민, 필수적인 뇌의 신경 전달 물질 ^1,2 중 하나는, 주로 중뇌 도파민 (DA) 신경 세포에 의해 방출된다. DA 신경 세포의 대부분은 중뇌 ^2-6의 복부 부분에 상주. mesostriatal, mesolimbic 및 mesocortical 경로 ^2,5 : 도식적으로, 중뇌 DA 뉴런은 해부학 적 및 기능적으로 세에서 별개의 프로젝션 시스템을 나눌 수 있습니다. 전두엽 피질에 투사 도파민 경로는 ^인식이 연루되는 반면, 흑질 선조체 경로는 mesolimbic 경로 보강, 동기 부여, 학습에 중요한 역할을, 모터 동작에 참여하고있다.

DA 뉴런은 정신 분열증, 주의력 결핍, 하이퍼 활동 장애, 파킨슨 병 (PD) ^2,4 등 여러 가지 인간의 신경 질환에 참여하고 있습니다. PD는 흑질 접속 DA 신경 세포의 진행성 및 퇴행성 선택적 특징선조체에 갈 거예요의 compacta (SNC). PD의 운동 증상의 책임이있는 선조체 (striatum)에서 심각한 도파민 고갈에 nigro - 선조체 DA 뉴런 결과의 손실 (운동 완만, 휴식 진동, 강성) ^7. 특발성 PD의 초기 원인은 확립되지 않았으며, 현재 치료 선조체 도파민 수....

프로토콜

이 작품에 사용 된 마우스는 보살핌과 유럽 연합위원회의 가이드 라인을 실험 동물의 사용에 대한 (609분의 86 / EU)에 따라 처리 하였다.

필요 솔루션의 1 준비

1. 주식 솔루션
   1. 10 배 폴리-L 오르니 틴 (PLO) 해결책 : PLO 브롬화 수소 산염 10 ㎎을 무게 (분자량 = 30,000-70,000) 및 멸균 물 70 ㎖에 녹인다. -20 ° C에서 0.2 μm의 주사기 필터, 나누어지는 솔루션을 사용하고, 가게를 필터링합니다.
   2. 30 % 포도당 해결책 : 30 D (+)의 g을 달아 - 포도당을 100 ml의 총 부피에 멸균 물에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   3. 5X 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM) / 영양 혼합물 햄 F-12 : DMEM / 햄 F-12 분말 6g를 달아, 100 ml의 총 부피를 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   4. 7.5 % 중탄산 나트륨 _(탄산 수소 나트륨) Soluti에 : _탄산 수소 나트륨 7.5 g을 계량하고 100 ㎖의 총 부피로 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   5. 1 M HEPES ....

결과

중뇌 문화 단계의 그림 흐름도 그림 1에 나타나있다. 간단히, 임신 스위스 마우스에서 E13.5 배아를 수집 한 후, 복부 중뇌가 전체 배아 해부한다. 고립 된 뇌 조각이 연속적으로 소화 효소 및 기계적 분리에 제출됩니다. 해리 된 세포를 미리 코팅 된 12 - 또는 24 - 웰 플레이트에서 배양 배지에 재현 탁시키고, 도금, 원심 분리에 의해 펠렛 화한다. 세포는 중간 교체없이 십오일까지 유지됩니다.

3.2 단계에 해당하는 복부 중뇌 해부의 상세한 흐름도는 그림 2에 나타나있다. 빨간색 점선 라인 E13.5 마우스 뇌의 개략도에 3 주 절단 선을 표시 (. Prestoz 등에서 ^{30 적응)} 및 절단 단계가 도시되어있다.

VIT 1, 4, 7 일 후에 문화의 위상 대비 이미지RO (DIV)를

토론

이 프로토콜은 마우스 배아 도파민 성 신경 세포를 검출하는 면역 형광 절차에서 중간 뇌 신경 세포의 일차 배양을 준비하기 위해 필요한 절차 및 시약을 제공한다. 절차의 중요한 단계는 배아의 박리 및 회수 뇌 절편 기계적 해리이다. 고품질 해부 악기 해부 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다. DA 뉴런 중뇌의 작은 부분을 구성한다. 따라서, 복부 중뇌의 오른쪽 부분을 수집하는 DA 뉴런 2-4 % 함유 배양을 수득하는 것이 필수적이다. 기계 해리는 신중하고 조심스럽게 수행해야합니다. 문화가 아닌 해리 뉴런의 클러스터를 포함하는 경우, 하나 또는 두 개 더 분쇄 단계를 추가합니다.

이 프로토콜은 신경 세포 배양 용 무 혈청 배지를 사용합니다. 그러나, 혈청으로 코팅하여 세포의 부착을 향상시키기 위해 필요하다. 산이 대체 호르몬 믹스,음, 신경 세포의 성장을 허용 및 신경교 세​​포의 생존과 증식을 최소화하기 위해 정의된다. 따라서, 비 신경 세포 (GFAP-염색을 사용하여 정량) .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 소 혈청	Lonza	14-801F
DMEM 4.5g/L 포도당, L-글루타	Lonza	BE12-604F
0.05% 트립신-EDTA(1x), 페놀 레드	Life Technologies	25300-054
페니실린-스트렙토마이신(10,000U/ml)	Life Technologies	15140122
L-글루타민, 200mM 용액	Life Technologies
둘베코' s 인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	D8537
둘베코 의 변형된 독수리' s 중간/영양소 혼합물 F-12 햄	시그마-알드리치	D0547	파우더
라미닌 - 트리스 버퍼 NaCl	시그마-알드리치	L2020
폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드	시그마-알드리치	P3655
돼지 췌장에서 추출한 인슐린	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin 인간	시그마-알드리치	T1147
Putrescine dihydrochloride	시그마-알드리치	P5780
프로게스테론	시그마-알드리치	P8783
아셀렌산나트륨	시그마-알드리치	S5261
HEPES	시그마-알드리치	H4034
글리신	시그마-알드리치	G7126	물 속의 원액 1M
젤라틴	시그마-알드리치	G9391	스톡 용액 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
파라포름알데히드 16% 수중	전자 현미경 과학	RT 15710-S
중탄산나트륨(NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-포도당, 일수화물	Merck Millipore	4074-2
염산 - c(HCl) = 1 mol/L(1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
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Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) 항체	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) 항체, 클론 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) 항체, 클론 DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
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