Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat
Summary
Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
Abstract
Roman biyomarkör keşif daha duyarlı ve özgül hastalık tespiti sağlayan çok önemli bir rol oynar. Biyolojik sıvılarda mevcut Ne yazık ki çok düşük miktardaki biyolojik göstergeler kolayca kütle spektrometrisi ya da çok düşük bir konsantrasyonda mevcut olan değişken ve çoğu zaman, albümin veya immünoglobülin gibi proteinler, yüksek miktardaki maskelendiğinden, çünkü bağışıklık ile tespit edilemez. Bait içeren poli (N-izopropil akrilamid) (Nipam) göre nanopartiküller bu fizyolojik engelleri aşmak mümkün. Bir adım olarak onlar yakalama konsantre ve vücut sıvılarından biyomarkerları korumak mümkündür. Düşük molekül ağırlıklı analitler nanopartikül çekirdeğini girip daha yüksek bir afiniteye proteini yemler etki gösteren farklı organik kimyasal boyalar tarafından yakalanır. Nanopartiküller büyüklükte birkaç emir tarafından ilgi proteinlerin konsantre edebiliyoruz. Bu konsantrasyon faktörü proteinleri içindedir böylece protein seviyesini yükseltmek için yeterlidirGeçerli Massenspektrometer, batı lekeleme ve immunoassay'lerin saptama sınırı. Nanopartiküller biyolojik sıvıların bir bolluk ile inkübe edilebilir ve albümin ve diğer yüksek molekül ağırlıklı proteinler hariç ederken, büyük ölçüde düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptidlerin konsantrasyonu arttırmakta edebiliyoruz. Bizim veriler, belirli bir analit konsantrasyonunun 10,000 kez amplifikasyon önceden belirlenemeyen biyolojik işaretleri tespit etmek için kütle spektrometrisi ve immün sağlayarak elde edilebileceğini göstermektedir.
Introduction
Insan genomu dizileme tamamlanmasına rağmen, önemli ilerlemeler erken evre hastalığın öngörü belirlenmesi biyomarkerlerindeki yapılmamıştır, ya da tedavi sonucu veya prognoz 1 ile ilişkilidir. Bu ilerleme olmaması için bir nedeni olarak birçok potansiyel önemli belirteçler konvansiyonel kütle spektrometresi ve diğer biyobelirteç keşif platformlarda saptama sınırının altında bir konsantrasyonda mevcut olduğunu. Kütle spektrometrisi (MS) ve çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM), tipik olarak, bir algılama hassasiyeti daha büyük olan 50 ng / ml olarak ise 50 pg / ml ve 10 ng / ml arasında değişen bir klinik laboratuar düşme ile ölçülen bağışıklık analitlerin çoğunluğu . Bu, özellikle bir hastalığın erken evrede pek biyomarkırlar, geleneksel MS ve MRM 2 ile tespit edilemez anlamına gelir. Ayrıca bu gibi kompleks biyolojik sıvılarda albümin ve immunoglobülin gibi yüksek bolluk proteinlerin varlığı genellikle milyar kat exc ile maskeesini düşük miktardaki, düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler 3, 4. bu nedenle birçok örnek hazırlık adımları kütle spektrometrisi sekanslama ve kimlik önce gerekmektedir. Bu gibi bir hazırlık aşaması ticari olarak temin edilebilen tükenme sütunlar 5-8, yüksek miktardaki proteinlerin tükenmesi kullanmaktadır. Genellikle kovalent olmayan bir şekilde kaldırılmakta olan taşıyıcı proteinler ile ilişkili olduğundan, ne yazık ki, bu adım aday biyobelirteç verim azalmaya yol açar. Örnekler toplandığı bir zamanlar başka bir meydan aday biyomarkerların ex-vivo stabilitesi ile temsil edilmektedir. Proteinler, endojen veya eksojen proteazlar 9 ile degradasyona tabi tutulur. Bozulması 10-13 protein korurken hidrojel nanopartiküller, tahlilin aralığı içinde bir düzeye farazi biyolojik işaretleyici konsantrasyonunu yükselterek bu kritik zorlukları aşmak olabilir.
Bu th dikkat etmek önemlidirLMW, kanda proteinlerin küçük sağlam proteinler ile birlikte, bu büyük proteinlerin parçalarının bir karışımı bulunmaktadır. 60 kDa'dan daha büyük bir Doku türevli proteinler pasif vasküler bazal zar boyunca kan akışına girmesine kadar büyük, ancak peptidler veya protein parçacıkları 14 kanın temsil edilebilir. Amacımız Hastalığın erken teşhisi, tedavisi için hasta tabakalaşma ve tedaviye yanıtın izlenmesinde için aday olabilir roman dolaşan biyomarkerları ölçmektir. Bizim nanopartiküller anda küçük proteinler ve peptidler yakalama ve başlangıç hacmine göre 100 kat kadar onları konsantre olurken seçici, yüksek bolluk immünoglobinlerin ve albumin dışlamak için oluşturulur.
Bizim grup başarıyla proteinler ve peptidler için yüksek afinite moleküler yemler hareket edebilen küçük organik boyaların bir dizi tanımlanır. Protein boya bağlama bağlı olarak, hidrofobik ve elektrostatik etkileşimin bir kombinasyonu olduğu düşünülmektedirs. Boya üzerindeki aromatik halkalar protein yüzey 11 ile hidrofobik cepleri proteinleri ile dönüşümlü olarak çalışır.
Yemler, kimyalarına bağlı olarak seçilmiş analitlerin sınıfları için özel bir çekim gücü gösterirler. Yemler proteinler veya peptidlere, örneğin albumin gibi, taşıyıcı proteinler ile rekabet eder. Düşük molekül ağırlıklı proteinler / peptidler parçacık içinde sıkışır. , Albümin ve immunoglobülin gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinler nedeniyle hidrojel 11 (Şekil 1) yer alan sınırlayıcı gözenek çünkü eleme yeteneğinin parçacık girmesini engellenir.
Hidrojel nanopartiküller amonyum persülfat 11 tarafından başlatılan çöktürme polimerizasyonu ile sentezlenir. N-izopropil (Nipam), akrilik asit (AAC) ve alilamin (AA) ve çapraz bağlayıcı, N, N'-metilenbisakrilamid (BIS) eş-monomerler arasında 1 seyreltik koşullar içinde, 6 saat boyunca 70 ° C'de reaksiyona girmesine imkan verilir1, 13. Poli yüksek protein bağlanma afinitesi (N-izopropil akrilamid-ko-akrilik asit) kovalent (amino içeren boya maddelerinin katılmasıyla, yani., Sulfonatedanthraquinonetriazine boyalar) nanopartiküllerin içine yoluyla elde (poli (Nipam-ko-AAC) nanoparticlesis Boyaların hidrofobik / hidrofilik özelliklere bağlı olarak, sulu ya da organik çözücü maddelerin içinde, bir amidasyon reaksiyonu 11, bir anthraquinonetriazine boyanın klorür atomu ile nanopartikül amin grubuna ait 13. nükleofilik ikamesi, boya ihtiva eden poli (Nipam oluşturmak için kullanılmaktadır CO-allilamin) (AA) 11 12 nanoparçacıklar. iki aşamalı polimerizasyon işlemi vinilsülfonik asit (VSA), 11, 13, bir dış kabuk içeren hidrojel nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılır.
Hidrojel nanopartiküller, tam kan, plazma, serum, serebrospinal sıvı, ter ve idrar dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sıvılar, uygulanabilir. Bir adım olarak, çözelti içinde, nanoparticles (birkaç dakika içinde) hızlı bir haciz ve düşük moleküler ağırlığa sahip konsantrasyonu, 10, 11, 13, 15-18 analitlerini gerçekleştirin. Proteinler daha sonra kullanılarak nanopartiküller yıkanır ve tespit edilir batı spektrometrisi 10, 11, 13, 15, 18, 22 kütle, 19-21 lekeleme, 23, bağışıklık / ELISA 10, 11, 15, 18, ya da ters faz, protein mikro-dizi 16 24 deneyleri. Nanopartiküller, kimyasal yem ile fonksiyonalize ve bir çekirdek ya da çekirdek-kabuk mimari, yakalama sunulması ve yem / kabuk fizikokimyasal özelliklerine göre proteinlerin konsantrasyonu. Nanopartiküller dahil farklı boyaların bu nedenle boya afinitesi göre verimlilik, çözeltinin pH değeri ve yüksek miktardaki proteinlerin 13 rakip varlığını / yokluğunu değişen proteinlerin, farklı alt çekecektir. Bundan başka, çözeltinin hacmi ile ilgili olarak nanopartiküllerin miktarı nanopartiküller gelen protein verimi etkileyecektir. Bu yönleriHidrojel nanoparçacık hasat Yüksek miktarda protein içeren plazma numuneleri hasat proteinleri için üç farklı nanopartikül yemler kullanılarak gösterilebilir, ve tipik olarak yüksek miktarda protein içermeyen idrar örnekleri vardır. Bu protokolde, hasat ve poli (Nipam-ko-AAC), Poli (Nipam / boya) ve çekirdek-kabuk nano-tanecikleri kullanılarak plazma numuneleri, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) konsantre göstermektedir (Poli (Nipam-ko-VSA)) . Poli (Nipam / boya) nanopartiküller Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bireyler taklit insan idrar örneklerinde eklendi Mycobacterium türleri antijeni, konsantre gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klinik Uygunluk
Bir serum ya da plazma numunesi, bir bütün olarak organizmanın durumu ile ilgili bilgiler için zengin bir kaynak temin edebilmektedir proteinler ve peptidler, dolaşımdaki düşük bol miktarda içerir düşünülmektedir. Serum proteomik söze rağmen, klinik yarar 10, 11, 16, 25 biyomarkır keşif ve çeviri thwarting üç temel ve ciddi fizyolojik engeller vardır.
1. Önemli teşhis biyomarkerler kanda çok dü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nazik Şekil 5'te gösterilen veri toplama ve analizi ile destekli Michael Henry, Dublin City University,. Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) George Mason Üniversitesi, (2) İtalya / ABD çerçevesinde İtalyan IstitutoSuperiore di Sanita ' ABD Sağlık Bakanlığı ve İnsan Hizmetleri, George Mason Üniversitesi ve Halk Sağlığı İtalyan Bakanlığı, (3) NIH, IMAT programı hibe 1R21CA137706-01 ve LAL için 1R33CA173359-01, ve (4) Ceres Nanobilimler, Inc arasında işbirliği anlaşması .
Materials
| hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
| 1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
