본 연구에서는 새로운 플랫폼을 개발하고 검증 된 양극성 장애 (BD)의 치료 반응의 intraneuronal 분자 서명을 조사합니다. BD 환자의 후각 상피 비강 생검을 통해 얻었다. 이어서 레이저 캡처 미세 절제가 BD 리튬 응답의 분자 특성을 조사하기 위해 실시간 RT PCR과 결합시켰다.
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방법 논문
레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근
이 논문에서
요약
초록
양극성 장애 (BD)이 제대로 이해 병태 생리학과 심한 신경 정신 질환과 전형적 기분 안정제, 탄산 리튬으로 처리 하였다. 동물 연구뿐만 아니라 인간의 유전 연구는 리튬이 신경 세포의 성장, 생존과 성숙, 그리고 Wnt 신호에 관여 특히 분자에 관여하는 분자 표적에 영향을 미친다는 사실을 보여. 중추 신경계 (CNS)에서 리튬 응답과 연관된 동적 분자량 변화를 조사하는 뇌 생검 구하기 윤리적 도전 감안할 번이 goal.The 후각 상피 후각 수용체 뉴런을 포함 달성 후각 조직으로부터 수득 된 뉴런의 사용을 고려할 수있다 개발 및 신경교 유사 세포를지지하는 다른 단계에서. 이 안전하게 코 조직 검사에서 얻은 후각 조직을 사용, 신경 정신 질환을 가진 환자의 CNS의 역동적 인 변화를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. SUBST로 인한 단점을 극복하기 위해비 신경 세포와 후각 생검 조직의 antial 오염, 풍부한 신경 세포 인구를 얻을 수있는 새로운 접근 방식은 레이저 캡처 미세 절제와 코 생검을 결합하여 개발되었다. 이 연구에서, 신경 조직에 치료 - 관련 분자의 동적 변화를 조사하는 시스템은 리튬 치료 반응의 분자 메커니즘의 연구를 위해 모집 BD 환자의 작은 파일럿 샘플을 사용하여, 개발 및 검증 하였다.
서론
양극성 장애 (BD)이 기분 병리학 적 변화를 특징으로하는 심각한 신경 장애이며, 드라이브 및인지 1. BD의 치료에 사용되는 리튬은 동물 연구에서 두 유전자의 다수의 정상 상태의 mRNA 수준을 변경하기 위해 도시되었지만, 이들 분자 중 2 인간 임상 반응과 연관된 경우에는 알려지지 않았다. 리튬의 반응 메카니즘을 이해하는 것은 신경 조직에서의 리튬 - 유발 분자 변화를 조사 요구한다. 불행히도, BD 환자의 뇌 생검 전후 리튬 요법 리튬 반응 분자 서명을 식별하기 위해 수득 실용적이지 않다. 사후 뇌 조직은 BD 바이오 마커의 연구를 위해 사용 된, 그러나, 감정,인지와 이용시의 동적 변화와 관련 분자 마커를 평가하기 위해 사용될 수 없다; 소급 확인 리튬 치료 반응의 유효성이 문제가 될 수있다 (4). 림프구 및 기타 혈액 세포가 유용 할 수 있지만, 혈액 세포의 분자 변화는 신경 세포의 변화 3-5 반영되지 않을 수 있습니다. 뇌척수액은 질환 관련 약물 가역 본질적인 변화를 반영 할 수있다 세포 내 분자에 대한 정보를 얻을 불충분 할 수있다.
후각 상피 (OE)가 중추 신경계 (CNS)의 고유 부분이며, 변연 구조 (6)에
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프로토콜
참고 :이 연구의 모든 연구 자원 봉사자는 하워드 대학의 심사위원회 (Institutional Review Board) 및 존스 홉킨스 대학의 승인을 동의 문서를 투여 하였다. 동의 문서에 서명함으로써 동의 만 참가자들은 연구에 등록되었다. 이 분석을위한 연구 기반을 구성 : 20 명 (12 BD 10 컨트롤, 30 % 남성)과 38.2 (14.1) 년의 나이 (SD)를 의미한다.
참고 : 유리 및 플라스틱 표면에서의 RNase 오염을 제거의 RNase 보내 겠 모든 표면을 스프레이.
1. 조직 검사 절차
- 연구 참가자의 비강에 국소 리도카인 (xylocaine) 액체 4 %와 oxymetazoline 염산 0.05 % 스프레이와 시간을 마비의 15 분을 할 수 있습니다.
- 리도카인과 oxymetazoline의 혼합물에 ½ × 3 인치 수술 cottonoids을 만끽하고 비중격의 우수한 부분을 따라 비강에 삽입하고 15 분 동안 앉아 할 수 있습니다.
- 30 ° 강성을 사용하여비강 내시경, 비강의 상부를 찾아 여러 개의 작은 표본을 고려하여 비중격의 우수한 부분에서 최대 물고 코 집게를 사용하여 코 점막을 제거합니다.
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결과
분자 서명의 연구에서 프로토콜 및 문제 해결 전략이 성공적으로 최적화되었다. RNA 샘플을위한 품질 및 신경 농축 기준 하류 리얼 타임 PCR 분석에 사용되는 표준화 하였다. RIN 및 RNA의 농도는 검출 된 발현 수준을 교란 요인으로 조사 하였다. 1에서부터 RINs 여러 샘플의 분석을 바탕으로 - (10)는, 상술의 ~ 3.0의 최소 RIN은 본 연구에서 분석 하류에 충분하다고 판단되었다. 결과적으로, cDNA의 합성을위한 RNA 량이 1.0 NG로 표준화 하였다. 따라서, 상기 RIN 고품질 시료 1.0 ~ 3.0 및 NG의 RNA 양의 cDNA로 변환시켰다. 0.1 샘플 - 적절한 샘플 크기가 구하기 어려운 경우 RNA 1.0 NG가 사용될 수있다.
신경 엔리치 실시간-PCR 분석을 사용하여 확인 하였다. microdissected 샘플 OMP 유전자 발현 수준은 undissected 시료와 비교 하였다신경 층이 농축 된 경우의 확인합니다. 비 해부 조직에 비해 .......
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토론
코 조직 검사 및 LCM을 결합하여 풍부한 후각 신경 층을 얻기위한 새로운 플랫폼을 제시하고 본 연구에서 검증되었습니다. 이 기술은 광범위하게 영향을 미칠 수 있습니다. 이 분야에서 폭 넓은 영향을, 치료 반응을위한 것들을 포함 바이오 마커 연구, 및 다른 조건에 대한 신경 정신병 약물 발견 노력으로 적용될 수있다.
다운 스트림 응용 프로그램에 대한 의무 고품질의 신경 세포를 얻으려면 몇 가지 중요하고 문제 해결 단계를주의해야합니다. 적절한 샘플 크기를 갖도록 환자 당 후각 조직의 6 개 - 우선,도 4를 얻었다. 샘플 RNA 분해에 민감하기 때문에 둘째, 적절한 온도에서 조직을 유지 된 RNase 무료 장비와 표면, 사용 장갑 작업, 샘플을 통해 직접 흡입하지 않도록 할 것. RNA 품질이 여전히 낮은 경우, 50 분 이내에 완료 미세 절제를 고려하고 즉시 절개 또는 vort 후 RNA 추출을 수행전 시료는 즉시 -80 ° C에서 저장 될 때까지 드라이 아이스 계속. RNA.......
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공개 사항
저자는 상업적 이익과 재정적 관계를보고하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 USPHS 보조금 MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), AND H-096208 (K.I.), DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. 및 K.I.)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 및 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금(AS 및 KI).
우리는 생검 과정을 조정하기 위한 Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema 및 Mark Christie의 노력과 기여에 진심으로 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC 처리 수 | 질 생물학 | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM 시리즈 MicroLaser 시스템 | Carl Zeiss 현미경 | 모델: Axiovert 200M 소프트웨어: Robo v3.2 | |
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan 발현 분석 프로브 | Applied Biosystems | 다양한 | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | Applied Biosystems | 4369016 |
참고문헌
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al.....
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재인쇄 및 허가
