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방법 논문

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

9.3K 조회수

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DOI:

10.3791/51853

⸱

2014년 12월 4일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Johns Hopkins University, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Howard University, 3Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Johns Hopkins University, 4Department of Psychiatry, Sheppard Pratt Hospital, 5Department of Psychiatry, Indiana University

이 논문에서

요약

본 연구에서는 새로운 플랫폼을 개발하고 검증 된 양극성 장애 (BD)의 치료 반응의 intraneuronal 분자 서명을 조사합니다. BD 환자의 후각 상피 비강 생검을 통해 얻었다. 이어서 레이저 캡처 미세 절제가 BD 리튬 응답의 분자 특성을 조사하기 위해 실시간 RT PCR과 결합시켰다.

초록

양극성 장애 (BD)이 제대로 이해 병태 생리학과 심한 신경 정신 질환과 전형적 기분 안정제, 탄산 리튬으로 처리 하였다. 동물 연구뿐만 아니라 인간의 유전 연구는 리튬이 신경 세포의 성장, 생존과 성숙, 그리고 Wnt 신호에 관여 특히 분자에 관여하는 분자 표적에 영향을 미친다는 사실을 보여. 중추 신경계 (CNS)에서 리튬 응답과 연관된 동적 분자량 변화를 조사하는 뇌 생검 구하기 윤리적 도전 감안할 번이 goal.The 후각 상피 후각 수용체 뉴런을 포함 달성 후각 조직으로부터 수득 된 뉴런의 사용을 고려할 수있다 개발 및 신경교 유사 세포를지지하는 다른 단계에서. 이 안전하게 코 조직 검사에서 얻은 후각 조직을 사용, 신경 정신 질환을 가진 환자의 CNS의 역동적 인 변화를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. SUBST로 인한 단점을 극복하기 위해비 신경 세포와 후각 생검 조직의 antial 오염, 풍부한 신경 세포 인구를 얻을 수있는 새로운 접근 방식은 레이저 캡처 미세 절제와 코 생검을 결합하여 개발되었다. 이 연구에서, 신경 조직에 치료 - 관련 분자의 동적 변화를 조사하는 시스템은 리튬 치료 반응의 분자 메커니즘의 연구를 위해 모집 BD 환자의 작은 파일럿 샘플을 사용하여, 개발 및 검증 하였다.

서론

양극성 장애 (BD)이 기분 병리학 적 변화를 특징으로하는 심각한 신경 장애이며, 드라이브 및인지 1. BD의 치료에 사용되는 리튬은 동물 연구에서 두 유전자의 다수의 정상 상태의 mRNA 수준을 변경하기 위해 도시되었지만, 이들 분자 중 2 인간 임상 반응과 연관된 경우에는 알려지지 않았다. 리튬의 반응 메카니즘을 이해하는 것은 신경 조직에서의 리튬 - 유발 분자 변화를 조사 요구한다. 불행히도, BD 환자의 뇌 생검 전후 리튬 요법 리튬 반응 분자 서명을 식별하기 위해 수득 실용적이지 않다. 사후 뇌 조직은 BD 바이오 마커의 연구를 위해 사용 된, 그러나, 감정,인지와 이용시의 동적 변화와 관련 분자 마커를 평가하기 위해 사용될 수 없다; 소급 확인 리튬 치료 반응의 유효성이 문제가 될 수있다 (4). 림프구 및 기타 혈액 세포가 유용 할 수 있지만, 혈액 세포의 분자 변화는 신경 세포의 변화 3-5 반영되지 않을 수 있습니다. 뇌척수액은 질환 관련 약물 가역 본질적인 변화를 반영 할 수있다 세포 내 분자에 대한 정보를 얻을 불충분 할 수있다.

후각 상피 (OE)가 중추 신경계 (CNS)의 고유 부분이며, 변연 구조 (6)에 발생 학적으로 관련; 그리고 코 조직 검사를 통해 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 그것은 이루어져 신경교 형상 개발 7-9의 다른 단계에서 (즉, sustentacular) 세포, 기저 세포 증식, 후각 수용체 뉴런지지. 따라서, OE는 접근 가능 신경 정신 질환 (7) 환자의 CNS의 역동적 인 변화를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 연구는 그 OCC을 반영 질병 관련 사건을 조사하기위한 대리 조직으로 OE의 유용성을 입증하고 있습니다뇌 신경 세포 8,9에 urring. 예를 들어, 연구는 정신 상태 10-14과 관련된 분자 프로파일을 조사하기 위해 OE를 활용했다. 후각 시스템은 또한 정신 분열증 (15)의 음성 증상과 관련된 냄새 적자 임상 endophenoytpes을 식별하는 데 도움이된다. 또한, 신경 발달 과정은 정신 조건 8,9의 기본 병태 생리를 모델링 할 수있는 유용한 수단을 제공하고, 전 생애에 걸쳐 OE에서 계속합니다.

그러나,이 조직의 사용의 단점은 비 - 신경 세포와 함께 16 후각 생검의 실질적인 오염이다. 예를 들어, 이전의 연구에서 OE 유전자 발현 연구에 사용 된 총 RNA 비 신경 세포 (17)로부터 전체 RNA를 포함 비강 생검 조직에서 추출한 RNA를 함유 하였다. 따라서, 이전의 접근법은 세포의 품질에 의해 제한되어왔다. 이 문제를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 구하는 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)와 비강 조직 검사를 결합하여 풍부한 신경 세포 집단은 18 개발되었습니다.

LCM은 적외선 레이저와 함께 19-21 UV 레이저 절삭을 사용하여 세포의 선택적 분리를 허용하는 기술이다. OE 방식과 결합 LCM함으로써 신경 세포 (18)의 농축을 강화, 비 신경 세포에 의해 OE 상당한 오염을 최소화 할 수 있습니다. 또한, 신경 층함으로써 염색에 대한 필요성을 제거 현미경 점막하 층으로부터 구별 될 수있다. 신경 세포 유형은 또한 관심 7 세포 유형에 의해 발현되는 일차 항체를 사용하여 다른 세포 집단 구별 될 수있다. 따라서,이 절차는 유전자 발현 연구, 면역 및 기타 형태 학적 연구에 사용할 수있는 거의 순수한 신경 세포 집단의 농축을위한 쉬운 방법을 확립한다.

ve_content는 ">이 연구는 질병 상태와 치료 반응과 관련된 후각 신경 세포의 분자 변화를 조사하기 위해 실험 플랫폼을 구축하는 것을 목표로하고있다.이 문제를 해결하기 위해, BD의 DSM-IV 진단 기준을 충족 금연 환자의 작은 세트에 기반 유전 연구에 대한 진단 인터뷰 (DIG) (22)는 두 개의 코 조직 검사를 받아야하는 채용되었다 : 리튬과 두 번째 생검 한 조직 검사 전처리, 경구 리튬 치료 6 주 후에 또한, 자격 BD 환자 수 있어야합니다. 우울증 증상 몽고메리 - ASBERG 평가 척도 (MADRS) (23) 투여 임상의 60에서 ≥10 득점에 따라 (YMRS) 경조증 또는 조증 증상, 젊은 매니아 평가 척도 투여 임상에 56 점 만점 점수 ≥10에 따라 . 24;. MADRS 모두 저울에 대한 임상의 간의 합의에의 YMRS있는 Rater-간 레이터 계수 모두 또는 ≥10는 조직 검사 후 신경 enri 0.96했다>는LCM에 의해 OE에서 CHED. 신경 조직 및 농축로부터 고품질의 RNA 추출을 위해, 추가의 품질 관리 방법에 따라 실시간 RT PCR은 관심 유전자의 사전 및 사후 처리의 발현 수준을 조사하기 위해 실시되었다. 다음의 섹션은이 방법의 유효성 검사에 대한 설명, 프로토콜의 최적화를 강조 표시하고 문제 촬영 프로토콜을 적용 된 전략이 포함되어 있습니다.

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프로토콜

참고 :이 연구의 모든 연구 자원 봉사자는 하워드 대학의 심사위원회 (Institutional Review Board) 및 존스 홉킨스 대학의 승인을 동의 문서를 투여 하였다. 동의 문서에 서명함으로써 동의 만 참가자들은 연구에 등록되었다. 이 분석을위한 연구 기반을 구성 : 20 명 (12 BD 10 컨트롤, 30 % 남성)과 38.2 (14.1) 년의 나이 (SD)를 의미한다.
참고 : 유리 및 플라스틱 표면에서의 RNase 오염을 제거의 RNase 보내 겠 모든 표면을 스프레이.

1. 조직 검사 절차

  1. 연구 참가자의 비강에 국소 리도카인 (xylocaine) 액체 4 %와 oxymetazoline 염산 0.05 % 스프레이와 시간을 마비의 15 분을 할 수 있습니다.
  2. 리도카인과 oxymetazoline의 혼합물에 ½ × 3 인치 수술 cottonoids을 만끽하고 비중격의 우수한 부분을 따라 비강에 삽입하고 15 분 동안 앉아 할 수 있습니다.
  3. 30 ° 강성을 사용하여비강 내시경, 비강의 상부를 찾아 여러 개의 작은 표본을 고려하여 비중격의 우수한 부분에서 최대 물고 코 집게를 사용하여 코 점막을 제거합니다.

조직 블록 2. 제조

  1. 직전 생검 조직이 매체를 동결 표준 크기의 cryomolds를 입력합니다.
  2. 멸균 핀셋을 사용하여, 동결 배지에서 신선한 조직을 탑재하고 드라이 아이스상에서 정지. , 냉동 매체 cryoblock의 나머지 부분을 채우기 드라이 아이스에 cryoblock을 동결하고, -80ºC에서 저장 블록.

3. 냉동 절편

  1. 냉동 절편 직전 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 유리 슬라이드를 준비한다. 5 분의 RNase 보내 겠 솔루션으로 슬라이드를 스프레이. 그런 디 에틸 피로 카보 네트 (DEPC) 물에 슬라이드를 씻어 30 분간 자연 건조를 할 수 있습니다. 30 분 동안 UV 빛 아래 건조 슬라이드를 활성화합니다.
  2. 동결 절단 (Cryosections)는 각각 30 μm의에서 완전히 차단합니다. 건조 i에서 슬라이드를 유지CE 및 섹션은 가능한 한 많은 냉동. 완료시 -80 ºC에서 보관 슬라이드.

4. 레이저 캡처 이외에 Microdissection

  1. 직전 미세 절제에 슬라이드를 탈수하여 시작합니다. 60 % (2 ㎖, 15 초), 80 % (2 ㎖, 15 초), 95 % (3 ㎖, 25 초), 100 : 각 슬라이드에 다음 에탄올 시리즈를 적용 한 후 냉동 슬라이드하자 10 초간 해동하고, % (7 ㎖를, 60 초).
  2. 에 광 활성화 현지화 현미경 (PALM) 현미경을 켜고 설정 다음 조건에 : (82)에 에너지를 설정 10 배 배율의 경우, (74)에 초점을 맞추고 속도 25 - 30 20 배 배율의 경우, (63)에 에너지를 설정, 67에 초점 속도 및 5 - 6. 최적의 절단 결과를 얻기 위해 필요한만큼 조정한다.
  3. 시각적으로 20 배 또는 10 배의 배율을 사용하여 신경 세포를 식별합니다. 염색 과정의 사용없이 현미경 기본 서브 점막 표면 후각 뉴런 얇은 층을 구별. 조밀 한 기둥 모양 (18)로 신경 세포를 관찰합니다.
  4. 4.2 단계에서 상기 한 현미경에서 연필 기능을 사용하여 신경 층을 중심으로 추적. 레이저에서 신경 세포의 연소를 방지하기 위해 약간 떨어져 뉴런에서 추적합니다. 이는 고품질의 RNA를 얻기 위해 필수적이다. 그런 다음 레이저 유도 절단을 시작합니다.
  5. 좋은 팁 미세 절제 집게를 사용하여 절개 섹션을 들고 얼음에 100 μL 용해 버퍼를 포함하는 마이크로 튜브에 조직을 넣어. 하나의 샘플에서 얻은 모든 신경 부분에 대해 반복합니다. 50 분을 초과 할 수 없습니다 샘플 당 총 해부 시간.
  6. 해부가 완료 즉시 소용돌이 샘플 해물과 드라이 아이스 계속되면. 총 RNA 격리를위한 -80ºC에서 보관 샘플.

총 RNA 및 품질 관리 분석 5. 분리

  1. 얼음에 해동 샘플 해물. 볼 (수정없이 업체로의 프로토콜에 따라 DNase의-I의 불 활성화와 RNAqueous 마이크로 키트 총 RNA 분리를 수행합니다 <강한> 그림 1). 용출 총 부피는 약 20 μL이다.
  2. RNA의 농도를 측정하고 Bioanalyzer를 사용하여 RNA 무결성 번호 (RIN)와 RNA의 품질을 평가한다. 도 2의 품질 관리 기준을 만족 샘플 cDNA 합성에 사용될 수있다.

6. cDNA를 합성

  1. 검증 된 상용 키트를 사용하여 cDNA를 합성 (시약의 표 참조). 튜브 당 8 ㎕의 총 부피로 RNA (이용 가능성에 따라)의 RNase없는 물과의 NG 1.0 - 0.1를 조합하여 어닐링 공정을 수행한다. 그런 다음 10 μL의 총 볼륨, 튜브 당 혼합 올리고 D (T) 20 프라이머 1 μL, 10 mM의 dNTP의 1 μl를 추가합니다.
  2. 5 분 65 ° C에서 부드럽게 소용돌이와 원심 분리기 샘플 및 어닐링 샘플. 얼음에 반응이 종료 된 후, 즉시 냉각 샘플.
  3. 표 1의 사양에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 9.5 μ를 추가각 튜브에 L 마스터 믹스 및 상업적으로 제조 된 역전사 효소 (RT)의 0.5 μL. 대신 RT의 관을 제어하는​​ 0.5 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가합니다.
  4. 없이 자전거로, 50 분, 5 분 및 최종 4 ºC 유지를위한 다음 85 ºC 50 ºC에서 처음 배양과 RT 반응을 실행합니다.
  5. 물과 나누어 함께 5 배의 모든 샘플을 희석. -80 ºC에서 보관 샘플.

7. 리얼 타임 PCR - 신경 농축 확인

  1. . 표 2의 사양에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비 같은 GAPDH와 같은 내부 통제를 사용합니다. 신경 농축을 결정하기 위해 undissected 조직에 OMP 식 microdissected 조직에서 후각 마커 단백질 (OMP) 식을 비교.
    참고 : OMP는 후각 신경 세포 마커입니다.
    OMP 서열 포워드, 5'- CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
    , 역 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
    GAPDH 순서 : 앞으로, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
    역, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '.
  2. cDNA를 각 웰 3 μL에 마스터 믹스의 7 μl를 추가하여 PCR 플레이트를 설정합니다.
  3. 300 XG (1,300 RPM)에서 5 분 동안 원심 분리 판. 이러한 SYBR 푸르 qPCR의 상업적인 수퍼 믹스 지정된 기본 열 사이클링 조건을 이용하여 실행을 리얼 타임 PCR 반응.
  4. 데이터를 (사양 그림 2 참조) 분석합니다.

8. 리얼 타임 PCR - 관심의 유전자의 발현

  1. 2 배 이상의 신경 세포의 농축을 보여 샘플을 수행합니다.
  2. 각 프로브 표 3의 사양에 따라 별도의 튜브 (이자 및 VIC 표지 GAPDH의 FAM 표지 프로브) 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다.
  3. cDNA를 각 웰과 2 μL 8 μL 마스터 믹스 PCR 플레이트를 설정합니다.
  4. 300 XG (1,300 RPM)에서 5 분 동안 접시를 원심 분리기. DEF를 사용하여 실시간-PCR 반응을 실행제조자의 유전자 발현 마스터 믹스 프로토콜에 따라 AULT 열 사이클링 조건. 식의 결과를 (사양 그림 2 참조) 분석합니다.

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결과

분자 서명의 연구에서 프로토콜 및 문제 해결 전략이 성공적으로 최적화되었다. RNA 샘플을위한 품질 및 신경 농축 기준 하류 리얼 타임 PCR 분석에 사용되는 표준화 하였다. RIN 및 RNA의 농도는 검출 된 발현 수준을 교란 요인으로 조사 하였다. 1에서부터 RINs 여러 샘플의 분석을 바탕으로 - (10)는, 상술의 ~ 3.0의 최소 RIN은 본 연구에서 분석 하류에 충분하다고 판단되었다. 결과적으로, cDNA의 합성을위한 RNA 량이 1.0 NG로 표준화 하였다. 따라서, 상기 RIN 고품질 시료 1.0 ~ 3.0 및 NG의 RNA 양의 cDNA로 변환시켰다. 0.1 샘플 - 적절한 샘플 크기가 구하기 어려운 경우 RNA 1.0 NG가 사용될 수있다.

신경 엔리치 실시간-PCR 분석을 사용하여 확인 하였다. microdissected 샘플 OMP 유전자 발현 수준은 undissected 시료와 비교 하​​였다신경 층이 농축 된 경우의 확인합니다. 비 해부 조직에 비해 ...

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토론

코 조직 검사 및 LCM을 결합하여 풍부한 후각 신경 층을 얻기위한 새로운 플랫폼을 제시하고 본 연구에서 검증되었습니다. 이 기술은 광범위하게 영향을 미칠 수 있습니다. 이 분야에서 폭 넓은 영향을, 치료 반응을위한 것들을 포함 바이오 마커 연구, 및 다른 조건에 대한 신경 정신병 약물 발견 노력으로 적용될 수있다.

다운 스트림 응용 프로그램에 대한 의무 고품질의 신경 세포를 얻으려면 몇 가지 중요하고 문제 해결 단계를주의해야합니다. 적절한 샘플 크기를 갖도록 환자 당 후각 조직의 6 개 - 우선,도 4를 얻었다. 샘플 RNA 분해에 민감하기 때문에 둘째, 적절한 온도에서 조직을 유지 된 RNase 무료 장비와 표면, 사용 장갑 작업, 샘플을 통해 직접 흡입하지 않도록 할 것. RNA 품질이 여전히 낮은 경우, 50 분 이내에 완료 미세 절제를 고려하고 즉시 절개 또는 vort 후 RNA 추출을 수행전 시료는 즉시 -80 ° C에서 저장 될 때까지 드라이 아이스 계속. RNA...

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공개 사항

저자는 상업적 이익과 재정적 관계를보고하지 않습니다.

감사의 글

이 작업은 USPHS 보조금 MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), AND H-096208 (K.I.), DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. 및 K.I.)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 및 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금(AS 및 KI).

우리는 생검 과정을 조정하기 위한 Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema 및 Mark Christie의 노력과 기여에 진심으로 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold MoldsSakura Finetek4557
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D)Carl Zeiss Microscopy415190-9041-000
Rnase ZapAmbionAM9780
DEPC 처리 수질 생물학351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM 시리즈 MicroLaser 시스템Carl Zeiss 현미경모델: Axiovert 200M
소프트웨어: Robo v3.2
No. 5 Dumont Microdissction ForcepsRobozRS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro KitAmbionAM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis KitInvitrogen18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMixInvitrogen11760-500
Taqman qPCR
TaqMan 발현 분석 프로브Applied Biosystems다양한
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스Applied Biosystems4369016

참고문헌

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